Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Минимально инвазивный метод интратрахеальной инстилляции препаратов у новорожденных грызунов для лечения заболеваний легких

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61729

⸱

4 августа 2021 г.

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

Эта техника закапывания лекарств непосредственно в трахею новорожденных грызунов важна при изучении влияния местно вводимых препаратов или биологических препаратов на заболевания легких новорожденных. Кроме того, этот метод также может быть использован для индуцирования повреждения легких на животных моделях.

Аннотация

Лечение неонатальных грызунов препаратами, закапываемыми непосредственно в трахею, может служить ценным инструментом для изучения влияния местного препарата. Это оказывает прямое трансляционное воздействие, потому что поверхностно-активное вещество и лекарства вводятся локально в легкие. Хотя в литературе есть много публикаций, описывающих минимально инвазивную трансоральную интубацию взрослых мышей и крыс в терапевтических экспериментах, этот подход у детенышей неонатальных крыс отсутствует. Небольшой размер оротрахеальной области / глотки у щенков затрудняет визуализацию просвета гортани (голосовых связок), способствуя переменной скорости успеха внутритрахеальной доставки лекарств. Настоящим мы демонстрируем эффективную пероральную интубацию новорожденного крысиного щенка – методику, которая является нетравматичной и малоинвазивной, так что ее можно использовать для серийного введения препаратов. Мы использовали операционный отоскоп с системой освещения и увеличительной линзой для визуализации трахеального отверстия новорожденных крыс. Затем препарат закапывают с помощью шприца объемом 1 мл, соединенного с наконечником пипетки. Точность метода доставки была продемонстрирована с использованием введения синего красителя Эванса. Этот метод легко обучить и может служить эффективным способом введения лекарств в трахею. Этот метод также может быть использован для введения инокулята или агентов для моделирования болезненных состояний у животных, а также для клеточных стратегий лечения различных заболеваний легких.

Введение

Новорожденные, рожденные преждевременно, имеют плохо развитые легкие, требующие многих интервенционных методов лечения, таких как долгосрочная вентиляция. Эти вмешательства подвергают выживших новорожденных высокому риску последующих последствий1. Экспериментальные модели на животных служат важным инструментом в моделировании различных болезненных состояний, изучении патобиологии заболеваний и оценке терапевтических вмешательств. Несмотря на то, что доступен широкий спектр моделей животных от мышей, крыс и кроликов до преждевременных ягнят и свиней, мыши и крысы являются наиболее используемыми.

Основным преимуществом использования мышей и крыс являются относительно короткий период беременности и снижение стоимости. Они также легко доступны, просты в обслуживании в свободной от болезней среде, генетически однородны и имеют относительноменьшую этическую озабоченность 2,3. Другим важным преимуществом модели грызуна является то, что при рождении неонатальный щенок находится на поздней каналикулярной / ранней мешковидной стадии развития легких, которая морфологически эквивалентна легкому 24-недельного недоношенного неонатального младенца, у которого развивается бронхолегочная дисплазия4. Кроме того, поскольку их развитие легких быстро прогрессирует до завершения в течение первых 4 недель жизни, возможно изучить послеродовое созревание легких в разумные сроки4. Несмотря на эти преимущества, небольшой размер мышей и крысиных детенышей является источником беспокойства для различных вмешательств, что вынуждает большинство исследователей использовать взрослых животных, а не щенков5. Легкие новорожденных находятся в стадии развития, и реакция новорожденного на подстрекательский агент отличается от реакции взрослого человека. Это делает целесообразным использование неонатальных животных моделей для изучения состояний неонатальных заболеваний человека.

Существуют различные методы введения лекарств / биологических агентов в легкие. Это включает интраназальную 6,7 или интратрахеальную 8,9,10 инстилляцию, а также аэрозольную ингаляцию11,12. Каждый подход имеет свои технические проблемы, преимущества, а также ограничения13. Внутритрахеальный путь введения терапевтических средств предпочтительнее для изучения прямого терапевтического воздействия на орган в обход системных эффектов. Этот путь также может быть использован для изучения патологии легких, вызванной подстрекательскими агентами. Существуют как инвазивные, так и минимально инвазивные методы для этого, и их легко выполнить у взрослых. Однако у детенышей из-за небольших размеров животного возникают технические проблемы, связанные с процессом интубации. В настоящем исследовании представлен простой, последовательный, нехирургический метод интратрахеальной инстилляции (ITI) у детенышей крыс, который может быть использован для изучения эффективности различных неонатальных терапевтических вмешательств, а также для создания моделей на животных, имитирующих респираторные заболевания новорожденных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (протокол No 2020-0035) в Университете Кейс Вестерн Резерв. Все животные лечились в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Животные

  1. Коммерчески получают беременных крыс Sprague Dawley.
  2. Содержание животных в утвержденном ветеринарном учреждении с циклом 14 ч/10 ч светло-темным и относительной влажностью 45-60%.

