Здесь мы описываем два протокола: во-первых, для размножения, извлечения, очистки и количественной оценки большого количества частиц вируса медоносной пчелы без оболочки, включая метод удаления куколок медоносной пчелы, а во-вторых, для проверки последствий вирусной инфекции с использованием высоковоспроизводимого биоанализа в клетке с высокой пропускной способностью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Приготовление обогащенного вирусом инокулята при оральной инфекции медоносных пчел (Apis mellifera)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Медоносные пчелы имеют большое экологическое и сельскохозяйственное значение во всем мире, но также подвергаются различным нагрузкам, которые негативно влияют на здоровье пчел, включая воздействие вирусных патогенов. Такие вирусы могут вызывать широкий спектр разрушительных последствий и часто могут быть сложными для изучения из-за множества факторов, которые затрудняют отделение эффектов экспериментального лечения от ранее существовавшей фоновой инфекции. Здесь мы представляем метод массового производства больших количеств вирусных частиц вместе с высокопроизводительным биоанализом для проверки вирусной инфекции и эффектов. В связи с нынешним отсутствием непрерывной, свободной от вирусов клеточной линии медоносных пчел вирусные частицы усиливаются in vivo с использованием куколок медоносных пчел, которые извлекаются из улья в больших объемах с использованием минимально стрессовой методологии. Эти вирусные частицы затем могут быть использованы в биоанализах в клетке медоносных пчел для проверки жизнеспособности инокулы, а также различных других динамик вирусной инфекции, включая взаимодействие с питанием, пестицидами и другими патогенами. Основным преимуществом использования таких частиц является то, что это значительно снижает шансы на введение неизвестных переменных в последующих экспериментах по сравнению с текущими альтернативами, такими как заражение через инфицированную пчелиную гемолимфу или гомогенат, хотя при поиске пчел все же следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму фоновое заражение вирусом. Клеточные анализы не заменяют крупномасштабные, реалистичные полевые эксперименты, проверяющие эффекты вирусной инфекции на уровне колонии, а вместо этого функционируют как метод установления базовых вирусных реакций, которые в сочетании с получистыми вирусными частицами могут служить важными инструментами для изучения различных измерений физиологических взаимодействий медоносных пчел и вирусов.
Введение
Медоносные пчелы (Apis mellifera) играют решающую роль в современном глобальном сельскохозяйственном ландшафте, но в настоящее время страдают от комбинации биотических и абиотических стрессоров, включая воздействие пестицидов, плохой корм, паразитов и патогенов 1,2. Одним из наиболее важных патогенов, вызывающих озабоченность, являются вирусы, многие из которых переносятся другим из основных стрессоров медоносных пчел, паразитическим клещом Варроа (Деструктор Варроа). Эти вирусы могут вызывать множество негативных эффектов у медоносных пчел, включая снижение выживаемости расплода, дефекты раз....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Массовое извлечение пчел Вариант 1: самоудаление личинок
- Поместите матку медоносных пчел в пустую, вытянутую рамку Лангстрота и верните ее в свою колонию. Дайте матке отложить яйца на этом каркасе в течение 24 ч.
- Проверьте рамку через 24 часа, чтобы убедиться, что большинство гребенчатых клеток содержат недавно отложенные яйца. В зависимости от матки и колонии, яйца иногда откладываются не очень хорошо в первые 24 ч. Если это произойдет, подождите еще 24 часа и отрегулируйте время по мере необходимости.
- После 24-часового периода яйцекладки отпустите матку. Четко отметьте рамку и верните ее в колонию.
- Ровно через 192....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное следование протоколам (Рисунки 1) для инъекций куколок и вирусной экстракции должно производить большое количество вирусных частиц. Тем не менее, отбор проб и инъекция куколок, полученных из различных колоний в несколько временных точек, максимизируют шансы на приобретение целевого вируса с низким уровнем загрязнения. Динамика, с помощью которой вирусы реплицируются и взаимодействуют друг с другом в медоносной пчеле, не совсем понятна; в сочетании с вероятностью ранее существовавшей инфекции нет.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы изложили методы, детализирующие каждый этап процесса амплификации вируса и подготовки запасов инокулята, включая сбор личинок и размножение вируса, экстракцию и концентрацию, а также вирусную обработку в виде экспериментов по кормлению в клетке. Эти методы позволяют производить получистые вирусные частицы (рисунок 4), эффективность которых может быть последовательно количественно оценена путем тестирования смертности от доза-реакция для вирусов, смертельных для взрослых (
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Джулию Файн за ее идеи и обсуждение в процессе создания протокола, а также д-ра Кассондру Вернье за ее полезные комментарии на протяжении всего редактирования. Эти материалы внесли свой вклад в проекты, которые были частично поддержаны Фондом исследований в области продовольствия и сельского хозяйства в рамках гранта ID 549025.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10% раствор | |||
| 24:1 хлороформ:изоамиловый спирт | SigmaAldrich | C0549 | |
| 70% раствор | |||
| Клетки для биоанализа | В зависимости от экспериментальной установки | ||
| Combitips Advanced 0,1 мл | Eppendorf | 30089405 | Опционально (если нет инжектора appartus) |
| Контейнеры для самостоятельного удаления | Должны иметь размеры примерно 19" x 9-1/8" (размеры глубокой рамы Лангстрота) | ||
| Щипцы | Тупые, мягкие щипцы для отделения личинок; тупые, жесткие щипцы для иссечения куколки | ||
| Вытяжной шкаф | |||
| Инкубатор | Способен выдерживать 34 º C и 50% относительной влажности | ||
| Kimwipes Fisher | Scientific | 06-666 | Подойдет любая абсорбирующая салфетка |
| Лодки среднего веса | Служат лотками для инокулята | ||
| Microcon-100kDa с мембраной | Biomax MilliporeSigma | MPE100025 | |
| NaCl | |||
| Нитриловые перчатки | |||
| Фосфат буферизованный физиологический раствор (PBS) | SigmaAldrich | P5119 | |
| Полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ) | SigmaAldrich | 1546605 | |
| Настольная центрифуга | с охлаждением Рассчитана на 15 000 x g | ||
| Охлаждаемая центрифуга | Способна на 21 000 x g | ||
| Репитер M4 Multipipette | Eppendorf | 4982000322 | Опционально (если нет инжектора appartus Доступно) |
| РНКаза Away | ThermoFisher | 7000TS1 | |
| РНКаза вода без фазы | SigmaAldrich | W4502 | |
| Сахароза | |||
| TES | SigmaAldrich | T1375 |
Ссылки
- vanEngelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. Journal of Invertebrate Pathology. 103, Suppl. 1 80-95 (2010).
- Goulson, D., Nicholls, E., Botías, C., Rotheray, E. L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
