Методическая статья

Трансплантация внутримякардных инъекций MSC-Loading инъекционных гидрогелей после инфаркта миокарда в модели Murine

DOI:

10.3791/61752

⸱

20 сентября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Institute for Intractable Disease, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 3Division of Cardiology, Department of Internal Medicine, Uijeongbu St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапия на основе стволовых клеток стала эффективной стратегией восстановления поврежденных сердечных тканей после инфаркта миокарда. Мы обеспечиваем оптимальное применение in vivo для трансплантации стволовых клеток с использованием желатиновых гидрогелей, которые могут быть энзиматично взаимосвязаны.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одной из основных проблем, стоящих перед текущей сердечной терапии стволовыми клетками для предотвращения постинфарктной сердечной недостаточности является низкая задержка и выживаемость пересаженных клеток в рамках травмированного миокарда, ограничивая их терапевтическую эффективность. В последнее время использование строительных биоматериалов привлекло внимание к улучшению и максимизации терапии стволовыми клетками. Цель этого протокола заключается в внедрении простого и простого метода трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (MSCs) с использованием инъекционных гидроксифенилпионовой кислоты (GH) гидрогелов; гидрогели являются благоприятными в качестве платформы доставки клеток для сердечной ткани инженерных приложений из-за их способности быть взаимосвязаны на месте и высокой биосовместимости. Мы представляем простой метод для изготовления MSC-загрузки гидрогели GH (MSC/гидрогели) и оценки их выживания и распространения в трехмерной (3D) культуре in vitro. Кроме того, мы демонстрируем методику внутримиокардной трансплантации MSC/гидрогели у мышей, описывающую хирургическую процедуру для индуцирования инфаркта миокарда (МИ) через перевязку коронарной артерии левой передней части (LAD) и последующую трансплантацию MSC/hydrogels.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапия стволовыми клетками сердца стала потенциальным подходом к ремонту и регенерации миокарда1,2. Несмотря на недавние положительные результаты в животных моделях и клинических испытаниях, применение терапии на основе стволовых клеток для восстановления миокарда ограничено из-за низкого удержания и плохого выживания инъекционных клеток в инфарктных тканяхсердца 3,4. В результате, использование клеточной инженерии тканей, в том числе инъекционныхбиоматериалов 5,сердечные пятна 6, иклеточные листы 7, был интенсивно изучен для улучшения удержания клеток и интеграции в принимающей миокарда.

Среди различных потенциальных подходов к биоинженерной сердечной ткани ремонт, инъекционные гидрогели в сочетании с соответствующими типами клеток, таких как мезенхимальные стволовые клетки (MSCs), эмбриональных стволовых клеток (ESCs), и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), являются привлекательным вариантом для эффективной доставки клеток в миокардарегионах 8,9. Gelatin, известный натуральный полимер, может быть использован в качестве инъекционной матрицы из-за его большой биосовместимости, значительной биоразлагаемости и снижения иммуногенности по сравнению с широким спектром биоматериалов, используемых в биомедицинских приложениях. Хотя инъекционные платформы на основе желатина имеют большой потенциал, их применимость in vivo остается ограниченной в зависимости от их низкой механической жесткости и легкой деградируемости в физиологической среде.

Для преодоления этих ограничений для применения in vivo была предложена новая и простая конструкция гидрогеля на основе желатина, состоящего из гидроксифенил-пропионовой кислоты. Конъюгирует желатин-гидроксифенил пропионовая кислота (GH) может быть взаимосвязана на месте в присутствии фермента, пероксидазы хрена (HRP), а затем инкапсулировать различные препараты, биомолекулы, или клетки в гидрогеле, предлагая большой потенциал вобласти тканевой инженерии приложений 10,11,12,13,14. Кроме того, мы недавно исследовали терапевтические эффекты гидрогели GH, содержащие инкапсулированные MSCs и продемонстрировали их использование в успешном ремонте сердца и регенерации после MI в моделиmurine 15. В этом протоколе мы описываем простой метод инкапсуляции и трехмерного (3D) распространения ПМС в гидрогелях GH. Мы также вводим хирургическую процедуру, предназначенную для генерации модели murine MI с помощью перевязки коронарных артерий и внутримиокардной трансплантации гидрогеля MSC-загрузки GH в инфарктное сердце.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры исследования животных были предоставлены в соответствии с Законом о защите лабораторных животных, Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и Руководящими принципами и политикой экспериментов на грызунах, предоставленными Комитетом по институциональному уходу за животными и использованию (IACUC) в Медицинской школе Католического университета Кореи.

