Атомно-силовая микроскопия в сочетании с инфракрасной спектроскопией в качестве инструмента для исследования химии одиночных бактерий

Бактерии представляют собой одноклеточные прокариотические организмы, встречающиеся в различных формах и размерах, обычно в диапазоне от нескольких сотен нанометров до микрометров. Они существуют в различных местах обитания и необходимы для существования жизни. В организме человека большинство бактерий, присутствующих в кишечнике, безвредны, и многие из них на самом деле полезны¹. Однако некоторые виды бактерий являются патогенными и вызывают целый ряд инфекционных заболеваний. Бактериальные инфекции могут привести к развитию сепсиса и септического шока: опасного для жизни состояния, возникающего в результате реакции организма на инфекцию^2. Сепсис является глобальной серьезной угрозой для здоровья, с высокой распространенностью во всем мире и тяжелыми показателями смертности. Только в 2017 году, по оценкам, во всем мире было зарегистрировано 50 миллионов случаев сепсиса, причем 11 миллионов из них привели к смерти (примерно 20%)^2. Кроме того, было показано, что снижение шансов на выживание пациента из-за задержки терапии происходит ежечасно^3,4.

Бактериальные инфекции лечатся антибиотиками. Тяжесть потенциальных последствий бактериальных инфекций кровотока (BSI) вместе с явным значением быстрого начала антимикробной терапии обусловляют необходимость немедленного введения антибиотиков. Однако, поскольку современные диагностические подходы, используемые в клинической практике (например, культивирование крови), требуют относительно длительного времени, введение антибиотиков часто происходит до положительного диагноза BSI^5. Этот фактор приводит к широкому чрезмерному использованию антибиотиков, что вместе с чрезмерным использованием антибиотиков в других секторах, таких как сельское хозяйство, создает серьезное эволюционное давление на развитие устойчивости к противомикробным препаратам (УВМ)^6,7. УОМ в настоящее время является одной из наиболее актуальных глобальных проблем здравоохранения^7,8 и, по прогнозам, к 2050 году станет основной причиной смерти^9. Развитие резистентности вместе с распространением штаммов УВМ происходит тревожными темпами^7,8,9 и превышает, на сегодняшний день, темпы открытия новых^{антибиотиков 10.} Новые устойчивые фенотипы постоянно появляются во всем мире, в то время как
исследования, направленные на понимание изменений, связанных с УУО, часто медленны и ограничены имеющимися подходами^11. Кроме того, широко используемые методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование целых генов (WGS), фокусируются только на генотипических изменениях. Этого недостаточно для выявления механизмов резистентности^11,что вызывает острую потребность в исследовательском инструменте, позволяющем понять химический состав бактерий.

Инфракрасная спектроскопия (ИК) обеспечивает молекулярную характеристику образца и, таким образом, является перспективным кандидатом для фенотипического бактериального исследования. С момента его раннего применения^12,большая величина примеров его использования была продемонстрирована в литературе^13,14. К ним относятся фенотипическая идентификация бактерий на уровне рода^15,вида¹⁶и^{штамма 17,18.} Однако пространственное разрешение обычного ИК ограничено несколькими микронами из-за дифракции длины волны, пространственного предела разрешения^19. Поскольку размер большинства бактерий лежит ниже этого предела (например, ось зернистого стафилококка ≈ 400 нм в диаметре), обычный ИК не применим для прощупления на одноклеточном или внутриклеточном уровне.

Ограничение пространственного разрешения было недавно преодолено путем объединения ИК-спектроскопии с атомно-силовой микроскопией (AFM-IR). В этом случае ИК-поглощение обнаруживается косвенно, через тепловое расширение материала^19,20,21,22. Короче говоря, поглощение ИК-излучения приводит к локальному повышению температуры. Это может быть измерено либо непосредственно^23, либо путем измерения колебаний консольного зонда AFM, возникающих в результате силового импульса, создаваемого ИК-поглощением^20,21. Комбинаторная методика AFM-IR позволяет достичь пространственного разрешения, приближающегося к 20 нм, предоставляя одновременную информацию о локальных физических свойствах образца (AFM) и его химическом составе (AFM-IR). Возможно сбор как одиночных спектров из выбранных точек, так и отображение интенсивности выбранных значений волнового числа в пределах выбранной области.

