Поколение динамических экологических условий с использованием микрофлюидного устройства с высокой пропускной способностью

Summary

Мы представляем микрофлюидную систему для высокой пропускной способности исследований на сложных жизненных механизмов, которая состоит из 1500 единиц культуры, массив расширенных перистальтических насосов и на месте смешивания модуль. Микрофлюидный чип позволяет проводить анализ очень сложных и динамичных микро-экологических условий in vivo.

Abstract

Имитация условий окружающей среды in vivo имеет решающее значение для исследований in vitro по сложному жизненному механизму. Тем не менее, современные методы ориентации живых клеток и органов либо очень дорого, как робототехника, или отсутствие нанолитрового объема и миллисекундной точности времени в жидких манипуляций. Здесь мы представляем дизайн и изготовление микрофлюидной системы, которая состоит из 1500 единиц культуры, массив расширенных перистальтических насосов и на месте смешивания модуль. Для демонстрации возможностей микрофлюидного устройства в предлагаемой системе поддерживаются сферы нервных стволовых клеток (НСК). Мы заметили, что, когда сфера НСК подвергается воздействию CXCL в день 1 и EGF в день 2, круглая конформация в хорошо поддерживается. Изменение порядка ввода 6 препаратов вызывает морфологические изменения в сфере НСК и репрезентативный маркер уровня экспрессии для стволов НСК (т.е. Hes5 и Dcx). Эти результаты свидетельствуют о том, что динамические и сложные условия окружающей среды имеют большое влияние на дифференциацию и самообувечение НСК, а предлагаемое микрофлюидное устройство является подходящей платформой для высокой пропускной способности исследований на сложном жизненном механизме.

Introduction

Высокие методы пропускной способности имеют решающее значение для биомедицинских и клинических исследований. Параллельно проводя миллионы химических, генетических или живых клеток и органоидных тестов, исследователи могут быстро определить гены, которые модулируют био-молекулярный путь, и настроить последовательные ввода наркотиков для своих конкретных потребностей. Робототехника¹ и микрофлюидные чипы в сочетании с программой управления устройством позволяют автоматизировать сложные экспериментальные процедуры, охватывающие манипуляции с клетками/тканями, обработку жидкости, визуализацию и обработку/контроль^{данных 2,3}. Таким образом, сотни и тысячи экспериментальных условий могут быть сохранены на одном чипе, в соответствии с желаемой^{пропускной способностью 4,5.}

В этом протоколе мы описали процедуру проектирования и изготовления микрофлюидного устройства, которое состоит из 1500 единиц культуры, массива усовершенствованные перистальтические насосы и на месте смешивания модуль. 2-уровневая камера клеточной культуры предотвращает ненужный слейр во время среднего обмена, что обеспечивает нетронутую культурную среду для долгосрочной визуализации живых клеток. Исследования показывают, что предлагаемое микрофлюидное устройство является подходящей платформой для высокой пропускной способности исследований на сложном жизненном механизме. Кроме того, расширенные характеристики микрофлюидного чипа позволяют автоматически воссоздать очень сложные и динамичные микроэнвиронные условия in vivo, такие как постоянно меняющиеся цитокины^{и лиганды композиций 6,7}, завершение которых занимает месяцы для обычных платформ, таких как 96-хорошо пластины.

Protocol

1. Конструкция микрофлюидных чипов

1. Дизайн микрофлюидного мультиплексера, состоящего из 18 входов, каждый из которых управляется отдельным клапаном и перистальтическим насосом. Для увеличения объема жидкости, обусловленной циклом перекачки, перистальтический насос состоит из 3 каналов управления, которые были специально расширены до 200 мкм, и 10 соединенных линий потока.
2. Дизайн камеры культуры, свободной от стрижки. Репликация 2-уровня культуры единицы состоит из нижней камеры культуры клеток (400 мкм х 400 мкм х 150 мкм) и более высокий буферный слой (400 мкм х 400 мкм х 75 мкм), который предотвращает нежелательные сляния нагрузки на клетки во время среднегообмена (рисунок 1).
3. Дизайн высокой пропускной способности. Дублируйте культурную единицу, чтобы сформировать матричную компоновку размером 30 х 50, занимая площадь размером примерно 7 см на 5 см.

