Высокоразмерная проточная цитометрия для анализа иммунной функции рассеченных тканей имплантата

Достижения в области медицины привели к частому использованию имплантируемых материалов для поддержки функции или повторного роста поврежденных тканей ^1,2. К ним относятся такие устройства, как кардиостимуляторы, реконструктивные косметические имплантаты и ортопедические пластины, используемые для фиксации переломов костей ^3,4. Тем не менее, материалы, используемые для изготовления этих имплантатов, и места, в которые они имплантированы, играют важную роль в определении успеха этих имплантатов ^5,6,7. Будучи инородными телами, эти имплантаты могут вызывать иммунный ответ со стороны хозяина, который может привести либо к отторжению, либо к толерантности⁸. Этот фактор подтолкнул исследования биоматериалов к созданию материалов, которые могут вызвать желаемый иммунный ответ после имплантации 9,10,11,12.

Иммунный ответ является важным требованием в области регенеративной медицины, когда ткань или орган выращиваются вокруг каркаса биоматериала (скаффолда) в лаборатории для замены поврежденной ткани или органа^13,14,15,16. В регенеративной медицине цель состоит в том, чтобы заменить отсутствующие или поврежденные ткани с помощью клеток, сигналов и каркасов, каждый из которых может быть в значительной степени модулирован иммунными^{реакциями}. Более того, даже в тех случаях, когда иммунный ответ желателен, очень^{редко желательным} является отсутствие иммунной активности, а не наличие регуляторного профиля. Такие методы, как проточная цитометрия, могут играть значительную роль в характеристике характера иммунного ответа на различные биоматериалы, используемые для покрытия имплантатов или для разработки каркасов для тканевой инженерии¹⁹.

Эта информация, в свою очередь, в конечном итоге поможет в разработке биоматериалов для имплантатов, которые могут хорошо переноситься иммунной системой, или в разработке каркасов, которые могут играть конструктивную роль в тканевой инженерии. Надлежащая подготовка образцов для анализа методом проточной цитометрии является важным шагом для предотвращения неточных результатов при иммунохарактеристике с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток^20,21. Поэтому в данном обзоре представлена подробная методология, которая может быть использована для выделения клеток из ткани каркаса, окрашивания клеточной суспензии и анализа методом проточной цитометрии.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола проточной цитометрии.

1) Приготовление реагента

1. Подготовьте среду для разбавления ферментов и для культуры тканей.
   1. Добавьте 5 мл буферного раствора 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновой кислоты (HEPES) в 500 мл среды RPMI и хорошо встряхните. Храните средство при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
2. Рассчитайте объем раствора фермента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем раствора фермента - это объем среды, содержащей ферменты (коллагеназу и ДНКазу I), которые будут необходимы для переваривания нарезанных кубиками тканей в 6-луночных планшетах; Это зависит от количества образцов.
   1. Для расчета необходимого объема используйте следующее уравнение:
      (Количество образцов для разложения) × 5 мл безсывороточного RPMI с 10 мМ буфером HEPES
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для 0,1-0,3 г рассеченной селезенки используйте 5 мл среды для приготовления раствора фермента. Протокол ферментативного пищеварения, описанный в этой рукописи, предназначен в первую очередь для мягких тканей (от 0,1 до 1 г), испаренных у мышей, которые включают мозг, почки, кожу, печень, легкие, селезенку, мышцы, а также капсулы вокруг подкожных имплантатов, изготовленных из синтетических материалов или белков внеклеточного матрикса. Для переваривания твердых хрящевых тканей могут потребоваться различные условия и объемы пищеварительных ферментов, которые могут быть определены только путем оптимизации.
   2. Рассчитайте количество коллагеназы и ДНКазы, необходимых для раствора фермента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовали 0,25 мг/мл коллагеназы и 0,2 мг/мл ДНКазы I. Рабочие концентрации, необходимые для коллагеназы и ДНКазы, могут варьироваться для различных типов тканей¹⁹.
3. Приготовьте раствор красителя жизнеспособности 1:1000, добавив 1 мкл красителя жизнеспособности (см. таблицу материалов) к 999 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и встряхните раствор. Хранить раствор в темноте при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
4. Приготовьте буфер для окрашивания, добавив 1 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) в 100 мл ПБС, и встряхните раствор до полного растворения БСА. Хранить раствор при температуре 4 °C до дальнейшего использования.