Рассматривая достижимое пространственное разрешение AFM-IR, очевидно, что методика открывает возможность химического/фенотипического исследования одиночных бактерий клеток и их внутриклеточного состава^24. До сих пор несколько примеров применения AFM-IR для одиночных бактерий были продемонстрированы в литературе^{19,20,21,22,25,26,27,28.} Они включают в себя одиночный спектральный анализ^19,21,22 и картирование на субклеточном уровне^{19,22,25,26,27,28.} Например, описана способность обнаруживать внутриклеточные липидные везикулы²⁷ и вирусы²⁸ в пределах одной бактерии. Эти результаты демонстрируют полезность AFM-IR для наноразмерных исследований отдельных бактерий и клинически значимых патогенов^19.

Таким образом, мы представляем метод пробоподготовки и сбора данных AFM-IR многослойных, однослойных и одноклеточных бактериальных образцов. Протокол, описанный в настоящем описании, применялся для изучения различных видов бактерий²² и изменений их химического состава. В частности, развитие in vivo резистентности к ванкомицину и невосприимливости к даптомицину исследовали в клинических парах S. aureus^19. Как прерывистая резистентность к ванкомицину, так и непредприязанность к даптомицину у S. aureus (VISA и DpR) появились относительно недавно, после более широкого использования и введения этих антибиотиков в клиники, что представляет собой значительную медицинскую проблему. Кроме того, в частности, механизм невосприимчивости даптомицина по-прежнему остается неуловимым, препятствуя разработке альтернативного препарата^19,29. Представленный протокол фокусируется на предоставлении надежных AFM-IR спектров отдельных бактерий, которые могут быть дополнительно проанализированы с использованием различных хемометрических подходов, в соответствии с экспериментальными целями. Он дополнительно включает в себя картографический подход, который применим для внутриклеточных исследований.

Вся работа, проводимая с патогенными бактериями, должна проводиться с соответствующими мерами безопасности. К ним относятся работа в лаборатории с адекватным уровнем биобезопасности и в кабине биобезопасности (PC2), а также тщательная дезактивация рабочей зоны соответствующим дезинфицирующим средством, например, 80% раствором этанола. Соответствующие СИЗ необходимо носить постоянно.

1. Приготовление растворителей и материалов

1. Растворители: Используйте сверхчистую воду в качестве растворителя. Используйте очищенную воду, автоклавную перед экспериментом, чтобы избежать любого потенциального перекрестного загрязнения.
2. Подложка: Используйте любую из этих подложек для AFM-IR, например, ZnSe, CaF_2,BaF₂и т. Д. Поскольку AFM-IR является, в принципе, неразрушающим методом, можно применить множество других исследовательских инструментов к той же выборке после анализа AFM-IR. Например, корреляция результатов с рамановской спектроскопией может быть выполнена, если используются рамановские слайды CaF₂ или BaF_2.
3. Используйте стеклянные флаконы вместо пластиковых трубок, так как пластик может загрязнить образец.