1. Подготовка MSCs и инъекционных гидрогелей желатина

  1. Культура MSCs в 100 мм культуры блюдо при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Когда рост MSCs достигает 80% слияния, мыть блюдо дважды с DPBS и добавить 1 мл трипсина-заменителя при 37 градусов по Цельсию в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MSCs были изолированы от мурин костногомозга после обычных процедур 16, культурных в Dulbecco в модифицированных Eagle's Medium (DMEM), содержащий 10% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотика антимикотического раствора, и используется между проходом 7'u20129 для этого исследования.
  2. Добавьте 9 мл среды культуры и центрифугу при 500 x g в течение 3 мин. Затем отбросьте полученный супернатант, повторно помеская клетки в 1 мл PBS, и поддерживайте подвеску клетки на льду.
  3. Разбавить 10 МКЛ клеточной подвески с 10 МКЛ трипан синий и получить концентрацию клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток.
  4. Повторное приостановление и передача MSCs в 1 мл трубки при плотности 1 х 107 клеток / мл.
  5. Подготовьте 6,25 wt% GH конъюгированных растворов в PBS и разделите на 2 флакона. Далее смешайте решения GH либо с 6 мкг/мл HRP (GH-решение A), либо с 0,07 вт% H2O2 (GH-решение B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка желатин-гидроксифенил пропионовая кислота (GH) конъюгации в соответствиис опубликованными протоколами 12,15.
    1. Держите 9:1 объемное соотношение GH конъюгированных решение HRP (GH решение A) и GH конъюгации решение H2O2 (GH решение B), соответственно.
  6. Перед смешиванием MSCs с раствором GH A, кратко центрифуга клеточной подвески на 1000 х г и тщательно аспирировать в результате supernatant. Впоследствии смешайте гранулы, содержащие MSCs, с решением A.

2. На месте MSC-загрузка и трехмерная культура in vitro

  1. Загрузите GH-решение A (содержащее MSC) и GH-решение B в обе стороны двойного шприца. Плита 300 МКЛ комбинированных решений GH с MSCs при конечной плотности 5 х 106 ячеек/мл на восьми-хорошо камерный слайд.
  2. После формирования гидрогеля на месте и последующей инкапсуляции MSC с помощью энзиматических перекрестных ссылок добавьте 700 МЛ DMEM, содержащий 10% FBS и 1% антибиотико-антимикотический раствор.
  3. Инкубировать слайд при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 и заменить культуру среды каждые 2'u20123 дней.

3. Подтверждение пролиферации in vitro и выживания MSCs в гидрогелях GH

  1. Чтобы определить жизнеспособность 3D культурных MSCs в гидрогели GH, используйте живой / мертвой клетки окрашивания анализ после предопределенного времени инкубации.
  2. После инкубации инкапсулированных MSCs в гидрогелях GH в течение 3, 5, 7 или 14 дней, аспирировать средний и мыть хорошо дважды с PBS.
  3. Подготовь окрашивающий раствор, содержащий 5 МКЛ кальцеина AM и 20 МКЛ этидийного гомодимера-1 (EthD-1) в 10 мл DPBS.
  4. Добавьте 200 МКЛ раствора окрашивания в колодец и инкубировать в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.
  5. Аспирировать окрашивание раствор и мыть хорошо дважды с PBS.
  6. Аккуратно отделяйте камеру от горки и поместите полную крышку над гидрогелями GH. Используйте конфокаленную микроскопию для визуализации степени пролиферации и морфологических изменений инкапсулированных MSC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные изображения были приобретены под 200x увеличение и изображены на возбуждение / выброс длин волн 470/540 нм для кальцина и 516/607 нм для EthD-1.