2. Подготовка исследуемого состава

  1. Используйте синий краситель Эванса в качестве тестового соединения для оценки эффективности процедуры интратрахеальной инстилляции.
  2. Готовят 0,25% (мас./об.) раствор красителя в фосфатно-буферном физиологическом растворе (рН 7,2) и фильтруют стерилизовать с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.

3. Введение анестезии

  1. Обезболивайте детенышей крыс с помощью газовой анестезии (3% изофлурана в 100% кислороде), используя модифицированную систему доставки, адаптированную для маленьких новорожденных крыс.
  2. Проверьте потерю хвостового и педального рефлексов и поверхностное дыхание, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии для проведения процедуры.

4. Интратрахеальная инстилляция (ИТИ)

  1. Используйте детенышей крыс на послеродовой день 5 (PN 5) для ITI. Средний вес щенка крысы PN 5 составляет 12 граммов.
  2. Удерживайте обезболенного щенка крысы на наклонной плоской платформе с помощью лабораторной этикетировочной ленты. Щенка удерживают под углом около 45° в положении лежа на спине.
  3. Откройте рот новорожденного, и осторожно вытяните язык в одну сторону с помощью тупых щипцов.
  4. Используйте небольшое зеркало отоскопа диаметром 2 мм, подключенное к отоскопу, чтобы мягко удерживать язык и для правильной визуализации гортани.
  5. Используйте систему осветителя горла, то есть операционный отоскоп, и увеличительную линзу для правильной визуализации голосовых связок (рисунок 1).
  6. Расположите животных под углом 45° в наклонной плоскости. Используются проводные крышки мышечных клеток (рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Позиционирование животного под углом 45° обеспечивает лучшую визуализацию отверстия трахеи без вмешательства надгортанника.
  7. Возьмите длинноугольный наконечник пипетки, который используется для загрузки вестерн-блот-гелей. Отрежьте основание наконечника пипетки хирургическим лезвием так, чтобы оно хорошо вписалось в кончик шприца объемом 1 куб. см.
  8. Используйте стерильный шприц объемом 1 мл, вставленный в длинноугольный наконечник пипетки, чтобы доставить 30-50 мкл вещества в легкие. Переверните шприц и аспирируйте почти 0,9 куб. см воздуха в шприц объемом 1 мл, соединенный с наконечником пипетки, а затем краситель или вещество, подлежащее доставке. Это позволяет воздуху за красителем выталкиваться в трахею после введения красителя, как показано на рисунке 3. Внутритрахеальное введение достигается путем визуализации просвета гортани (голосовых связок) и введения наконечника пипетки, установленного на шприце, в просвет трахеи.
  9. Используйте зеркало отоскопа, чтобы удерживать язык и обнажать голосовые связки. Зеркало выполняет роль лезвия ларингоскопа. Согните кончик пипетки под углом 30°, чтобы облегчить введение агента через конусообразное зеркало в отверстие трахеи.
  10. Введите кончик пипетки в отверстие трахеи примерно на 2 мм за пределы голосовых связок. Толкните поршень шприца для введения красителя или лекарственного средства через зеркало работающего отоскопа, как показано на рисунке 3. Введение воздуха в легкие вскоре после введения средства предотвращает возвращение вещества в полость гортани.
  11. После введения щенку с красителем или обычным физиологическим раствором поместите щенков на интегрированную грелку для циркуляции жидкости (38 ° C) до тех пор, пока их дыхательные движения не станут регулярными. После полного восстановления после анестезии воссоедините детенышей с плотиной.

