Method Article

Криогенная загрузка образца в вращающийся ядерный магнитно-резонансный спектрометр под магическим углом, который сохраняет жизнеспособность клеток

DOI:

10.3791/61733

⸱

September 1st, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Disease and Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен протокол криогенного переноса замороженных образцов в зонд динамической ядерной поляризации (DNP) с магическим углом вращения (MAS) ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Протокол включает в себя указания по хранению ротора до эксперимента и указания по измерениям жизнеспособности до и после эксперимента.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Динамическая ядерная поляризация (DNP) может резко повысить чувствительность спектроскопии магнитного магнитного резонанса (ЯМР) с магическим углом вращения (MAS). Эти повышения чувствительности увеличиваются по мере снижения температур и достаточно велики, чтобы позволить изучать молекулы при очень низких концентрациях при рабочих температурах (~ 100 К) большинства коммерческих ЯМР-спектрометров, оснащенных DNP. Это приводит к возможности инклеточной структурной биологии криоконсервировать клетки для макромолекул на их эндогенных уровнях в их родной среде. Однако скорость замораживания, необходимая для клеточной криоконсервации, превышена во время типичной обработки образцов для ЯМР DNP MAS, и это приводит к потере клеточной целостности и жизнеспособности. В данной статье описан подробный протокол подготовки и криогенного переноса замороженного образца клеток млекопитающих в ЯМР-спектрометр MAS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Введение динамической ядерной поляризации для магического угла вращающейся ядерной магнитно-резонансной спектроскопии позволяет повысить чувствительность МАС ЯМР на несколько порядков. Это позволило обнаружить биомолекулы в их физиологических концентрациях или вблизи них. DNP может и обеспечивает чувствительность, необходимую для обнаружения изотопно меченого белка в эндогенных (~1 мкМ) концентрациях в сложной биологическойсреде1. Поскольку существуют устоявшиеся протоколы для введения изотопно меченых молекул в немаркированные клетки млекопитающих, не влияя на их жизнеспособность, это открывает возможность изучения изотопно обогащенных биомолекул на их эндогенных уровнях в их родной среде. Более того, поскольку улучшения DNP более эффективны при более низких температурах2,3,4,экспериментальные температуры для ЯМР DNP MAS четко согласуются с теми, которые необходимы для длительного хранения жизнеспособных клеток млекопитающих5. Однако традиционный метод переноса образца в ЯМР-спектрометр DNP MAS подвергает его скорости колебаний температуры, которые разрывают клетки млекопитающих.

Эксперименты MAS ЯМР требуют, чтобы образец поворачивался в отношении магического угла на частотах, равных или превышающих величину анизотропного взаимодействия, чтобы он был усреднен до нуля, обычно по крайней мере 4 кГц и часто намного выше6,7,8,9. Поэтому образцы упаковываются в роторы, которые имеют оребренный наконечник, который используется для управления вращением ротора потоком газа и имеют отметку на другом конце, поэтому частоту вращения можно контролировать с помощью тахометра. Передача образцов для большинства приборов ЯМР MAS осуществляется путем впрыскивания ротора из внешней части прибора в статор в конце ЯМР-зонда потоком сухого воздуха или газообразного азота. После того, как ротор достигает статора, который удерживает ротор под магическим углом, вращение образца приводится в движение механизмом воздушной турбины. Отдельные потоки газа поддерживают, продвигают и контролируют температуру ротора. Вставка ротора в ЯМР-спектрометр и достижение стабильного вращения MAS требует тонко обработанной мувывода и жесткого контроля температуры и давления отдельных потоков газа. Несмотря на эти технические требования, установка и достижение стабильного MAS в значительной степени автоматизированы для коммерческих ЯМР-зондов MAS для применения при комнатной температуре.

