Методическая статья

Визуализация кальцитонина Гена связанных пептид иммунореактивной иннервации Крыса Краниал Дура Матер с иммунофторесценции и нейронной трассировки

DOI:

10.3791/61742

⸱

6 января 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для визуализации пространственной корреляции кальцитонина гена связанных пептид (CGRP)-иммунореактивных нервных волокон и кровеносных сосудов в черепно-мозговой матер с использованием иммунофторесценции и флуоресцентной гистохимии с CGRP и фаллоидин, соответственно. Кроме того, происхождение этих нервных волокон было ретроградным, прослеживаемым с помощью флуоресцентного нервного трассировщика.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью данного исследования было изучение распределения и происхождения пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP)-иммунореактивных сенсорных нервных волокон черепной мозговой оболочки с использованием иммунофторесценции, трехмерной (3D) реконструкции и ретроградной техники отслеживания. Здесь нервные волокна и кровеносные сосуды были окрашены с помощью иммунофлуоресценции и гистохимии методы с CGRP и флуоресцентный фаллоидин, соответственно. Пространственная корреляция дюральных CGRP-иммуореактивных нервных волокон и кровеносных сосудов была продемонстрирована 3D-реконструкцией. Между тем, происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон были обнаружены нервной техники отслеживания с фторгольдом (FG) из области вокруг средней менингеальной артерии (MMA) в черепной dura mater к тригеминальной ганглиона (TG) и шейки матки (C) спинного корня ганглиев (DRGs). Кроме того, были также изучены химические характеристики нейронов, помеченных FG в TG и DRG, а также CGRP с использованием двойных иммунофлюоресценций. Воспользовавшись прозрачным образцом цельного монтажа и 3D-реконструкцией, было показано, что CGRP-иммунореактивные нервные волокна и артериолы с маркировкой фаллоидин работают вместе или отдельно образуют дурную нейрососудикулярную сеть в 3D-виде, в то время как FG-помеченные нейроны были найдены в офтальмологических, челюстно-челюстных и мандибулярной ветвях TG, а также C2-3 DRGs ipsilateral в сторону применения трассировщика, в котором некоторые из FG-помеченных нейронов, представленных с CGRP-иммунореактивным выражением. С помощью этих подходов мы продемонстрировали распределительные характеристики CGRP-иммунореактивных нервных волокон вокруг кровеносных сосудов в черепной матер-дуре, а также происхождение этих нервных волокон из ТГ и ДРГ. С точки зрения методологии, это может стать ценным справочником для понимания сложной нервно-мышечной структуры мозговой мозговой оболочки при физиологическом или патологическом состоянии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Черепная dura mater является внешним слоем опоясывания для защиты мозга и содержит обильные кровеносные сосуды и различные видынервных волокон 1,2. Многие исследования показали, что сенсибилизированные черепные dura mater может быть ключевым фактором, ведущим к возникновению головных болей, с участием ненормальной вазодилатации и иннервации3,4,5. Таким образом, знание нервно-мышечной структуры в черепной dura mater имеет важное значение для понимания патогенеза головных болей, особенно при мигрени.

Хотя иннервация дуры ранее изучалась с помощью обычной иммуногистохимии, пространственная корреляция нервных волокон и кровеносных сосудов в черепной мозговой оболочкебыла менее изучена 6,7,8,9. Для того, чтобы выявить dural нервно-сосудистой структуры более подробно, кальцитонин гена связанных пептид (CGRP) и фаллоидин были выбраны в качестве маркеров для соответственно окрашивания дюрал нервных волокон и кровеносных сосудов в цельно-монтажной черепной dura матер с иммунофлуоресценции и флуоресцентнойгистохимии 10. Это может быть оптимальным выбором для получения трехмерного (3D) взгляда на нервно-мышечную структуру. Кроме того, флюорогольд (FG) был применен на области вокруг средней менингеальной артерии (MMA) в черепной dura mater, чтобы определить происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон, и прослеживается в тригеминальный ганглий (TG) и шейки матки (C) спинной корневой ганглии (DRG), в то время как FG-помечены нейроны были дополнительно изучены вместе с CGRP.

Целью данного исследования было обеспечить эффективный инструмент для исследования нервно-мышечной структуры в черепной dura mater для CGRP-иммунореактивной иннервации и ее происхождения. Воспользовавшись прозрачной цельно-монтировкой dura mater и сочетая иммунофлуоресценцию, ретроградное отслеживание, конфокальные методы и 3D-реконструкцию, мы ожидали представить новый 3D-вид нервно-мышечной структуры в черепной мозговой матер. Эти методологические подходы могут быть дополнительно служил для изучения патогенеза различных головных болей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было одобрено Комитетом по этике Института иглоукалывания и Moxibustion, Китайская академия китайских медицинских наук (справочный номер D2018-09-29-1). Все процедуры были проведены в соответствии с Руководством национальных институтов по охране здоровья и использованию лабораторных животных (Национальная академия прессы, Вашингтон, D.C., 1996). В этом исследовании были использованы 12 взрослых самцов крыс Спраг-± (вес 220 и 20 г). «Лицензионный номер SCXK (JING) 2017-0005» были предоставлены Национальными институтами по контролю за продуктами питания и наркотиками.