4. Индукция инфаркта миокарда у мышей

  1. Обезболить 7-недельного самца C57BL/6 мышей (20-201222 г) с внутриперитонеальной инъекцией смеси золетил (30 мг/кг) и Ромпуна (10 мг/кг) в солевом растворе.
  2. Перед операцией, depilate груди мыши с помощью крема для удаления волос и стерилизовать кожу с йодом.
  3. Поместите мышь на операционный стол и используйте, вставив катетер в трахею, чтобы обеспечить дополнительный кислород через механическую вентиляцию.
  4. Аккуратно прорезать кожу хирургическими ножницами, а затем проникнуть в межреберные мышцы микро ножницами. Отделяйте 2-е и 3-е левые ребра, используя 5-0 шелковый шов для поддержания открытой грудной полости.
  5. Тщательно ligate левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии с помощью держателя иглы с 8-0 полипропиленовый шов и вырезать шов с помощью электрокаутерии.
  6. Наблюдайте немедленное изменение цвета в передней левой желудочковой стенке.

5. Интрамиокарда трансплантации MSC-загрузки GH гидрогели

  1. После индуцирования инфаркта миокарда по перевязки LAD, ввимите 10 МКЛ растворов MSC-загрузки GH в две разные точки в зоне пересечения границы (всего: 2 x 105 MSCs/20 L) с помощью двойного шприца, оснащенного иглой 26G.
    1. Следуя той же процедуре, описанной в шаге 1, подготовьте и перенесите решения MSC-loading GH в двойной шприц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки engraftment MSC-загрузки ГХ гидрогели в пределах infarcted области, MSCs и GH конъюгации были предварительно помечены PHK26 и фторсейна изотиоцианат (FITC), соответственно.
  2. Восстановить открытую полость грудной клетки и закрыть мышцы и кожу с помощью 5-0 швов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед закрытием грудной клетки удалите воздух с помощью катетерного шприца.
  3. Удалите трахею трубки и поместите мышь в клетку под инфракрасной лампой во время восстановления.
  4. При послеоперационной анальгезии вводят подкожные инъекции кетопрофена (5 мг/кг в день) не менее 72 ч. Все мыши должны быть тщательно проверены в течение соответствующего времени, чтобы обеспечить надлежащее восстановление после хирургических процедур, а также адекватное лечение боли.

6. Эхокардиография

  1. Через четыре недели после трансплантации, первоначально анестезировать мышь с 5% изофлюран, а затем настроить концентрацию изофлюрана до 1%.
  2. Депилировать грудь с помощью крема для удаления волос и поместить мышь на грелку. Нанесите ультразвуковой трансдуцерный гель на грудную клетку.
  3. Приобретайте двухмерные парастеральные короткие виды оси и записыв трассировки M-режима на уровне папиллярной мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите линейный предуцер массива (7'u201215 МГц) в левой парастральной линии и просмотрите анатомические структуры.
  4. Измерьте соответствующие линии для LVAW, LVID и LVPW, чтобы получить толщину сердечной стенки, размер камеры и дробное сокращение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сравните сердечную функцию, включая фракцию выброса (EF), дробное сокращение (FS) и энд-систолический объем (ESV) на уровне папиллярной мышцы, чтобы обеспечить надлежащую оценку в том же анатомичном месте.