2. Пробоподготовка для AFM-IR

1. Рост/инкубация образца
   1. Выращивайте бактерии в жидких средах или на твердых пластинах. Выберите тип среды, условия роста (например, температура, наличие кислорода) и время роста в соответствии с конкретными требованиями исследуемого вида бактерий. Например, для S. aureus Heart Infusion (HI) могут использоваться агаровые пластины, с ростом в течение 16 ч при 37 °C в аэробных условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов рост/инкубация должна давать достаточное количество бактерий, которые позволили бы получить микро-гранулу образца. Конкретное количество колониеобразующих единиц или бактериальных клеток зависит от типа и размера бактерии.
2. Осаждение проб
   1. Используя стерильную петлю, аккуратно соберите бактерии из колоний на агаре и перенесите их в стеклянную трубку. Собирайте бактерии только с вершины колоний. При сборе образцов из жидкой культуры с помощью пипетки переложите примерно 1 мл бактериальной суспензии в стеклянную трубку. Объем может быть изменен в зависимости от бактериальной нагрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно стараться не собирать (или максимально минимизировать сбор) любую среду из-под колонии. Последующие этапы подготовки образцов направлены на удаление любых потенциальных остатков среды. Минимизация потенциального остаточного среды с самого начала позволяет спектрально получать данные от очищенных бактериальных клеток. Этапы 2.2.2 и 2.2.3 применяются к образцам, полученным из пластин с агаром. Для образцов, полученных из жидких сред, перейдите к этапу 2.2.4.
   2. Добавьте в трубку 1 мл сверхчистой воды. Вихрь до тех пор, пока собранные бактериальные гранулы больше не будут видны на дне трубки (обычно 1-2 мин).
   3. Оцените грубую мутность раствора, используя, например, стандарты Макфарланда путем визуального сравнения³⁰ между приготовленным раствором и стандартами Макфарланда. Если мутность бактериальной суспензии кажется очень низкой, добавьте больше бактерий из пластины, используя стерильную петлю и снова вихрь. Повторяют до тех пор, пока грубая мутность раствора не будет сопоставима со стандартами Макфарланда 0,5 и 1. Это, как правило, дает хорошее количество бактериальных гранул.
   4. Центрифугируют бактериальную суспензию по 3 000 х г в течение 5 мин до получения гранулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры центрифугирования могут быть модифицированы для получения бактериальных гранул. Следует соблюдать осторожность при увеличении g-силы, чтобы не вызвать поломку бактерий (особенно в случае грамотрицательных бактерий).
   5. Используя пипетку, аккуратно удалите супернатант сверху гранулы. Добавьте 1 мл сверхчистой воды в трубку и вихрь, чтобы повторно приостановить гранулу. Впоследствии центрифугируют образец, как это было сделано на этапе 2.2.4.
   6. Повторите процедуру стирки (этапы 2.2.2 и 2.2.4) не менее трех раз. В случае сбора исходного образца из жидкой среды повторите процедуру не менее четырех раз (удаление среды с последующей тремя промывами).
   7. После окончательной стирки удалите супернатант, добавьте сверхчистую воду и вихрь не менее 2 мин. Впоследствии нанесите 5 мкл образца на подложку (например, рамановский класс CaF_2).
   8. Если желаемая толщина образца представляет собой многослойность бактерий, оставьте образец на воздухе-сухости.
   9. Если желаемая толщина является однослойной или отдельной бактерией, сразу после осаждения образца (этап 2.2.7) добавляют от 20 до 100 мкл сверхчистой воды и аккуратно смешивают с наконечником пипетки. Оставьте на воздухе- высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точный объем воды может варьироваться между экспериментами, поскольку он зависит от многих факторов (например, размера организма, плотности гранул и т. Д.) И, следовательно, лучше всего определяется эмпирически. Подготовка серии образцов с различными объемами сверхчистой воды позволяет выбрать образец с желаемой толщиной/плотностью бактерий. Толщина/плотность бактерий может быть легко визуализирована с помощью AFM на последующих этапах. Примеры изображений AFM из однослойных и одноэлечеек показаны на рисунке 1A–H.
   10. Установите подложку на металлический диск AFM с помощью двусторонней клейкой ленты.

3. Подготовка приборов

ПРИМЕЧАНИЕ: Инструментальные процедуры, описанные здесь, предназначены для инструмента, перечисленного в Таблице материалов. Детализация инструментальной процедуры может незначительно отличаться от описанной здесь при использовании более новой модели прибора AFM-IR.

1. Включите и инициализируйте инструмент, нажав кнопку Инициализировать. Убедитесь, что лазерный затвор находится в открытом положении для лазерного теста.
2. Если настроена система продувки, продувочи прибор с N_2, включив поток N_2. Отрегулируйте азотную продувку для достижения стабильного уровня влажности (например, 20%). Убедитесь, что влажность не колеблется во время измерений и между сбором фоновых и выборочных данных. Рекомендуется дать приблизительно 20 минут для стабилизации уровня влажности.
3. Загрузите образец в камеру для отбора проб, нажав кнопку Load. Загрузка образцов осуществляется с помощью мастера программного обеспечения. Во время работы мастера программного обеспечения сначала сосредоточьтесь на наконечнике, используя стрелки, чтобы переместить ступень микроскопа в Z-направлении и нажмите далее. Во-вторых, отрегулируйте точку сбора данных, используя стрелки, направляющие движение в плоскости, и выровняйте лазер AFM и детектор AFM с помощью ручек в верхней части головки AFM. Впоследствии сосредоточьтесь на поверхности образца, переместив ступень микроскопа в Z-направлении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные иллюстрации каждого этапа загрузки образца приведены в руководстве по программному обеспечению^31. Фокусировка на образце должна проводиться с осторожностью. При приближении к поверхности образца в Z-направлении используйте медленную скорость двигателя.
4. Подойдите к образцу без вовлечения, нажав на кнопку Подход.