Однако ситуация более сложная для низкотемпературных применений. Образцы для низкотемпературных применений обычно вставляются в спектрометр при комнатной температуре и замораживаются в статоре. В первую минуту температура образца быстро снижается (> −100 °C/мин), а температура системы требует нескольких минут для уравновешиваться. Из-за взаимодействия температуры и давления вставка и приближение желаемого MAS часто обрабатываются вручную для низкотемпературных применений. Несмотря на необходимость ручного вмешательства, замораживание ротора внутри прибора полезно, поскольку оно сводит к минимуму попадание воды и конденсата в зонд, что имеет решающее значение для успешного вращения. Мало того, что конденсация и накопление льда от окружающей влаги блокируют газовые линии, конденсация или мороз на самом роторе могут механически предотвратить MAS. Таким образом, образцы для низкотемпературного МАС ЯМР обычно замораживают внутри прибора со скоростью, превышающей -100 °C/мин.

Клетки млекопитающих могут сохранять свою целостность через цикл замораживания-оттаивания, если охлаждение происходит медленно5,10,11,12со скоростью, равной или медленнее 1 °C/мин. Альтернативно, клетки также сохраняют свою целостность, если скорость охлаждения является сверхбыстрой13,14,15, со скоростью более 104 °C / мин. Скорости, промежуточные для этих двух крайностей, разрывают и убивают клетки млекопитающих из-за образования кристаллов льда как внутри, так и снаружи клеток, даже в присутствии криопротекторов16. Скорость охлаждения образцов для ротора комнатной температуры внутри предварительно охлажденного зонда находится между этими двумя крайностями, поэтому для изучения криогенно сохраненных неповрежденных жизнеспособных клеток млекопитающих образцы должны быть заморожены перед передачей в прибор и переданы в прибор без колебаний температуры, которые могут повредить образец или накопление мороза на роторе, который может предотвратить вращение ротора. Протокол описывает метод безморозной, предварительно охлажденной вставки ротора в криогенную систему ЯМР MAS для изучения криогенно сохраненных интактных жизнеспособных образцов клеток млекопитающих. Описанный здесь криогенный перенос образца был разработан для ЯМР-характеристики жизнеспособных интактных клеток. Однако он применим к любой системе, где колебания температуры могут поставить под угрозу целостность образца. Это включает в себя любое разнообразие сложных систем, таких как замораживание закаленные реакции для химической и структурной характеристики захваченных реакционных промежуточных продуктов17,18,энзимология19,20 или сворачивание белка21,22.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культивация и криозащита клеток млекопитающих

  1. Культивирование и сбор клеток млекопитающих
    1. Разморозить аликвоту замороженных эмбриональных клеток почек человека (HEK 293).
    2. Культивировать клетки HEK 293 в питательных средах (например, DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% Pen-Strep) при 37 °C с 5% CO2 в 100 мм пластинах в течение двух-трех проходов (7-10 дней).
    3. Разделите клетки и культивированы в пластине толщиной 150 мм до тех пор, пока клетки не достигнут 90-95% конфлюентности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины диаметром 150 мм при > 90% слиянии будет достаточно для заполнения двух сапфировых роторов диаметром 3,2 мм.
    4. Собирайте клетки, используя 4 мл трипсина (см. Таблицу материалов)и 10 мл среды. Переложите суспензию в стерильную коническую 15 мл и центрифугу при 673 х г (1000 об/мин) в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант.
    5. Промыть ячейку гранулы фосфатным буферизованным физиологическим раствором (PBS) (рН 7,4, −CaCl2, −MgCl2).
  2. Криопротекция клеток
    1. Соберите гранулу ячейки 50 мкл в микроцентрифужную трубку. Приготовьте смесь из 50 мкл PBS и 18 мкл глицерина в отдельной пробирке.
    2. Осторожно смешайте гранулу 50 мкл с 68 мкл смеси глицерин-PBS, добавив смесь глицерин-PBS в верхнюю часть гранулы и повторно развернув гранулу, осторожно постукивая по боковой стороне трубки, пока не останутся сгустки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкое пипетирование также может быть использовано для повторного суспендирования ячейки, однако убедитесь, что клеточная целостность не нарушена.