2) Установка пластин ферментативного сбраживания

1. Установите 6-луночную пластину с сетчатыми фильтрами по 70 мкм в каждой лунке. Добавьте в каждую лунку по 3 мл подготовленной среды из шага 1.1.1 и инкубируйте на льду.
2. Оставшуюся среду (2 мл/лунку) хранят в инкубаторе или на водяной бане при температуре 37 °C для суспендирования рассчитанного количества коллагеназы и ДНКазы I (шаг 1.2.2).

3) Изоляция клеток

1. Поместите рассеченные имплантаты/ткани в пластины и мелко нарежьте ножницами. В качестве альтернативы можно использовать метод механического разрушения с помощью диссоциатора тканей или ручного гомогенизатора. Из-за большого количества лейкоцитов следует препарировать селезенку, чтобы использовать ее в качестве средства контроля окрашивания при каждом запуске.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку некоторые материалы индуцируют более высокие уровни фиброза, этот протокол применим как для высоковолокнистых, так и для минимально волокнистых материалов. Тем не менее, каждый метод обработки должен быть оценен как с точки зрения выхода клеток, так и с точки зрения жизнеспособности после разложения перед окрашиванием. Избегайте загрязнения периферической крови во время вскрытия.
2. Добавьте коллагеназу и ДНКазу I (объем, рассчитанный на шаге 1.2.2) к оставшемуся RPMI (2 мл), нагретому до 37 °C. Добавьте 2 мл полного раствора фермента в каждую лунку.
3. Поместите планшеты в инкубационный шейкер на 45 минут при температуре 37 °C и 100 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при штабелировании пластин, так как это может препятствовать правильной теплопередаче.
4. Тем временем подготовьте наконечник для дозирования суспензии, отрезав ножницами 3-4 мм от конца наконечника объемом 1000 мкл. После инкубации пипеткой протрите суспензию в лунках вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать ее с помощью измельченного наконечника. Поместите сетчатый фильтр на верхнюю часть конической пробирки объемом 50 мл и пропустите раствор через ситечко для клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточного фильтра 70 мкм достаточно для отделения клеток от имплантированного биоматериала, такого как альгинат. Если требуется более высокая чистота, используйте такие процессы, как разделение по градиенту плотности, чтобы получить обогащенную популяцию лейкоцитов.
5. Промойте лунки 1x раствором PBS и перенесите объем промывки через ситечко, а затем добавьте промывки сетчатого фильтра 1x раствором PBS до тех пор, пока объем в пробирке не достигнет 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1x PBS должен быть комнатной температуры, чтобы предотвратить увеличение вязкости дигеста и обеспечить гранулирование клеток во время центрифугирования.
6. Центрифугируют пробирку при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. После центрифугирования осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, не повреждая гранулу. Повторно суспендируйте гранулу в 1000 мкл 1x PBS и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку.
7. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего и загрузите суспензию на предметные стекла счетной камеры для подсчета клеток с помощью автоматического счетчика клеток или на гемоцитометр для подсчета обычным методом под микроскопом. В качестве альтернативы можно использовать гранулы для подсчета клеток методом проточной цитометрии.