7. Гистологическая оценка

  1. В заранее определенное время после трансплантации MSC-загрузки ГХ гидрогели в infarcted сердце, усытворить мышь в камере CO2 и собрать сердце для гистологического анализа15.
  2. Для окрашивания гематоксилина и эозин (Н И Е) и трихрома Массона (МТ) зафиксировать расчлененные ткани сердца в 4% параформальдегиде (PFA) и встроить в парафин. Далее, вырезать парафин встроенных блоков сердца на 4 мкм серийных разделов с помощью микротомы и пятно разделов с пятном МТ в соответствии со стандартнымипротоколами 17.
  3. Приобретайте изображения на сканере слайдов при 20-м увеличении и вычисляйте размер инфаркта групп лечения.
    Размер инфаркта (%) - общая окружность инфаркта / общая окружность LV x 100
  4. Рассчитайте оба окружности путем измерения средней линии длины. Для LV средней окружности, измерить центральную длину между эндокарда и эпикардиальных поверхностей. Для средней линии инфаркта, измерить длину инфаркта, включая более 50% от всей толщины миокарда18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все анализы изображений были проведены с использованием программного обеспечения ImageJ.
  5. Измерьте толщину стенки шрама на уровнях сосоляных мышц.
  6. Рассчитайте фракцию коллагеновой области.
    Область коллагена (%) - общая площадь интерстициального фиброза/миоцитов x 100

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для эффективной доставки MSC к инфаркту миокарда в этом протоколе использовались кросс-связуемые гидрогели MSC-загрузки на месте. До трансплантации in vivo, распространение и выживание MSCs в гидрогелях GH были подтверждены 3D in vitro живой /мертвой клетки окрашивания анализа (живой: зеленый; мертвый: красный). Как показано на рисунке 2, репрезентативные изображения выставлены достаточное распространение MSCs, показывая разветвленные сети в гидрогелях GH. Кроме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инъекционные гидрогели GH имеют большой потенциал для in vivo приложений из-за их способности однородно включать различные терапевтические агенты на месте. Кроме того, их физическими и биохимическими свойствами можно легко манипулировать на основе потребностей, зависящих от болезней. В этой связи, инъекционные гидрогели были предложены для решения основных ограничений в текущей сердечной терапии стволовыми клетками препятствует плохое выживание и удержание клеток (т.е. Lt; 10% в течение 24 ч после трансплантации) в