4. Сбор данных

1. Фон
   1. Перед сбором данных соберите фон. Для сбора фона убедитесь, что лазерный затвор находится в открытом положении. Выберите спектральный диапазон и разрешение (в зависимости от цели анализа), а также количество сканирований и количество сосреднических значений фона. Обычно рекомендуется, чтобы они были высокими (например, 1024 сканирования и 3 сосредновых показателя).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, спектральное разрешение 4 см^-1 или 8 см^-1 и спектральные диапазоны 3 200 см^-1-2 800 см^-1 и 1 800 см^-1-900 см^-1.
   2. После получения фона сохраните фоновый файл. Файл не сохраняется автоматически. Измените положение лазерного затвора на Закрыть.
2. Образец – одиночные спектры
   1. Нажмите кнопку Engage ( Вовлечь, чтобы принять участие в выборке. Система начнет приближаться к поверхности образца, пока не будет обнаружен прямой контакт.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заданное значение, используемое в этой работе, варьировалось в диапазоне от 0,15 до 2 В, а коэффициент усиления обратной связи (I Gain и P Gain) обычно устанавливался на 3 и 10. Контактные датчики NIR2 обычно используются с системой nanoIR2 (модель: PR-EX-nIR2-10, резонансная частота (кГц): 13 +/−4 кГц, постоянная пружины (Н/м): 0,07−0,4^Нм-1).
   2. Соберите изображение AFM для визуализации поверхности. В первом случае сканируйте большую площадь (например, 50 x 50 мкм) с более низким пространственным разрешением (например, 200 x 200 точек)(рисунок 1I).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные AFM-IR всегда собираются в контактном режиме, однако данные AFM могут быть собраны в режиме контакта или касания.
   3. На изображении высоты/отклонения AFM выберите конкретную интересуемую область и повторно изобразите ее с более высоким пространственным разрешением(рисунок 1J–K). Убедитесь, что скорость сбора данных соответствует скорости с медленным движением наконечника (например, Scan Rate 0,2–0,4 Гц).
   4. Выберите место измерения (например, одну бактерию) и переместите наконечник в точку.
   5. Выровняете ИК-лазер. Для этого используйте волновое число, при котором образец будет поглощаться. Для биологических материалов это может быть, например, амид I (1655 см^-1). Убедитесь, что фильтр Band Pass Filter выключен, и нажмите «Запустить ИК». Правый график в наноИР-измерителе (БПФ отклонения, отображаемый как амплитуда против частоты) должен показывать по крайней мере один четкий пик, а левый график (отклонение против времени) должен иметь периодическую форму сигнала. Если это не так, приступайте к оптимизации ИК-пятен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Даже если быстрое преобразование Фурье (FFT) и отклонение показывают ожидаемый профиль, рекомендуется провести оптимизацию ИК-пятен по крайней мере для нескольких волновых номеров, где ожидаются полосы.
   6. Оптимизируйте горячие точки для сбора ИК-данных, используя выбранные значения волнового номера. Может быть полезно использовать обычный ИК-спектр бактерий (например, спектр ATR бактериальных гранул) для определения положений полос и использования их для оптимизации горячих точек. Выберите различные значения волнового числа (например, 8–10) из различных спектральных областей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если обычный ИК-спектр интересующих бактерий не может быть собран до сбора данных AFM-IR, бактериальные спектры, доступные в литературе, могут быть использованы в качестве приблизительного руководства. Результатом оптимизации ИК-пятна является изображение, которое представляет карту сигнала величины БПФ в каждом месте x и y. Местоположение с наибольшим сигналом выбирается автоматически. Примеры таких изображений приведены в руководстве по программному обеспечению^31.
   7. После оптимизации ИК-пятен для выбранных значений волнового числа определите параметры сбора спектральных данных: спектральную область, спектральное разрешение, количество сканирований, а также приложенную мощность и введите их в соответствующие окна в программном обеспечении. Спектральное разрешение должно соответствовать разрешению фона, а спектральная область должна находиться в пределах спектральной области, для которой был собран фон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий начальный набор параметров может быть: спектральный диапазон: 3200 см^-1–2800^см-1 и 1800 см^-1–900 см^-1,спектральное разрешение: 4 см^-1 или 8 см^-1,количество сканирований: 512–2048.
   8. При необходимости отрегулируйте мощность лазера в зависимости от сигнала. В целом, значения между 8%-10% мощности лазера должны быть достаточными для хорошего качества сигнала. Более высокие значения можно использовать с осторожностью, так как они могут привести к повреждению образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процент мощности лазера может варьироваться в зависимости от типа ИК-лазера. Процентные значения, приведенные здесь, относятся к лазеру OPO.
   9. Нажмите «Получить», чтобы собрать спектр AFM-IR.
   10. Повторно соберите данные AFM из той же области после сбора спектра AFM-IR. Это настоятельно рекомендуется, так как это выявит любой потенциальный дрейф и/или разрушительное влияние на образец.
   11. Если спектр AFM-IR является удовлетворительным и не наблюдается разрушительного воздействия на образец, приступайте к сбору данных. При необходимости определите посередку точек для сбора данных с помощью параметра «Массив» и собранного изображения высоты или отклонения AFM. Эта опция позволяет последовательно собирать спектры из каждой точки с теми же спектральными параметрами, которые определены для одного спектра.
   12. Если изображение АСМ, собранное после сбора спектра AFM-IR, выявляет разрушительное воздействие на образец (обычно сгоревшего пятна), уменьшите мощность; выберите другое место и повторите шаги 4.3.8–4.3.11.
   13. Если сигнал в спектре AFM-IR неудовлетворительный, проверьте правильность оптимизации ИК-пятен (шаг 4.3.6). Если это так, немного увеличьте мощность лазера и повторите шаги 4.3.7–4.3.11. Это может повторяться до тех пор, пока не будет достигнут удовлетворительный сигнал.
3. Образец – подход к визуализации
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется записать один спектр AFM-IR бактерии перед сбором изображения распределения интенсивности для выбранного значения волнового числа.
   1. Запишите AFM-изображение выбранной области выборки. Для этого сначала соберите AFM-изображение большей площади с более низким пространственным разрешением (например, 50 x 50 мкм, 200 x 200 точек), затем выберите интересующая область и соберите изображение AFM с увеличенным пространственным разрешением (как показано на рисунке 1I–K).
   2. Выберите значения волнового числа для afM-IR-визуализации.
   3. Убедитесь, что ИК-пятно лазера оптимизировано для выбранных значений волнового числа (шаг 4.3.6). Если ИК-пятно не оптимизировано для некоторых волновых номеров (нет четкого максимума), оптимизируйте его для них.
   4. Определите параметры изображенной области: ширину и высоту, количество точек данных в направлении X и Y.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если применяется последовательный выбор пятен из предыдущих изображений AFM (как показано на рисунке 1I–K),поля ширины и высоты будут автоматически заполнены при разметке области.
   5. Определите параметры получения спектрального сигнала: длину волны, количество сканирований и мощность лазера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество сканирований должно быть в пределах разумного. 64 или 32 сканирования обычно позволяют обеспечить достаточное количество сигнала.
   6. Определите параметры движения наконечника AFM, нажав на кнопку Scan Rate. Чем выше количество сканирований на предыдущем шаге и количество точек данных в направлении X, тем медленнее должны быть движения наконечника. Отсутствие регулировки между этими параметрами приведет к слишком быстрому движению наконечника, препятствуя фактическому получению определенного количества сканирований из каждой точки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для соответствующего сбора ИК-сигнала с 64 со-сложениями и 200 точками установите скорость сканирования на уровне 0,07 кГц.
   7. Убедитесь, что установлен флажок Включить ИК-образ.
   8. Начните визуализацию. AFM-IR интенсивности сигнала при выбранном волновом числе будет собираться одновременно с данными AFM из этой области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании лазера OPO можно дополнительно собирать одновременно контактно резонансное пиковое частотное изображение. Это может быть использовано для получения информации об относительной жесткости образца в разных местах.
   9. Используйте окно «Последовательность захвата», чтобы задать последовательную коллекцию данных AFM-IR из одной и той же области с теми же параметрами, но для разных значений волнового числа. Для этого откройте окно Capture Sequence (Последовательность захвата), введите каждый номер волны и определите приложенную мощность лазера (для каждого волнового числа).
   10. Экспортировать собранные данные (AFM и AFM-IR, одиночные спектры и изображения) в различные форматы и анализировать их с использованием методов, адекватных конкретным целям исследования.