4) Окрашивание для проточной цитометрии

1. На рисунке 2 приведен пример компоновки планшета для 14-цветного эксперимента с 45 образцами, контролем флуоресценции минус один (FMO), контролем компенсации и контролем полностью окрашенного образца селезенки. Оценив общее количество клеток, рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для окрашивания 1 × 10 6 клеток для каждого образца и 0,5 × 10⁶ клеток для каждой компенсации и FMO контроля. Распределите необходимый объем клеточной суспензии в лунки 96-луночной пластины с V-образным дном и доведите объем до 100 мкл с помощью 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если 1000 мкл клеточной суспензии, полученной на стадии 3.6, содержат 40 × 10 6 клеток, то для 1 × 10 6 клеток потребуется 1000/40 × 10⁶ = 25 мкл клеточной суспензии.
2. Центрифугируют планшет при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C, отсасывают надосадочную жидкость, а затем ресуспендируют клетки в лунках для образцов и в компенсационной контрольной яме для определения жизнеспособности 100 мкл раствора красителя жизнеспособности в соотношении 1:1000 (см. таблицу материалов).
3. Для ячеек в других компенсационных лунках, а также в FMO и неокрашенных лунках повторно суспендируйте их с помощью 100 мкл 1x PBS.
4. Инкубируют клетки в темноте в течение 30 мин при температуре 4 °С.
5. Тем временем приготовьте коктейль из поверхностных антител для окрашивания образца и контроля FMO: 50 мкл на образец или FMO. Пример коктейля антител см. в таблице 1 .
6. После инкубации добавьте 100 мкл 1x PBS в каждую лунку, отжим при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
7. Аспирировать надосадочную жидкость и ресуспендировать в 200 мкл окрашивающего буфера (1x PBS + 1% BSA); центрифугу при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С.
8. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в компенсационных, FMO и неокрашенных лунках с 50 мкл 1x PBS. Добавьте 50 мкл коктейля антител в соответствующие лунки для образцов и лунки FMO. Добавьте соответствующие антитела в различные компенсационные лунки.
9. Инкубируйте планшет в течение 45 минут в темноте при температуре 4 °C. После инкубации добавляют 150 мкл окрашивающего буфера в каждую лунку и центрифугируют клеточную суспензию при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
10. Аспирируют надосадочную жидкость, ресуспендируют клетки с помощью 200 мкл окрашивающего буфера и центрифугируют клеточную суспензию при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
11. При анализе образцов без фиксации их повторно помещают в 200 мкл окрашивающего буфера и переходят к разделу 6 по настройке цитометра и анализу образца. При фиксации клеток отсасывайте надосадочную жидкость после промывки и добавляйте 100 мкл фиксатора, например, 4% параформальдегида. При окрашивании на внутриклеточные маркеры переходят к разделу 5 о внутриклеточном окрашивании, фиксируют и пермеабилизируют клетки (см. таблицу материалов). Инкубируют клетки в течение 20 мин в темноте при температуре 4 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку фиксация может влиять на интенсивность флуоресценции некоторых флуорофоров, оценивайте каждую панель как с фиксацией, так и без нее.
12. После инкубации добавляют 100 мкл 1x PBS с последующим центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C. Отсасывайте надосадочную жидкость, ресуспендируйте в 1x PBS и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C.
13. Повторно суспендируйте клетки в 200 мкл окрашивающего буфера и храните при температуре 4 °C перед проточным цитометрическим анализом.

5) Внутриклеточное окрашивание

1. Начиная с шага 4.11 для фиксации и пермеабилизации внутриклеточных маркеров, добавьте 100 мкл соответствующего буфера. Центрифугируют клетки при 350 × г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать надосадочную жидкость и повторно суспендировать гранулы в 200 мкл раствора фиксирующего пермеабилизирующего агента; центрифугируют клетки при 350 × г в течение 5 мин при 4 °С. Отсасывайте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулы с внутриклеточными антителами, разведенными в соответствующем буфере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типы и разведения антител будут зависеть от клеток-мишеней. Например, одним из распространенных внутриклеточных маркеров является вилочная коробка P3 для регуляторных Т-клеток, которая часто используется в разведении 1:100.
2. Инкубируют клеточную суспензию в темноте в течение 45 мин при температуре 4 °С. После инкубации добавляют 150 мкл соответствующего буфера и центрифугируют суспензию при 350 × г в течение 5 мин при 4 °C.
3. Аспирируют надосадочную жидкость и повторно суспендируют клетки в 200 мкл окрашивающего буфера с последующим центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин при 4 °C. Аспирировать и повторно суспендировать клетки в 200 мкл окрашивающего буфера для проточного цитометрического анализа.

6) Настройка цитометра и компенсации

1. Непосредственно перед запуском образцов подготовьте компенсационные шарики (см. Таблицу материалов), если используется компенсация на основе шариков, а не на основе ячеек.
   1. Пометьте отдельные микроцентрифужные пробирки для каждого флуорохром-конъюгированного антитела и добавьте 100 мкл 1x PBS, а затем одну полную каплю антимышиных компенсационных шариков отрицательного контроля и одну каплю положительных контрольных компенсационных шариков в каждую пробирку. Добавьте 1 мкл соответствующего антитела в каждую отдельную пробирку. Перемешайте и инкубируйте в течение 5 минут перед получением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку некоторые красители, такие как BUV737, не могут быть связаны с шариками, используйте клеточный контроль.
2. Выполняйте калибровку проточного цитометра перед каждым экспериментом, запуская настройку цитометра с шариками слежения, и сохраняйте настройки проточного цитометра для каждого эксперимента.
3. Перед анализом образца отрегулируйте проточный цитометр, запустив неокрашенный образец, чтобы скорректировать популяцию клеток на графике бокового рассеяния (SSC) и прямого рассеяния (FSC) таким образом, чтобы популяция клеток попадала в центр графика и не зашкаливала.
4. Кратковременно запустите окрашенный образец, чтобы отрегулировать напряжения для FSC и SSC, а также для каждого канала, чтобы убедиться, что ни одно событие не выходит за логарифмическую шкалу каждого канала. Запишите 5 000 событий для каждого элемента управления компенсациями с последующим построением положительных и отрицательных популяций. Вычислите матрицу компенсации, а затем запустите выборки, собрав не менее 1 000 событий для интересующих нас популяций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсация на панелях большего цвета должна быть проверена, так как автоматическая компенсация может быть подвержена чрезмерной или недостаточной компенсации. Каждый параметр должен быть сопоставлен с каждым другим параметром для отслеживания признаков избыточной или недостаточной компенсации, и каждый одноцветный элемент управления должен быть оценен. Комплексная компенсация экспериментов с более крупными цветами должна проводиться с помощью сотрудника или основного учреждения, имеющего большой опыт работы с проточной цитометрией. Новые типы проточных цитометров, такие как спектральные цитометры, используют полный спектр флуорофора с помощью процесса, известного как спектральное размешивание, который может дать более четкое различение флуоресцентного перекрытия по сравнению со стандартной компенсацией²².