2. Криоконсервация клеток млекопитающих в ямр-роторе

  1. Перенос ячеек в сапфировый ротор 3,2 мм.
    1. Чтобы сделать воронку, вырежьте наконечник пипетки 200 мкл и вставьте узкий конец наконечника вырезанной пипетки в ротор 3,2 мм.
    2. Перенесите ячейки в воронку, сидящую на роторе. Поместите ротор вместе с воронкой в микроцентрифужную трубку и гранулируют ячейки в нижнюю часть ротора путем центрифугирования при 673 х г в течение 2-3 мин при комнатной температуре.
    3. Удалите супернатант и любой избыточный образец из ротора. Повторяйте эти два шага до тех пор, пока ротор не будет полностью заполнен ячейками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Факультативно определить клеточную жизнеспособность образца до замораживания. Повторное суспендирование 10 мкл избыточной клеточной гранулы в 100 мкл ФБС-свободного DMEM. Смешайте 10 мкл суспензии с 0,4% раствором трипан-синего цвета и немедленно оцените жизнеспособность с помощью автоматизированного счетчика клеток. Используйте только свободные среды FBS для разбавления клеток, так как сыворотка препятствует окрашиванию трипана в синий цвет.
    4. Запечатайте ротор силиконовой заглушкой с помощью коммерчески доступного упаковочного инструмента.
    5. Закройте ротор керамическим наконечником привода, нажав на него вертикально вниз. Избегайте прикосновения к тонким ребрам сбоку наконечника привода.
    6. Отметьте половину нижнего края сапфирового ротора серебряным перманентным маркером, а другую половину нижнего края ротора черным постоянным маркером, чтобы обеспечить точный мониторинг вращения ротора внутри спектрометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несовершенства в маркировке ротора будут препятствовать точному подсчету частоты вращения, что приведет к неспособности достичь стабильного вращения. Поскольку маркеры не будут записываться на замерзшем роторе, а нагревание ротора нарушает целостность образца, маркировка ротора перед замерзанием является критическим шагом.
  2. Криоконсервация клеток внутри сапфирового ротора 3,2 мм.
    1. Поместите подушку, изготовленную из куска салфетки или бумажного полотенца, под крышку и на дно криогенного флакона (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Папиросная бумага защищает маркировку ротора от повреждений, полученных при столкновении с бортами криогенных флаконов.
    2. Поместите сапфировый ротор размером 3,2 мм в криогенный флакон, обтянутый папиросной бумагой с маркированным концом, обращенным к дну криогенного флакона.
    3. Медленно заморозьте ротор, поместив криогенный флакон в охлаждающий контейнер с контролируемой скоростью (-1 °C/мин) и поместите контейнер в морозильную камеру с -80 °C минимум на 3 ч.
    4. Перенесите криогенный флакон, содержащий замороженный ротор, в хранилище жидкого азота.