Описанный протокол позволяет получить ряд типов клеточных распределений бактерий на субстрате в зависимости от начальной концентрации образца и количества добавленной воды. На фиг.1 показаны примеры изображений ОВМ (высота и отклонение), записанных с монослоев и одноклеточных образцов, полученных с использованием описанного протокола от грамположительных(S. aureus)и грамотрицательных(Escherichia coli)бактерий.

Протокол, описанный здесь, может быть использован для AFM-IR визуализации внутри- и внеклеточных структур отдельных бактерий. Пример этого применения показан на рисунке 2,который демонстрирует результаты мониторинга пространственно локализованных химических изменений, происходящих при делении клетки S. aureus. Хотя воздушная сушка обычно рассматривается как подход фиксации для бактериального препарата, бактерии по своей природе демонстрируют очень высокую устойчивость к внешним факторам, таким как температура, и, как сообщается, выживают при обезвоживание32. Результаты, представленные здесь, были получены из высушенного на воздухе образца. Образование перегородки, происходящее до деления клеток, наблюдали и контролировали с помощью визуализации AFM(рисунок 2A–D)путем последовательного сбора 12 изображений одной и той же области (сбор одного изображения ≈ 20 мин). На рисунке 2A–D показаны 4 выбранных изображения AFM, время между сбором каждого изображения составляет примерно 40 минут. Сформированная структура (перегородка) достигает высоты 45 нм. Сформированная перегородка хорошо видна на изображениях высоты и отклонения AFM(рисунок 2E–F). Спектры AFM-IR, записанные из области ячейки и перегородки(рисунок 2G,точки происхождения, отмеченные на рисунке 2F),были нормализованы до амидной I полосы перед сравнением, чтобы минимизировать влияние изменяющейся толщины образца между точками сбора данных. Спектр AFM-IR перегородки характеризуется более высокой относительной интенсивностью полос при 1240 и 1090см-1 по сравнению с спектром AFM-IR, собранным из области клеток. Они относятся к углеводным и фосфодиэстерным группам компонентов клеточной стенки (включая, например, пептидогликан и тейхоновую кислоту)22.

Описанный протокол также может быть использован для сравнения одного спектра между несколькими различными образцами. Пример этого приложения вместе с результатами показан на рисунках 3 и 4. Целью исследования является определение химических изменений, происходящих в результате развития in vivo прерывистой резистентности ванкомицина у S. aureus (VISA). Для этой цели клинические пары образцов были собраны у пациентов, причем родительский штамм был выделен при поступлении в больницу и до антибиотикотерапии (ванкомицин восприимчивый S. aureus,VSSA), а дочерний штамм был выделен у того же пациента после приема антибиотиков и клинической недостаточности. Образцы дополнительно выращивали на агартовой среде и готовили в соответствии с протоколом(рисунок 3А–В). Спектры AFM-IR были собраны из нескольких отдельных бактерий (и нескольких образцов) для VSSA и VISA и впоследствии проанализированы с использованием нескольких хемометрических подходов(рисунок 3C).

Морфологических различий между ячейками VSSA и VISA не наблюдалось(рисунок 4A–C). Однако спектры AFM-IR(Рисунок 4D,F)и их вторые производные(Рисунок 4E,G)продемонстрировали четкое различие в химическом составе между резистентными и восприимчивыми штаммами. Относительная интенсивность полос, связанных с углеводными и фосфодиэстерными группами из компонентов клеточной стенки (в частности, полосы на 1088см-1),явно увеличивалась у резистентного штамма, по сравнению с восприимчивым аналогом. Следует отметить тот факт, что все перекодированные спектры (VISA: 81, VSSA: 88) показывают небольшое стандартное отклонение. Это демонстрирует хорошую воспроизводимость данных, записанных из различных образцов, полученных из одного и того же штамма, поскольку не было возможности различить спектры, записанные из разных образцов одного и того же штамма. Наблюдаемые различия указывали на увеличение толщины клеточной стенки у резистентных штаммов, по сравнению с восприимчивым аналогом, что остается в согласии с другими литературными отчетами33,34.

