Высокоразмерная проточная цитометрия для анализа иммунной функции рассеченных тканей имплантата

Summary

Выделение клеток из рассеченных имплантатов и их характеристика с помощью проточной цитометрии может внести существенный вклад в понимание паттерна иммунного ответа против имплантатов. В данной работе описан точный метод выделения клеток из рассеченных имплантатов и их окрашивания для проточного цитометрического анализа.

Abstract

Успех имплантации выращенной в лаборатории ткани или медицинского изделия человеку зависит от иммунного ответа хозяина-реципиента. Рассматривая имплантат как инородное тело, враждебный и нерегулируемый иммунный ответ может привести к отторжению имплантата, в то время как регулируемый ответ и восстановление гомеостаза могут привести к его принятию. Анализ микроокружения имплантатов, препарированных в условиях in vivo или ex vivo , может помочь в понимании паттерна иммунного ответа, что в конечном итоге может помочь в разработке новых поколений биоматериалов. Проточная цитометрия является хорошо известным методом характеристики иммунных клеток и их субпопуляций на основе маркеров их клеточной поверхности. В этом обзоре описывается протокол, основанный на ручном нарезе кубиками, ферментативном расщеплении и фильтрации через клеточный фильтр для выделения однородных клеточных суспензий из рассеченной ткани имплантата. Кроме того, был разъяснен протокол многоцветного окрашивания методом проточной цитометрии, а также этапы первоначальной настройки цитометра для определения характеристик и количественного определения этих изолированных клеток с помощью проточной цитометрии.

Introduction

Достижения в области медицины привели к частому использованию имплантируемых материалов для поддержки функции или повторного роста поврежденных тканей ^1,2. К ним относятся такие устройства, как кардиостимуляторы, реконструктивные косметические имплантаты и ортопедические пластины, используемые для фиксации переломов костей ^3,4. Тем не менее, материалы, используемые для изготовления этих имплантатов, и места, в которые они имплантированы, играют важную роль в определении успеха этих имплантатов ^5,6,7<....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола проточной цитометрии.

1) Приготовление реагента

1. Подготовьте среду для разбавления ферментов и для культуры тканей.
   1. Добавьте 5 мл буферного раствора 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновой кислоты (HEPES) в 500 мл среды RPMI и хорошо встряхните. Храните средство при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
2. Рассчитайте объем раствора фермента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем раствора фермента - это объем среды, содержащей ферменты (коллагеназу и ДНКазу I), которые будут необходимы для переваривания нарезанных кубиками тк....

Results

Процесс разработки панелей проточной цитометрии для иммуноанализа часто основывается на сравнении результатов с существующими данными и литературой в этой области. Знание того, как популяции могут быть представлены в проточной цитометрии, имеет решающее значение для правильной интерпретации данных. Несмотря на это, популяции и типы клеток могут по-разному проявляться в разных тканях, поэтому следует ожидать некоторой изменчивости. В контексте четко определенных контрольных тканей такая оп.......

Discussion

В данном обзоре описана подробная методика выделения клеток из имплантатов биоматериала для получения однородной клеточной суспензии. Кроме того, был предоставлен подробный протокол окрашивания клеточной суспензии для многоцветной проточной цитометрии, а также шаги по настройке проточного цитометра для получения оптимальных результатов. Методы выделения клеток могут включать в себя несколько этапов, часто используя ручное рассечение тканей с последующим ферментативным расщеплением с протеолитическими ферментами для диссо.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 мл конические пробирки	Fisher Scientific	14-432-22
6 Well Plate	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	Только для фиксации клеток
Бычий сывороточный альбумин	Millipore Sigma	A7906	Для приготовления FACS окрашивающий буфер
CD11b AF700	Biolegend	101222	Клон: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Клон: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Клон: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Клон: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Клон: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Клон: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Клон: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Клон: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD	Biosciences 552843	Для компенсационного контроля
ДНКазы I	Millipore Sigma	11284932001	Козырного панкреатического дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Клон: BM8
fc Block	Biolegend	101301	Клон: 93
Набор решений для фиксации/пермеабилизации	BD Biosciences	554714	Для фиксации и пермеабилизации клеток.
HEPES buffer	Thermo Fisher	15630080	Буфер для дополнения клеточных сред
Liberase	Millipore Sigma	5401127001	Смесь очищенной коллагеназы I и коллагеназы II
живой/мертвой Исправляемый набор для окрашивания синих мертвых клеток	Thermo Fisher	L23105	Жизнеспособность красителя
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Клон: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Клон: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Клон: M5/114.15.2
Фосфатный буфер физиологический раствор	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Среды для культивирования клеток
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Клон: E50-2440
V-образный дно 96-луночный планшет