3. Криогенный перенос замороженного образца в ЯМР-спектрометр

  1. Транспортировка замороженного образца на установку ЯМР.
    1. Перенесите криогенный флакон, содержащий замороженный ротор, в небольшой дьюар, заполненный жидким азотом, для транспортировки на установку ЯМР.
  2. Перенос замороженного ротора в жидко-азотную ванну.
    1. Наполните сухой, теплоизолированной широкой пеной для рта дьюар 500 мл – 1 л жидкого азота.
    2. Перенесите ротор из криогенного флакона в широкий рот пены дьюара, заполненный жидким азотом.
      1. Возьмите криогенный флакон из переноса Дьюара в руку и держите его чуть выше поверхности жидкого азота, чтобы защитить его от атмосферы.
      2. Держа криогенный флакон с ртом, направленным немного вниз, открутите колпачок и позвольте ротору скользить в ванну с жидким азотом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как колпачок откручен, ротор должен быстро (менее 1 секунды) упасть из криогенного флакона в ванну с жидким азотом, чтобы предотвратить накопление конденсата на роторе. Испарение жидкого азота образует «азотное облако» в широкой пене рта дьюара и предотвращает конденсацию на роторе до того, как он будет погружен в жидкий азот. Более длительное воздействие воздуха на ротор может привести к конденсации влаги на стенках ротора, которая будет повторно конденсироваться в лед.
  3. Криогенный перенос ротора на улавливатель образцов ЯМР.
    1. Предварительно окуньте микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, погрузив ее в ванну с жидким азотом. Не закрывайте трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осмотрите ротор перед переводом в трубку микроцентрифуги. С помощью пинцета держите ротор чуть ниже поверхности жидкого азота и проверьте, что маркировка ротора цела, что на его стенках не образовались ледяные отложения и что наконечник привода цел. Отложения кристаллов льда на стенках ротора выглядят в виде белого порошка. Будьте осторожны, чтобы всегда держать ротор за его корпус, а не за наконечник привода. Не царапайте маркировку ротора пинцетами-наконечниками.
    2. Под поверхностью жидкостно-азотной ванны используйте пинцет для переноса ротора в трубку микроцентрифуги с наконечником привода, обращенным к нижней части трубки микроцентрифуги, и маркировкой, обращенной к отверстию трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда сушите пинцет перед погружением в жидкий азот или прикосновением к ротору.
    3. Используя пинцет, держите трубку, содержащую ротор под жидким азотом, за горловину.
    4. Имея вторую пару пинцетов в руках, будьте готовы погрузить улавливатель образцов ЯМР в ванну с жидким азотом и удерживать его так, чтобы он был наклонен под острым углом по отношению к трубке микроцентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму время контакта улавливателя проб с жидким азотом, чтобы избежать замерзания уплотнительного кольца. Если уплотнительное кольцо замерзнет, вставить улавливатель в спектрометр будет очень сложно.
  4. Передача криогенного ротора с улавливателя образцов ЯМР на ЯМР-спектрометр
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе требуется два человека, один для работы с криокабинетом и один для переноса образца из жидкого азота в зонд.
    1. Поместите криокабинет в режим выброса, нажав кнопку «EJECT» на шкафу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Режим выброса продувает поток сухого и холодного газообразного азота под высоким давлением от зонда в атмосферу, чтобы предотвратить попадание атмосферной влаги.
    2. Перенесите ротор в улавливатель образцов ЯМР.
      1. Вставьте открытый конец улавливателя образцов ЯМР в микроцентрифужную трубку, находясь еще под поверхностью жидкого азота.
      2. Поднимите как микроцентрифужную трубку, так и улавливатель образцов ЯМР, чтобы ротор упал в улавливатель проб. Встряхните ЯМР-улавливатель проб и микроцентрифужную трубку в случае, если ротор застрял на ободе улавливателя проб.
      3. Оставьте пустую микроцентрифужную трубку поверх улавливателя образцов ЯМР, чтобы защитить ротор от воздуха.
    3. Извлеките из зонда другой пустой улавливатель образцов ЯМР и положите его на пол.
    4. Перенесите улавливатель образцов ЯМР, содержащий ротор, на свободную руку, извлеките трубку микроцентрифуги и немедленно вставьте ее в зонд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если уплотнительное кольцо замерзнет, будет трудно затянуть улавливатель проб. Продолжайте прикладывать силу, пока она не скользит на место.
    5. Подать сигнал человеку, управляя криокабинетом, на «STOP EJECT» и «INSERT».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Режим вставки направляет ротор из улавливателя образцов в зонд.
    6. Раскрутите образец до желаемой скорости вращения (например, 12 кГц) путем регулировки подшипника и давления потока привода, контролируемого криокабинетом. (Например, немедленно увеличьте расход подшипника до ~200 мБар, а приводной газ до 10 мБар. Как только образец вращается, увеличьте объем подшипникового газа до 1000 мБар и газ привода до 200 мБар. По мере стабилизации вращения увеличьте подшипник до 2400 мБар, а затем увеличьте расход приводного газа с 200 мБар до 1700 мБар в течение нескольких минут. Охлаждающий газ VT постаенен при ~1070 л/ч.)
      ПРИМЕЧАНИЕ: При подъеме микроцентрифужной трубки и улавливателя образцов ЯМР из ванны с жидким азотом убедитесь, что в микроцентрифужной трубке достаточно жидкого азота, чтобы окружить ротор. Минимизируйте время между переносом ротора в улавливатель образцов ЯМР и вставкой улавливателя образцов ЯМР в спектрометр. Все шаги в 3.4 должны быть выполнены в течение 30 с.

4. Криогенное удаление образца с ЯМР-спектрометра

  1. Приготовление жидко-азотной ванны и криогенного флакона
    1. Налейте 500 мл - 1 л жидкого азота в широкую пену для рта дьюара и поместите ванну под спектрометр.
    2. Предварительно охладите криогенный флакон. Погрузьте пустой криогенный флакон, содержащий кусок папиросной бумаги, в ванну с жидким азотом.
  2. Криогенный перенос ротора от зонда к криогенному флакону
    1. Уменьшите скорость вращения до 0 кГц за счет уменьшения потока газа привода и подшипника и выталкивайте ротор, переключаясь в режим выброса.
    2. Держите режим выброса включен, извлеките улавливатель проб из зонда, опустите ротор непосредственно в широкую пену дьюара, содержащую жидкий азот.
    3. Используя предварительно охлажденный пинцет, перенесите ротор в предварительно охлажденный криогенный флакон под поверхностью жидкого азота.
    4. Колпачок криогенного флакона. Предварительно окунуть криогенный колпачок флакона, окунув его в жидкий азот. Извлеките криогенный флакон, содержащий ротор и жидкий азот, из ванны и заткните трубку предварительно охлажденным колпачком. Не затягивайте колпачок так, чтобы испаряющийся азот можно было безопасно выпустить.
    5. Повторное погружение криогенного флакона в жидкий азот. Образец может быть передан на более длительное хранение жидкого азота или немедленно распакован для дальнейшего анализа.

5. Распаковка ротора и измерения жизнеспособности

  1. Распаковка ротора и измерение жизнеспособности
    1. Предварительно нагрейте сыворотку без сред (DMEM) или PBS до 37 °C.
    2. Удалите ротор из жидкого азота. Снимите наконечник привода и силиконовую заглушку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сапфир является отличным теплопроводником. Избегайте прикосновения пальцев к ротору, потому что теплопередача может вызвать локальные явления замерзания-оттаивания, которые ставят под угрозу жизнеспособность клеток.
  2. Измерение жизнеспособности
    1. Добавьте 20 мкл теплой среды к замороженной ячейке гранулы в роторе и повторно суспендируют ячейки. Снимите суспензию пипеткой и смешайте суспензию со 100 мкл среды.
    2. Удалить 10 мкл клеточной суспензии и перемешать с равным объемом 0,4% раствора трипана синего цвета (v/v). Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 с - 1 мин.
    3. Измеряйте жизнеспособность с помощью автоматизированного счетчика ячеек.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криогенная вставка предварительно замороженных образцов клеток млекопитающих в ЯМР-спектрометр поддерживает жизнеспособность на протяжении всего эксперимента ЯМР. Схемы криогенного переноса замороженного образца в предварительно охлажденный ЯМР-зонд показаны на рисунке 1. Жизнеспособность и интактность клеток можно оценить с помощью различных методов. Здесь мы использовали стандартную меру целостности мембраны на основе красителя, которая хорошо согласуется с другими методами23. Интактные клетки непроницаемы для трипан-синего цвета, в то время как клетки с нарушенной целостностью мембраны проницаемы. Количество проницаемых и непроницаемых ячеек трипан синего цвета можно быстро оценить с помощью автоматизированного счетчика клеток. Используя протокол, описанный здесь, проницаемость трипана синего цвета клеток млекопитающих после MAS ЯМР (т.е. в точке 5.2.3) аналогична проницаемости трипан-синего цвета клеток млекопитающих до любого изменения температуры (т.е. точка 2.1.3). Однако, если клетки медленно заморожены, а затем нагреты до комнатной температуры перед введением (т.е. следуя протоколу к точке 3 перед нагревателем ротора до комнатной температуры перед введением в охлажденный зонд), жизнеспособность клеток, оцениваемая трипан-синим, снижается до менее чем 10% клеток(рисунок 2). Таким образом, замораживание клеток внутри спектрометра приводит к потере целостности клеточной мембраны, в то время как криогенная вставка замороженных образцов клеток млекопитающих поддерживает жизнеспособность клеток на протяжении всего эксперимента ЯМР.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема криогенного переноса замороженного образца в предварительно охлажденный ЯМР-зонд. (A)Подойдите к поверхности жидкого азота и открутите верхнюю часть криогенного флакона. (B) Сдвиньте ротор в ванну с жидким азотом. (C) Погрузите трубку микроцентрифуги с помощью пинцета и удерживайте ее на месте до полного охлаждения. (D)Вставьте ротор в микроцентрифугу с наконечником привода, обращенным к нижней части трубки. Толкайте, а не хватайте пинцетем. (E)Держите трубку микроцентрифуги чуть ниже поверхности жидкостной азотной ванны и визуально осмотрите ротор, чтобы убедиться, что он свободен от замерзания и хорошо маркирован. (F)Держите улавливатель проб под углом над поверхностью. (G)Поднимите пробоотборник и трубку из жидкого азота, как только улавливатель проб находится внутри трубки микроцентрифуги. (H) Встряхните улавливатель проб, если ротор застрял на ободке. (I)Извлеките пустой улавливатель проб из зонда и положите его на землю. (J)Извлеките микроцентрифужную трубку из улавливателя проб с ротором внутри, вставьте, затяните пробоотборник в зонд и нажмите "INSERT" на пульте управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Криогенная вставка предварительно замороженного образца клеток млекопитающих приводит к измерениям клеточной неповрежденности, которые похожи на образцы клеток млекопитающих, которые никогда не были заморожены. Процентное содержание трипан-синего непроницаемых клеток для образцов, которые никогда не были заморожены (например, этап 2.1.3), аналогично проценту клеток для образцов после ЯМР MAS (например, этап 5.2.3 с MAS 12 кГц). Медленно замороженные ячейки (например, этап 3), которые нагревались до комнатной температуры перед введением в прибор ЯМР, который был предварительно охлажден до 100 К, имели гораздо более низкий процент неповрежденных ячеек после ЯМР MAS с 12 кГц MAS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криогенный перенос замороженных образцов в ЯМР-спектрометр успешно сохраняет жизнеспособность замороженных клеток млекопитающих посредством сбора данных ЯМР. Успех этой методологии демонстрируется в измерениях жизнеспособности ЯМР до и после MAS. Этот подход является успешным и обобщаемым для любой системы, где колебания температуры могут поставить под угрозу целостность образца. Представленный в настоящее время протокол выполняется с клеточной линией HEK 293. Поскольку условия криоконсервации для многих клеточных линий млекопитающих очень похожи, вполне вероятно, что условия, о которых сообщается здесь, переводятся в другие клеточные системы; однако для достижения тех же результатов может потребоваться дальнейшая оптимизация криопротекторов, объемов образцов и скорости замораживания.

Эта методология может быть улучшена путем распаковки ротора быстрее после эксперимента ЯМР. Этот шаг в настоящее время является неоптимальным и его выполнение влияет на жизнеспособность клеток. Прежде чем ячейки могут быть повторно суспендированы в среде, наконечник привода и силиконовая заглушка должны быть удалены из ротора. Образец оттаивает неравномерно, когда ротор удерживается во время снятия наконечника привода и кремниевой пробки, поэтому более короткое время обработки ротора приводит к более высокой жизнеспособности. Разработка держателей ротора или других инструментов для облегчения равномерного размораживания и быстрого удаления наконечника привода и кремниевой заглушки поможет сделать оценку жизнеспособности после ЯМР более точной.