Рисунок 1: Репрезентативные изображения AFM различных бактериальных образцов для измерений AFM-IR. В зависимости от разведения на субстрате протокол позволяет получать многослойные и монослойные бактерии, а также одноклеточные образцы. Репрезентативные изображения AFM: (A–D)монослойного и(E–H)одноклеточного образца для(A,B,E,F)грамположительных(S. aureus)и(C,D,G,H)грамотрицательных(E. coli)бактерий. (A, C, E, G) демонстрируют изображения высоты и (B, D, F , H) показывают соответствующие изображения отклонения. Размер изображений областей: (A-D, G, H) 20 x 20 мкм, (E,F) 50 x 50 мкм. (I–K) последовательный выбор области для AFM-IR картирования. Это достигается с помощью АСМ-визуализации с возрастающим пространственным разрешением в примере одной клетки S. aureus. Каждое изображение собирается путем выборки 200 х 200 точек, с увеличением пространственного разрешения за счет уменьшения размера изображения области. Размер изображений областей: (I) 40 x 40 мкм, (J) 20 x 20 мкм и (K) 2,24 x 2,24 мкм. Черный квадрат в (I) обозначает область, изображенную в (J). Черный квадрат в (J) обозначает область, изображенную в (K). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Мониторинг деления клеток S. aureus с помощью AFM-IR. (A–D)AFM-изображения клетки S. aureus, показывающие образование перегородки, предшествующей делению клеток. Размер изображения области: 2 x 2 мкм. Изображения были отобраны из более крупной серии (12 изображений, записанных каждые 20 минут) и представляют собой данные, записанные каждые 40 мин.(E–F)AFM высоты и отклонения изображения, записанного в конце формирования клеточной перегородки с отмеченными точками сбора спектров AFM-IR. Размер изображения области 1,17 x 1,15 мкм. Высота вновь образованной конструкции составляет 45 нм. (G)СПЕКТРЫ AFM-IR регистрируются из площади ячейки (черный) и области перегородки (красный) (отмечены в(F)),в диапазоне 1400–900см-1. Оба спектра были нормализованы до амидной I полосы и демонстрируют увеличение относительной интенсивности компонентов клеточной стенки из перегородки. Эта цифра была изменена с K. Kochan et al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Обзор экспериментального проекта исследования устойчивости к противомикробным препаратам AFM-IR. (A) Происхождение образца и начальная подготовка: восприимчивый родительский штамм был собран у пациента до антибиотикотерапии, а дочерний резистентный штамм был получен от того же пациента после антибиотикотерапии и клинической неудачи (развитие резистентности in vivo). Бактерии были выделены и культивированы на агаре Heart Infusion (HI) в течение 16 ч при 37 °C. (B)Последующая подготовка образцов для AFM-IR, включая отбор образца с последующей промывкой бактериального поддона (3×) и осаждением пробы. (C) Сбор и анализ данных AFM-IR: высота AFM и спектр AFM-IR (1800–900см-1). Размер изображения области AFM: 1,7 x 1,4 мкм. Спектр AFM-IR собирали из середины ячейки. Впоследствии данные были проанализированы с использованием хемометрических подходов, включая иерархический кластерный анализ. Эта цифра была изменена с K. Kochan et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: AFM и AFM-IR результаты исследования химических изменений в ванкомицине промежуточного S. aureus (VISA) по сравнению с ванкомицин-чувствительным S. aureus (VSSA) в клинических парах. AFM изображения(A–B)VISA и(C)VSSA одноклеточных образцов. Размер сфокусированных областей: (A,C) 40 x 40 мкм, (B) 2,56 x 2,45 мкм. (D–E) Средние спектры AFM-IR и их(F–G)вторые производные для: (D,F) VISA и (E,G) VSSA ячеек, в спектральном диапазоне 1800–900 см-1. Представленные спектры имеют в среднем 81 (VISA) и 88 (VSSA) индивидуальных спектров и представлены вместе со стандартным отклонением (SD). Усреднение проводилось после нормализации всех отдельных спектров вместе. Основные полосы отмечены в (F–G). Эта цифра была изменена с K. Kochan et al.19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Дрейф изображения по последовательной регистрации карт AFM-IR при выбранных значениях волнового числа для ячейки S. aureus.  (Верхняя строка):изображения AFM записывались одновременно с соответствующими(нижний ряд)картами AFM-IR на основе интенсивности ИК-сигнала при выбранных значениях волнового числа. Значения волнового числа (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 см-1)аннотируются над нижним рядом. Каждый набор (изображение AFM и карта AFM-IR) был записан непосредственно после предыдущего изображения (примерно 40 минут на набор). Размер изображенной/картографированной области: 1,54 x 1,57 мкм. Между изображениями виден четкий дрейф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Мы хотели бы поблагодарить Bruker за оплату издательского сбора. KK, BRW, AP и PH являются изобретателями по международному патенту (PCTIB2020/052339), который описывает некоторые фундаментальные аспекты подхода.