5. Характеристика доставки ITI

  1. После ИТИ усыпляют детенышей крыс путем введения чрезмерной анестезии (кетамин 100 мг/кг и ксилазин 10 мг/кг) / тиопэнтон с последующей экссангинацией в соответствующее время после введения. Эвтаназия была выполнена в рамках эксперимента по сбору легочной ткани для демонстрации эффективности.
  2. Закрепите усыпленного крысиного щенка на рассеченной доске и протрите грудь и живот 70% этиловым спиртом.
  3. Для оценки распределения красителя по всему легкому удалите легкие животного с помощью стерильной техники и отобразите легкие в соответствии с визуализацией (рисунок 4A, B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Инстилляция синего цвета Эванса выявила мультифокальное распределение красителя с участием всех легочных долей (рисунок 4A,B). Наш результат, как показано на рисунке 4, демонстрирует эффективность распределения по всем долям. Снимок делается сразу после ИТИ красителя в трахею. 100% эффективность была достигнута при закапывании красителя в трахею с последующим его распространением на все доли с обеих сторон. Ожидается, что краситель будет распрос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Интратрахеальная инстилляция является отличным методом, который предлагает несколько преимуществ по сравнению с существующими методами вмешательства в респираторные заболевания, а также разработкой модели заболевания. Это быстрый метод и с опытом, может быть выполнен со средней скоростью 2-3 минуты на животное. Ключевыми соображениями для успешной интубации являются правильная седация животного, его правильное позиционирование, особенно головы, а также точная глубина размещения/размера зеркала в ротоглотке. Правильная се...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана R01HD090887-01A1 от NICHD до AH. Авторы также признают возможности, предоставляемые лабораторией доктора Питера Мак-Фарлейна, такие как ингаляционная анестезия / система грелок. Мы высоко ценим ценную помощь г-жи Кэтрин Майер в создании этой системы. Финансирующий орган не играл никакой роли в разработке исследования, сборе, анализе и интерпретации данных или в написании рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эванс Блюкраситель Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, США314-13-6Подтверждение введения препарата в легкие
Кетамина гидрохлоридаХоспира. Inc, Лейк-Форест, Иллинойс, СШАОтпускается из учреждения по уходу за животнымиДля седации
Операционный отоскопWelch Allyn, Hillrom, Чикаго, Иллинойс, США21770- 3,5 ВДля визуализации голосовых связок
Отоскоп Аккумуляторная ручкаWelch Allyn, Hillrom, Чикаго, Иллинойс, США71050-C
Наконечник для пипетки (Гелевая загрузка)Fisherbrand02-707-139Введение препарата
Платформа для фиксации (наклонная плоскость)Учреждение по уходу за животнымиВыдается из учреждения по уходу за животнымиПроводная крыша клетки для мышей может быть использована
3M Micropore Surgical White Paper (клейкая лента)3M, St. Paul, MN, США1530-2
Luer Lock SyringeШприцы (1 мл)BD Franklin Lakes, NJ, США NBD2515введения препарата
XylazineHospira. Inc, Лейк-Форест, Иллинойс, СШАДля седации

Ссылки

  1. Prakash, Y. S. Pulmonary Cell Biology Lab: Neonatal Lung Disease. Mayo Clinic. , Available from: https://www.mayo.edu/research/labs/pulmonary-cell-biology/projects/neonatal=lung-disease (2020).
  2. Martínez-Burnes, J., López, A., Lemke, K., Dobbin, G. Transoral intratracheal inoculation method for use with neonatal rats. Comparative Medicine. 51 (2), 134-137 (2001).
  3. Pinkerton, K. E., Crapo, J. D. Morphometry of the alveolar region of the lung. Toxicology of Inhaled Materials Handbook of Experimental Pharmacology. Witschi, H., Brain, J. D. 95, Springer, Berlin. 259-285 (1985).
  4. Nardiello, C., Mižíková, I., Morty, R. E. Looking ahead: where to next for animal models of bronchopulmonary dysplasia. Cell and Tissue Research. 367 (3), 457-468 (2017).
  5. Sugimoto, M., Ando, M., Senba, H., Tokuomi, H. Lung defenses in neonates: Effects of bronchial lavage fluids from adult and neonatal rabbits on superoxide production by their alveolar macrophages. Journal of the Reticuloendothelial Society. 27 (6), 595-606 (1980).
  6. Grayson, M. H., et al. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. Journal of Immunology. 179 (3), Baltimore, Md. 1438-1448 (2007).
  7. Moreira, A., et al. Intranasal delivery of human umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stromal cells restores lung alveolarization and vascularization in experimental bronchopulmonary dysplasia. Stem Cells Translational Medicine. 9 (2), 221-234 (2020).
  8. Bar-Haim, E., et al. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathogens. 4 (11), 1000211(2008).
  9. Linderholm, A. L., Franzi, L. M., Bein, K. J., Pinkerton, K. E., Last, J. A. A quantitative comparison of intranasal and intratracheal administration of coarse PM in the mouse. Integrative Pharmacology, Toxicology and Genotoxicology. 1 (1), 5-10 (2015).
  10. Guerra, K., et al. Intra-tracheal administration of a naked plasmid expressing stromal derived factor-1 improves lung structure in rodents with experimental bronchopulmonary dysplasia. Respiratory Research. 20 (1), 255(2019).
  11. Thomas, R., et al. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. Journal of Medical Microbiology. 59, Pt 12 1415-1427 (2010).
  12. Sakurai, R., et al. A combination of the aerosolized PPAR-γ agonist pioglitazone and a synthetic surfactant protein B peptide mimic prevents hyperoxia-induced neonatal lung injury in rats. Neonatology. 113 (4), 296-304 (2018).
  13. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), e2702(2011).
  14. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environmental Research. 11 (1), 13-33 (1976).
  15. Pritchard, J. N., et al. The distribution of dust in the rat lung following administration by inhalation and by single intratracheal instillation. Environmental Research. 36 (2), 268-297 (1985).
  16. Ruzinski, J. T., Skerrett, S. J., Chi, E. Y., Martin, T. R. Deposition of particles in the lungs of infant and adult rats after direct intratracheal administration. Laboratory Animal Science. 45 (2), 205-210 (1995).
  17. Sun, B., Curstedt, T., Song, G. W., Robertson, B. Surfactant improves lung function and morphology in newborn rabbits with meconium aspiration. Biology of the Neonate. 63 (2), 96-104 (1993).
  18. Nicholson, J. W., Kinkead, E. R. A simple device for intratracheal injections in rats. Laboratory Animal Science. 32 (5), 509-510 (1982).
  19. Carlon, M., et al. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18 (12), 2130-2138 (2010).
  20. Chen, C. -M., Chen, Y. -J., Huang, Z. -H. Intratracheal Instillation of Stem Cells in Term Neonatal Rats. Journal of Visualized Experiments. (159), e61117(2020).
  21. Reynolds, R. D. Preventing maternal cannibalism in rats. Science. 213 (4512), New York, N.Y. 1146(1981).
  22. Park, C. M., Clegg, K. E., Harvey-Clark, C. J., Hollenberg, M. J. Improved techniques for successful neonatal rat surgery. Laboratory Animal Science. 42 (5), 508-513 (1992).
  23. Cleary, G. M., et al. Exudative lung injury is associated with decreased levels of surfactant proteins in a rat model of meconium aspiration. Pediatrics. 100 (6), 998-1003 (1997).
  24. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  25. Oka, Y., et al. A reliable method for intratracheal instillation of materials to the entire lung in rats. Journal of Toxicologic Pathology. 19 (2), 107-109 (2006).
  26. Watanabe, A., Hashimoto, Y., Ochiai, E., Sato, A., Kamei, K. A simple method for confirming correct endotracheal intubation in mice. Laboratory Animals. 43 (4), 399-401 (2009).
  27. Kim, J. -S., et al. An automatic video instillator for intratracheal instillation in the rat. Laboratory Animals. 44 (1), 20-24 (2010).
  28. Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. Journal of Visualized Experiments. (93), e52261(2014).
  29. Ordodi, V. L., Mic, F. A., Mic, A. A., Sandesc, D., Paunescu, V. A simple device for intubation of rats. Lab Animal. 34 (8), 37-39 (2005).
  30. Cleary, G. M., Wiswell, T. E. Meconium-stained amniotic fluid and the meconium aspiration syndrome. An update. Pediatric Clinics of North America. 45 (3), 511-529 (1998).
  31. Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An improved method for rapid intubation of the trachea in mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771(2016).
  32. Litvin, D. G., Dick, T. E., Smith, C. B., Jacono, F. J. Lung-injury depresses glutamatergic synaptic transmission in the nucleus tractus solitarii via discrete age-dependent mechanisms in neonatal rats. Brain, Behavior, and Immunity. 70, 398-422 (2018).
  33. Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
  34. Kim, Y. E., et al. Intratracheal transplantation of mesenchymal stem cells simultaneously attenuates both lung and brain injuries in hyperoxic newborn rats. Pediatric Research. 80 (3), 415-424 (2016).
  35. Chang, Y. S., et al. Intratracheal transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells dose-dependently attenuate hyperoxia-induced lung injury in neonatal rats. Cell Transplantation. 20 (11-12), 1843-1854 (2011).
  36. Chang, Y. S., et al. Timing of umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells transplantation determines therapeutic efficacy in the neonatal hyperoxic lung injury. PloS One. 8 (1), 52419(2013).
  37. Mowat, V., Alexander, D. J., Pilling, A. M. A comparison of rodent and nonrodent laryngeal and tracheal bifurcation sensitivities in inhalation toxicity studies and their relevance for human exposure. Toxicologic Pathology. 45 (1), 216-222 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Использование отоскопапрямая визуализациякраситель эванс-блюраспределение в тканях легкоговведение препарататрахеальное введениевизуализация голосовых связокноворожденные крысята
Минимально инвазивный метод интратрахеальной инстилляции препаратов у новорожденных грызунов для лечения заболеваний легких
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.