1. Внутреннее иннервация крысиной черепной dura mater

  1. Перфузионы
    1. Интраперитонально вводить передозировки триброметанола раствор (250 мг/кг) к крысе, чтобы вызвать эвтаназию.
    2. Как только дыхание останавливается, транскардиально пронизывать с 100 мл 0,9% нормального солевого раствора следуют 250-300 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфат буфера (PB, pH 7.4).
    3. После перфузии, удалить кожу головы и открыть череп, чтобы разоблачить dura матер и спинной стороне мозга. Затем вскрыть черепный dura mater вдоль ствола мозга к обонятельной лампы в цельно-монтаж шаблон (Рисунок 1). Выполните постфиксацию в 4% параформальдегиде в течение 2 ч, а затем криопротектор в 25% сахарозы в 0,1 М ПБ более чем на 24 ч при 4 градусах Цельсия.
  2. Флуоресценция иммуногистохимия для маркировки CGRP и фаллоидин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сочетание флуоресцентного окрашивания CGRP и фаллоидин был применен, чтобы выявить пространственную корреляцию волокон дюрального нерва и кровеносных сосудов в крысиной черепной dura mater в все-монтаж картины.
    1. Промыть черепную матер дура в 0,1 М ПБ около 1 мин.
    2. Инкубировать dura mater в блокирующий раствор, содержащий 3% нормальной сыворотки осла и 0,5% Triton X-100 в 0,1 М ПБ в течение 30 мин.
    3. Передача dura mater в мышь анти-CGRP антитела (1:1000) в 0,1 М ПБ, содержащий 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Тритон X-100 ночь при 4КК 11.
    4. Вымойте dura mater три раза в 0.1 M PB на следующий день.
    5. Инкубировать dura mater в смешанном растворе осла анти-мышь Alexa Fluor 488 вторичных антител (1:500) и фаллоидин 568 (1:1000) в 0,1 М ПБ, содержащих 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Triton X-100 для 1,5 ч при комнатной температуре (26 градусов по Цельсию).
    6. Вымойте dura mater три раза в 0,1 М ПБ.
    7. Обрезать края и установить его на слайды микроскопа (см. Таблицу материалов).
    8. Положите на крышки с 50% глицерина до наблюдения.
  3. Наблюдение и запись
    1. Наблюдайте за флуоресцентными образцами под флуоресцентным микроскопом или системой конфокальных изображений.
    2. Возьмите изображения цельно-монтировать dura mater флуоресцентным микроскопом, оснащенным цифровой камерой (4x, NA: 0.13), и использовать время экспозиции 500 мс. Мозаика изображения dura mater была завершена с програмным обеспечением флуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).
    3. Сделайте снимки CGRP-иммунореактивных нервных волокон и фаллоидин-маркированы кровеносные сосуды в dura матер с помощью конфокального микроскопа. Возбуждение и выброс длин волн были 488 нм (зеленый) и 594 нм (красный). Конфокальный пинхол составляет 110 (20x) и 105 мкм (40x). Разрешение захвата изображения составляет 640 х 640 пикселей.
    4. Захват 20 изображений в 2 мкм кадры из каждого 40 мкм толщиной раздела и выполнять одну в фокусе интеграции изображения с конфокальной обработки изображений, связанных с программной системой для 3D-анализа следующим образом: Установить Start Focal Plane | Установить конец координационного самолета | Установите размер шага | Выберите глубину шаблона | Захват изображения | Серия no.
    5. Используйте программное обеспечение для редактирования фотографий, чтобы настроить яркость и контрастность изображений для оптимизации визуализации. Обратите внимание на то, чтобы не удалять данные из изображений.