Подход к криогенной загрузке образца, описанный в этой статье, ограничен ЯМР-зондами, которые поддерживают вставку и выброс образцов с зондом на месте в отверстии ЯМР-магнита. В то время как вставка и извлечение внешнего образца является стандартным для коммерческих систем DNP, пользовательские зонды не всегда имеют эту опцию. Кроме того, этот подход к криогенной загрузке образцов может потребовать некоторой модификации для ЯМР-зондов, построенных для совместимости с роторами разных размеров. Этот протокол оптимизирован для роторов диаметром 3,2 мм и может потребовать модификации, если наружный диаметр улавливателя проб превышает внутренний диаметр трубки микроцентрифуги (например, этап 3.4.2).

С применением ДНП к МАС ЯМР теперь можно обнаруживать белки и другие биомолекулы в эндогенных физиологических концентрациях24,25,26. Это открывает возможность изучения биомолекул в пределах их родной среды. Поддержание клеточной целостности и жизнеспособности на протяжении всего эксперимента, вероятно, будет иметь решающее значение для связывание экспериментальных результатов спектроскопии с биологическими явлениями. Неконтролируемое замораживание образцов, содержащих очищенные белки или клеточные лизаты, обычно не ставит под угрозу качество образца7,27,хотя есть некоторые признаки того, что скорость замораживания может быть важной переменной даже в очищенных системах28. Тем не менее, образцы клеток млекопитающих должны быть заморожены с контролируемой скоростью, если сохранение клеточной неповрежденности и жизнеспособности важно для интерпретации. Здесь мы представляем протокол замораживания и передачи замороженных образцов клеток млекопитающих в предварительно охлажденный инструмент ЯМР DNP MAS, который позволяет избежать потенциально опасных колебаний температуры и поддерживает измерение на жизнеспособных клетках.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Техасского научно-исследовательского института профилактики рака [RR150076], Национального научного фонда [1751174]; Национальные институты здравоохранения [NS-111236], Фонд Уэлча [1-1923-20170325]; Фонд Лупе Мерчисон, Фонд Теда Нэша «Долгая жизнь» и Фонд родства (Программа стипендиатов Сёрла) к К.К.Ф.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,4% Трипановый синий красительInvitrogenT10282
100 мм чашка для клеточной культурыThomas Scientific430167
150 мм чашка для клеточной культурыNunc157150
3,2 мм сапфировый роторBruker
45 ° угловые щипцыHampton ResearchHR4-859
AMUPolCortecnet
Черный и серебряный маркерИнструмент
BrukerHZ16913
Водный фильтр для клеточных культурHyCloneSH30529.03
Керамический колпачокCortecnetHZ12372
CoolCellCorning/ BiocisionUX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)
Камера подсчета клеток Countess SlidesInvitrogenC10288
Countess II автоматический счетчик клетокInvitrogenAMQAF1000
Криогеновые пробиркиNalgene03-337-7Y
d8-глицеринAldrich447498
оксид дейтерия, 99,8 % атом DAldrich756822-1
DMEMGibco10569-010
Система ЯМР DNP с частотно-согласованным гиротрономBruker
FoamdewarabFD-800
KimwipesKimwipes
Упаковочный инструментBruker
Pen-StrepGibco15140-122
Порошкообразный PBSVWRVWRRV0780
Протонированный PBSGibco10010-023
Силиконовая пробкаBrukerB7089
Стандартные сосудистые щипцы
Tryp-LGibco12605010
C010P005 для снятия колпачка Sharpie

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
  2. Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
  3. Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
  4. Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
  5. Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
  6. Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
  7. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  8. Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
  9. Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
  10. Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
  11. Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
  12. Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
  13. Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
  14. Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
  15. Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928(2015).
  16. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
  17. Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
  18. Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717(2019).
  19. Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
  20. Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
  21. Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
  22. Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
  23. Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
  24. Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
  25. Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
  26. Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
  27. Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
  28. Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Sample LoadingMagic Angle Spinning NMRDynamic Nuclear PolarizationCellular Viability PreservationLiquid Nitrogen TransferSapphire Rotor HandlingControlled Rate CoolingNMR Spectrometer OperationMammalian Cell CryopreservationSample Integrity Maintenance

Related Articles