2. Изготовление и эксплуатация чипов

1. Изготовление реплики литья с помощью УФ-литографии
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реплика литья была изготовлена на кремниевой пластины в соответствии со стандартным протоколом фотолитографии⁸.
   1. Изготовление структур канала
      1. Спиннинг фоторезистер: Спиновое пальто 5 мл СУ-8 3025 отрицательный фоторезист на кремниевой пластине при 500 об/мин при 10 с и 3000 об/мин за 30 с.
      2. Мягкая выпечка: Положите на плиту при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 минут, а затем 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, охладить его до комнатной температуры.
      3. Выравнивание и лечение: Исправить и маски на держатель выравнивателя и включите источник света для 18 с, чтобы вылечить подвергаются фоторезист.
      4. Предварительная экспозиция поста испечь: Ramp до до 95 градусов по Цельсию при температуре 110 градусов по Цельсию /ч от комнатной температуры и держать его по крайней мере 40 минут до удаления.
      5. Разработка: Опустите пластину в развивающийся раствор (разработчик СУ-8) и агитизируйте его за 2,5 мин, чтобы смыть лишнего фоторезистера и получить структуру канала высотой 25 мкм.
      6. Твердый выпекать: Обложка со стеклянной чашкой Петри и выпекать при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 минут, а затем нарастить до 160 градусов по Цельсию при температуре 120 градусов по Цельсию / ч и держать его в течение 3 часов.
   2. Изготовление камеры клеточной культуры с буферным слоем
      1. Используйте параметры шага 2.1.1.1,1, чтобы вращать пальто 7 мл отрицательной фоторезистерии СУ-8 3075 на вышеуказанной пластине.
      2. Мягкая выпечка (описанная в шаге 2.1.1.2) и изменить маску, чтобы выровнять хорошо с маркерами на пластине. Затем включите источник света для 24 с, чтобы вылечить подвергаются фоторезистер.
      3. Опустите пластину в развивающийся раствор (разработчик SU-8) и агитировать его в течение 4 минут и 40 секунд, чтобы смыть избыточный фоторезист и получить 75 мкм высокой структуры слоя, что вокруг 25 мкм-высокой структуры канала сфабрикованы раньше. Твердый выпекать (описанный в шаге 2.1.1.6), чтобы сделать сложную структуру сильнее.
      4. Повторите шаги 2.1.2.1-2.1.2.3, чтобы сфабриковать структуру камеры высотой 75 мкм, которая укладывается на структуру слоя.
   3. Изготовление конструкций клапана
      1. Используя параметр шага 2.1.1.1.1, чтобы вращать пальто 5 мл положительной фоторезистерзиста АЗ 50x на вышеуказанной пластине.
      2. Мягкая выпечка (описано в шаге 2.1.1.2) и сделать маску выровнены хорошо с маркерами на пластине, а затем сохранить источник света на 20 с и сразу же в течение 30 с. Повторите свет на / выключить процедуру в 5 кругах, чтобы вылечить подвергаются фоторезист.
      3. Опустите пластину, чтобы соответствовать разработчику и агитировать его в течение 8 минут, чтобы смыть избыточный фоторезистент и получить круглые клапаны, которые перекрываются с каналами управления, чтобы обеспечить хорошее соединение. Твердый выпекать (описанный в шаге 2.1.1.6) узорчатые, чтобы сделать всю модель сильнее.
2. Производство микрофлюидных чипов с использованием мягкой литографии
   1. Лечить узорчатые и пустые кремниевые с rimethylchlorosilane в течение 15 мин.
   2. Приготовьте 3 порции геля PDMS (10:1 соотношения мономер/катализатор), соответствующие 50 г слоя потока, 20 г контрольного слоя 2 и 20 г мембраны соответственно.
   3. Бросьте 50 г геля PDMS на узорчатую кремниевую пластину и де-газ их в течение 1-2 часов в вакуумной камере при -0.85 MPa для копирования слоя потока.
   4. Дега 2 порции 20 г PDMS и спина его на узорчатой пластины и пустой кремниевой пластины на 2000-2800 об /мин для 30 с, чтобы подготовить контрольный слой и мембранный слой.
   5. Поместите, покрытые PDMS, в вентиляционную духовку на 60 минут при температуре 80 градусов по Цельсию для инкубации.
   6. Выравнивание и связь различных слоев вместе с помощью индивидуального оптического устройства (зум в 100x) и плазмы травления машины. Затем держите его в вентиляционой духовке в течение 2 часов при температуре 80 градусов по Цельсию, чтобы усилить склеивание чипа.
   7. Удар вход отверстия на чипе, а затем склеить его на PDMS покрытием coverslip и вылечить, по крайней мере 12 часов при 80 градусов по Цельсию перед использованием.
3. Чип операции
   1. Подключите миниатюрные пневматические соленоидные клапаны к контрольному слою чипа и откройте индивидуальный графический пользовательский интерфейс^{MATLAB 8 для} связи и управления коммутатором.
   2. Установите давление закрытия отжимаемых мембранных клапанов PDMS до 25 пси.
   3. Доставка динамически изменяющихся комбинаторных/последовательных входов в назначенные камеры(рисунок 2d)путем своевременного выключа клапанов.

3. Генерация динамических входных данных в клеточном микроокантиронии

1. Чип лечения и загрузки клеток
   1. Поддержание стандартных культурных условий (37 градусов по Цельсию, 5% CO₂) на микроскопе в течение не менее 5 часов.
   2. Заполните чип средой покрытия (т.е. упомянутой в ПРИМЕЧАНИЕ) и инкубировать его в стандартных условиях культуры (описанных в шаге 3.1.1) в течение по крайней мере одного часа.
   3. Промыть чип фосфат-буфером солевого раствора (PBS) или клеточной культуры среды (Dulbecco в модифицированной иглы среды, DMEM), чтобы построить здоровую культурную среду.
   4. Клетки сбора урожая на 80% соток и повторное использование клеток с помощью культурных средств массовой информации (DMEM) при плотности 10^6/мл. Затем загрузите ячейки в чип, давя на клеточный раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование различных клеточных линий на чипе требует соответствующего покрытия среды для лечения камеры клеточной культуры. Как правило, для экспериментов на фибробласте 3Т3 и адептской культуре курицы открыты все клапаны, контролирующие культурные камеры, клетки втекают во все культурные камеры в пределах одной колонки.
2. Настройка для высокой пропускной способности живоклеточной визуализации
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений использовался перевернутый микроскоп с автоматизированной этапом перевода и цифровая дополнительная полупроводниковая камера с оксидом металла (CMOS). Этап и приобретение изображений контролировались с помощью индивидуального программного обеспечения.
   1. Визуализуйте матрицу культурных камер с помощью 10-х объективных объективов в ярком поле для подтверждения и определения координат расположения каждой камеры матрицы 30 на 50 камер.
   2. Преобразуй объектив цели в 20x или 40x, затем выберите координаты местоположения нужной камеры и этап перевода перемещается в заданное положение после подтверждения. Тонкая настройка x, y, z фокусной плоскости, чтобы получить оптимальное изображение.
   3. Оптимальная интенсивность света, время разоблачения и другие изображения определялись индивидуально для каждого канала (т.е. ярко-полевые и флуоресцентные изображения).
   4. Установите интервал и продолжительность цикла визуализации, сохраните путь, а затем начните визуализацию.

Results

Обычный перистальтический насос на чипе был впервые описан Стивеном Кваке в 2000 году, с помощью которого перистализ был активирован шаблоном 101, 100, 110, 010, 011, 001 ^8,10. Число 0 и 1 указывает на "открытое" и "закрытие" 3 горизонтальных линий управления. Исследования с использованием более 3 клапанов (например, пять) также были зарегистрированы¹¹. Несмотря на то, что перисталтический насос, состоящий из 3 линий управления и 3 линий п...

Discussion

Разработаны различные микрофлюидные устройства для выполнения мультиплексированных и^{сложных экспериментов 17,18,19,20.} Например, микроуэллы из массива топологических углублений могут ловушку отдельных клеток без использования внешней силы, показывая выгодные символы, включая небольшой размер выборки, параллелизация, более низкая стоимость материала, более быстрая^{реакция, высок...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2713 Loker Avenue West	Torrey pines scientific
AZ-50X	AZ Electronic Materials, Люксембург
Хлортриметилсилан (TMCS) 92360-25mL	Sigma
CO2 инкубатор HP151	Heal Force
Настольный дырокол для чипов PDMS WH-CF-14	Сучжоу Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM (L-глутамин, высокий уровень глюкозы, henol Red)	Invitrogen
UTP-313 Max: 600 г, e: 0,1 г, d: 0,01 г	Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co., LTD.
FBS	Sigma
Fibronection 0,25 мг/мл	Millipore, Австрия
Glutamax 100x	Gibco
Нагревательный инкубатор BGG-9240A	Shanghai bluepard instruments Co., Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E	Nikon
Pen/Strep 10 единиц/мл Пенициллин 10 мкг/мл Стрептомицин	Инвитроген
Очиститель плазмы PDC-002	Harrick Плазменный
(PDMS)	Momentive
полилизин 0,01%	Sigma
Spin Coater ARE-310	Awatori Rentaro
Spin Coater TDZ5-WS	Cence
Spin Coater WH-SC-01	Сучжоу Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025	MicroChem, Вестборо, Массачусетс, США
SU-8 3075	MicroChem, Вестборо, Массачусетс, США