2. Ретроградное исследование трассировки с FG

  1. Хирургические процедуры
    1. Определите область координат, представляющих интерес в крысиной черепной dura mater.
    2. Приготовьте микро-шприц в 10 йл и проверьте его с жидким парафином.
    3. Анестезия крыс с триброметанол раствором (150 мг/кг) с помощью внутриперитонеальной инъекции. Проверьте глубину в анестезии из-за отсутствия реакции на щепотку нота.
    4. Бритье головы крысы с электрической бритвой.
    5. Положите тупые ушные батончики крысе и поместите его на стереотаксис устройства. Затем положите держатель рта и нанесите офтальмологическую мазь на глаза.
    6. Очистите хирургическое место кожи головы с помощью 10% йода повидоне, за которым следует 75% этанола.
    7. Сделайте разрез вдоль средней линии кожи головы.
    8. Тупо удалить периостея и мышечные ткани от черепа с помощью стерильных хлопка наконечником аппликаторов (Рисунок 1A).
    9. Просверлите небольшое отверстие (5-7 мм) с помощью заусенцев с круглым кончиком бита (#106) на левой теменной и височной кости выше ММА12, и убедитесь, что черепный dura mater был сохранен нетронутым(рисунок 1B).
    10. Построить банк вокруг отверстия с зубным силикатным цементом, чтобы ограничить распространение трассировщика (Рисунок 1C).
    11. Добавьте 2 МКЛ 2% FG в отверстие вокруг ММА с микро-шприцем 10 йл(рисунок 1D).
    12. Обложка отверстие с небольшим куском гемостатической губкой.
    13. Положите кусок парафиновой пленки на отверстие и запечатать края костным воском, чтобы предотвратить утечку трассировщика и избежать загрязнения окружающих тканей.
    14. Шов раны стерильной нитью.
    15. Держите крыс в теплой области, пока они полностью выздоровели.
    16. Верните крыс обратно в свои клетки и добавить антибиотик и анальгетики в питьевую воду.
  2. Перфузии и секции
    1. После 7 дней выживания, пронизыть этих крыс, как упоминалось выше в процедурах в разделе 1.1.
    2. Рассекают TG и C1-4 DRGs, затем после исправления и криопротезируют их, как упоминалось выше в разделе 1.1.3(рисунок 1F).
    3. Вырежьте TG и DRG толщиной 30 мкм на системе микротома криостата в сагиттальной направлении и установленные на стеклянных слайдах с силаном.
  3. Двойные иммунофлюоресценции для маркировки FG- и CGRP в TG и DRG
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя FG-маркировка может быть непосредственно наблюдается с УФ-освещением под ртутнойлампой без дополнительного окрашивания 13,14,15,16, помеченные нейроны с FG были дополнительно изучены в TG и цервикальных DRGs с использованием двойных иммунофлюоресценций с FG и CGRP для выявления происхождения dural CGRP-иммунореактивных нервных волокон в TG и DRG.
    1. Объехать секции гистохимической ручкой.
    2. Инкубировать секции в течение 30 мин в блокирующий раствор, содержащий 3% нормальной сыворотки осла и 0,5% Triton X-100 в 0,1 М ПБ.
    3. Передача образцов в раствор кролика анти-фторголд (1:1000) и мыши анти-CGRP антитела (1:1000) в 0,1 М ПБ, содержащих 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Тритон X-100 ночь при 4 градусов по Цельсию.
    4. Вымойте секции три раза в 0,1 М ПБ на следующий день.
    5. Инкубировать в смешанном растворе осла анти-кролик Alexa Fluor 594 (1:500) и осла анти-мышь Alexa Fluor 488 (1:500) вторичные антитела в 0,1 М ПБ, содержащие 1% нормальной сыворотки осла и 0,5% Тритон X-100 для 1,5 ч при комнатной температуре.
    6. Вымойте и примените крышки к разделам в качестве процедур в шагах 1.2.6 и 1.2.8.
  4. Наблюдение и запись
    1. Сделайте снимки нейронов с маркировкой FG в TG и DRG под ультрафиолетовым освещением с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровой камерой.
    2. Захват изображений FG- и CGRP помечены нейронов в TG и DRGs под флуоресцентным микроскопом оснащен цифровой камерой.
    3. Используйте программное обеспечение для редактирования, чтобы настроить яркость и контрастность изображений и добавить метки на изображениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейрососудистая структура черепной мозговой оболочки
После иммунофлуоресцентного и флуоресцентного гистохимического окрашивания CGRP и фаллоидином, CGRP-иммунореактивные нервные волокна и фаллоидин помеченные дуральные артериолы и соединительные ткани были четко продемонстрированы по всей цельно-монтирующей черепной dura mater в 3D-образной картине(рисунок 2C,D,E,F). Было показано, что как толстые, так и тонкие CGRP-иммуно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы успешно продемонстрировали распределение и происхождение CGRP-иммунореактивных нервных волокон в черепной дюра-матер с использованием иммунофторесценции, 3D реконструкции и нейронных подходов к отслеживанию с антителами CGRP и FG нейронным трассировщиком, обеспечивая гистологические и химические данные, чтобы лучше понять dural нейрокулярной сети.

Как известно, CGRP играет решающую роль в патогенеза мигрени4,17. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано проектом Национальной ключевой программы НИОКР Китая (Проектный кодекс No 2019YFC1709103; No 2018YFC1707804) и Национального фонда естественных наук Китая (Проектный кодекс No 81774211; No 81774432; No 81801561).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)Invitrogen от Thermo Fisher ScientificA21202Защита от света; RRID: AB_141607
Прибор для стереотаксиса головного мозгаNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Программное обеспечение флуоресцентного микроскопа
Конфокальная система визуализацииOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Защита от света
Флуоресцентная система визуализацииOlympusBX53
Замораживающий микротомThermoMicrom International 
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympus Version 4.2Программная система обработки конфокальных изображений
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Нормальная ослиная сывороткаJackson ImmunoResearch017-000-121
Фаллоидин 568Молекулярный& НБСП; ЩупыА12380Защитить от света
Photoshop и  ИллюстрацияAdobeCS6Программное обеспечение для редактирования фотографий
Rabbit anti- FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus предметные стекла для микроскопаThermo#4951PLUS-00125x75x1 мм
GmbH

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6(2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861(2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fluorogold3Dmounts whole mount

Похожие статьи