Процесс разработки панелей проточной цитометрии для иммуноанализа часто основывается на сравнении результатов с существующими данными и литературой в этой области. Знание того, как популяции могут быть представлены в проточной цитометрии, имеет решающее значение для правильной интерпретации данных. Несмотря на это, популяции и типы клеток могут по-разному проявляться в разных тканях, поэтому следует ожидать некоторой изменчивости. В контексте четко определенных контрольных тканей такая оптимизация окрашивания может быть оценена по сравнению с известными тканями, имеющими хорошо изученные типы клеток. На рисунке 3 показаны результаты 14-цветного FACS на тканях контрольной мыши. В данном случае селезенка использовалась для идентификации всех маркеров, по которым были окрашены, и для того, чтобы показать, что окрашивание было технически функциональным. С этого момента стало проще проводить тестирование в неизвестных условиях, быть уверенным в выборе флуорофора и оптимизировать протокол для различных источников тканей. На рисунке 3 также показаны популяции различных типов клеток, выделенных из селезенки мыши19.

Здесь можно наблюдать несколько очевидных популяций, таких как нейтрофилы Ly6G+, и разные уровни экспрессии Ly6C на разных классах моноцитов. Дендритные клетки CD11chi MHCII+ были легко очевидны при стробировании против CD11b, чтобы исключить макрофаги и другие клетки миелоидной линии, такие как нейтрофилы и моноциты. Подмножество CD206+CD86+ дендритных клеток может быть обнаружено путем сосредоточения внимания на этой популяции CD11c+. CD86 и CD206 были включены в фенотип миелоидных клеток как находящиеся в более М1-подобном (CD86hi) состоянии, а не в М2-подобном (CD206hi) поляризационном состоянии. F4/80 показал градиент экспрессии, который обычно наблюдается в различных популяциях макрофагов. Siglec-F присутствовал в двух популяциях, F4/80+ и F4/80-, что, скорее всего, соответствовало субпопуляции макрофагов и эозинофилов соответственно. Несмотря на то, что эти обозначения типов клеток могут быть сделаны, важно отметить, что клетки, экспрессирующие различные маркеры, следует рассматривать в функциональном ключе, а не в более бинарной классификации. Признание того, что то, что считается макрофагом, может отличаться в селезенке и капсуле инородного тела вокруг имплантата, важно и позволяет избежать потенциальной неправильной интерпретации результатов.

Рисунок 1: Обзор протокола окрашивания методом проточной цитометрии. Подготовка включает в себя рассечение интересующей ткани с последующим 1) ручным нарезыванием кубиками, 2) ферментативным расщеплением, 3) процеживанием и промыванием клеток и 4) окрашиванием флуоресцентно меченными антителами с последующим проточным цитометрическим анализом. Иллюстрация была сделана с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пример компоновки планшета для окрашивания методом проточной цитометрии. Эта схема включает в себя образцы, контроль флуоресценции минус один (FMO), компенсационный контроль и контрольный образец ткани (селезенка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативные результаты 14-цветного окрашивания FACS на тканях контрольной мыши. Фенотипирование миелоидных клеток селезенки мышей с примерами ручного стробирования и автоматизированного алгоритма кластеризации t-стохастических соседей (t-SNE) для отображения данных. Эта цифра была воспроизведена из Sadtler and Elisseeff19. Сокращения: FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; SSC = боковой разброс; CD = кластер дифференцирования; ПЭ = фикоэритрин; CCR = тип С-С хемокинового рецептора; MHC = главный комплекс гистосовместимости; PerCP = белковый комплекс хлорофилла перидинина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Пример коктейля поверхностных антител. Пример коктейля антител для миелоидного фенотипирования мышиной ткани.

Авторам нечего раскрывать.