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить об этой работе.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование поддерживается Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемый Министерством образования (NRF-2018R1D1A1A02049346)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4 % параформальдегид (PFA)IntronIBS-BP031-2
5-0 шелковый шовный материалAILEESK534
8-0 полипропиленовый шовный материалETHICONM8732H
8-луночный камерный слайдNunc LAB-TEK154534
катетер Angiocath Plus (22GA)BD Angiocath PlusREF382423
Антибиотик-антимиокотикGibco15240-062
ЦентрифугаGYROGEN1582MGR
Конфокальный микроскопZeissLSM 510
Cover SlipeMARIENFELD101242
Deluxe Набор высокотемпературных прижиганийBovieQTY1
DMEMGibco11995-065
DPBSGibco14040-133
Двойной шприц
EOSINSIGMA-ALDRICH
ЭтанолEMSUREK49350783 739
FBSGibco16000-044
Fechtner щипцы для конъюнктивы титанWORLD PRECISISON INSTRUMENTSWP1820
Флуоресцеин изотиоцианат изомер I (FITC)SIGMA-ALDRICHF7250
ЩипцыHEBUHB0458
Крем для эпиляцииIldong Pharmaceutical
ГрелкаStoelting50300Система гомеотермического одеяла
50301Замена грелки для 50300 (10 X 12,5 см)
ГематоксилинSIGMA-ALDRICHHHS80
Перекись хрена (HRP; 250-330 Ед/мг)SIGMA-ALDRICHP8375
Перекись водорода (H2O2; 30 мас.% в H2O)SIGMA-ALDRICH216763
Набор
ThermoFisherR37601
Аппарат искусственной вентиляцииГарвардский аппарат
МикроцентрифугаHANILMicro 12
МикроиглодержательKASCO37-1452
МикроножницыHEBUHB7381
МикроскопOLYMPUSSZ61
MT набор для окрашиванияSIGMA-ALDRICHHT1079-1SETWeigert& rsquo; s раствор гематоксилина
железа HT15-1KTНабор для окрашивания трихрома (Masson) Парафин
LK LABKOREAH06-660-107
PBS буферGibco10010-023
Набор для окрашивания PHK26SIGMA-ALDRICHMINI26
Сканер слайдовLeicaSCN400
Хирургические ножницыHEBUHB7454
Хирургическая лента3M micopore1530-1
Тканевая кассетаScilab KoreaCas3003
Преобразователь гельSUNGHEUNGSH102
Форель-Барракер иглодержатель изогнутыйKASCO50-3710c
Ультразвуковая системаPhilipsAffiniti 50
XyleneJUNSEI25175-0430
HT110116 для окрашивания живых / мертвых клеток Iodine Green Pharmaceutical легких (Английский)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jhund, P. S., McMurray, J. J. Heart failure after acute myocardial infarction: a lost battle in the war on heart failure. Circulation. 118 (20), 2019-2021 (2008).
  2. Cahill, T. J., Kharbanda, R. K. Heart failure after myocardial infarction in the era of primary percutaneous coronary intervention: Mechanisms, incidence and identification of patients at risk. World Journal of Cardiology. 9 (5), 407-415 (2017).
  3. Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. npj Regenerative Medicine. 2, 17(2017).
  4. Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018, 1909346(2018).
  5. Alagarsamy, K. N., Yan, W., Srivastava, A., Desiderio, V., Dhingra, S. Application of injectable hydrogels for cardiac stem cell therapy and tissue engineering. Reviews in Cardiovascular Medicine. 20 (4), 221-230 (2019).
  6. Gaetani, R., et al. Epicardial application of cardiac progenitor cells in a 3D-printed gelatin/hyaluronic acid patch preserves cardiac function after myocardial infarction. Biomaterials. 61, 339-348 (2015).
  7. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circualtion Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
  8. Hasan, A., et al. Injectable Hydrogels for Cardiac Tissue Repair after Myocardial Infarction. Advanced Science. 2 (11), 1500122(2015).
  9. Wu, R., Hu, X., Wang, J. Concise Review: Optimized Strategies for Stem Cell-Based Therapy in Myocardial Repair: Clinical Translatability and Potential Limitation. Stem Cells. 36 (4), 482-500 (2018).
  10. Lee, Y., et al. In situ forming gelatin-based tissue adhesives and their phenolic content-driven properties. Journal of Materials Chemistry B. 1 (18), 2407-2414 (2013).
  11. Lee, Y., Bae, J. W., Lee, J. W., Suh, W., Park, K. D. Enzyme-catalyzed in situ forming gelatin hydrogels as bioactive wound dressings: effects of fibroblast delivery on wound healing efficacy. Journal of Materials Chemistry B. 2 (44), 7712-7718 (2014).
  12. Lee, S. H., et al. In situ Crosslinkable Gelatin Hydrogels for Vasculogenic Induction and Delivery of Mesenchymal Stem Cells. Advanced Functional Materials. 24 (43), 6771-6781 (2014).
  13. Jung, B. K., et al. A hydrogel matrix prolongs persistence and promotes specific localization of an oncolytic adenovirus in a tumor by restricting nonspecific shedding and an antiviral immune response. Biomaterials. 147, 26-38 (2017).
  14. Kim, G., et al. Tonsil-derived mesenchymal stem cell-embedded in situ crosslinkable gelatin hydrogel therapy recovers postmenopausal osteoporosis through bone regeneration. PLoS One. 13 (7), 0200111(2018).
  15. Kim, C. W., et al. MSC-Encapsulating in situ Cross-Linkable Gelatin Hydrogels To Promote Myocardial Repair. ACS Applied Bio Materials. 3 (3), 1646-1655 (2020).
  16. Meirelles Lda, S., Nardi, N. B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123 (4), 702-711 (2003).
  17. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), 2435-2443 (2008).
  18. Takagawa, J., et al. Myocardial infarct size measurement in the mouse chronic infarction model: comparison of area- and length-based approaches. Journal of Applied Physiology. 102 (6), 2104-2111 (2007).
  19. Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. Journal of the American College of Cardiology. 54 (17), 1619-1626 (2009).
  20. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell Therapy for Cardiovascular Disease: A Comparison of Methods of Delivery. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (2), 177-181 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи