Методическая статья

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

DOI:

10.3791/61780

⸱

24 февраля 2021 г.

 ,  , 
1Nuclear Magnetic Resonance Group, National Institute of Environmental Health Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает удаление эндогенных липидов из аллергенов и их замену указанными пользователем лигандами посредством обратнофазной ВЭЖХ в сочетании с термическим отжигом. 31 31 P-ЯМР и круговой дихроизм позволяют быстро подтвердить удаление/нагрузку лиганда и восстановление нативной структуры аллергена.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие основные аллергены связываются с гидрофобными липидоподобными молекулами, включая Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 и Fel d 1. Эти лиганды сильно сохраняются и могут влиять на процесс сенсибилизации либо путем прямой стимуляции иммунной системы, либо путем изменения биофизических свойств аллергенного белка. Для контроля этих переменных требуются методы удаления эндогенно связанных лигандов и, при необходимости, замещения липидами известного состава. Аллерген таракана Bla g 1 заключает в себе большую гидрофобную полость, которая связывает гетерогенную смесь эндогенных липидов при очистке с использованием традиционных методов. Здесь мы описываем способ, с помощью которого эти липиды удаляются с использованием обратнофазной ВЭЖХ с последующим термическим отжигом с получением Bla g 1 в его Апо-форме или перезагружается пользовательской смесью жирных кислот или фосфолипидных грузов. Соединение этого протокола с биохимическими анализами показывает, что грузы жирных кислот значительно изменяют термостабильность и протеолитическую устойчивость Bla g 1, что имеет последующие последствия для скорости генерации эпитопа Т-клеток и аллергенности. Эти результаты подчеркивают важность протоколов удаления/перезагрузки липидов, таких как описанный в настоящем описании, при изучении аллергенов как из рекомбинантных, так и из природных источников. Протокол обобщается на другие семейства аллергенов, включая липокалины (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) и Утероглобин (Fel d 1), обеспечивая ценный инструмент для изучения роли липидов в аллергической реакции.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование базы данных аллергенов показывает, что аллергены встречаются только в 2% всех известных семейств белков, предполагая, что общие функциональные и биофизические свойства способствуют аллергенности1. Из этих свойств способность связывать липидные грузы, по-видимому, сильно перепредставлена среди аллергенов, что позволяет предположить, что эти грузы могут влиять на процесс сенсибилизации1. Действительно, было показано, что аллерген бразильского ореха Ber e 1 требует совместного введения с его эндогенным липидом для реализации его полного сенсибилизирующего потенциала2. Эти липиды могут потенциально стимулировать иммунную систему непосредственно, как показано аллергенами клеща Der p 2 и Der p 7, оба из которых имеют сильную структурную гомологию с LPS-связывающими белками3,4,5. На основе этого наблюдения было высказано предположение, что Derp 2 и Der p 7 могут связывать бактериальные липиды и непосредственно стимулировать иммунную систему хозяина посредством TLR4-опосредования сигнализации, облегчая процесс сенсибилизации5,6. Также возможно, что эндогенно связанные липиды могут изменять биофизические свойства самих аллергенных белков. Например, способность Sin a 2 (горчица) и Ara h 1 (арахис) взаимодействовать с фосфолипидными везикулами значительно усилила их устойчивость к желудочной и эндосомальной деградации7,в то время как связывание лигандов с основным аллергеном пыльцы березы Bet v 1 изменяло как скорость эндосомальной обработки, так и разнообразие полученныхпептидов 8. Это особенно актуально для аллергенности, учитывая корреляцию, которая наблюдалась между стабильностью, генерацией эпитопа Т-клеток и аллергенностью для белков, таких как Bet v 1 и Bla g 1; последний из которых будет предметом настоящей работы9,10.

Bla g 1 представляет собой прототип члена семейства белков основных аллергенов насекомых (MA) и обладает уникальной структурой, состоящей из 12 амфипатических альфа-хеликул, которые заключают аномально большую гидрофобную полость9,11. Доступная рентгеновская кристаллическая структура Bla g 1 показывает электронную плотность в этой полости, согласуемую со связанными фосфолипидными или жирными кислотными лигандами; гипотеза, подтвержденная 31П-ЯМР и масс-спектрометрией. Эти грузы были неоднородными по своей природе, и их состав сильно зависел от источника аллергена, причем различные липидные профили наблюдались для рекомбинантного Bla g 1, выраженного у E. coli и P. pastoris. Любопытно, что Bla g 1, очищенный от своего естественного источника аллергена (таракан фрасс), содержал преимущественно жирные кислоты в своем месте связывания, причем смесь пальмитата, олеата и стеарата была идентифицирована как его «естественные» лиганды9,11. Способность Bla g 1 удерживать липиды и жирные кислоты после нескольких этапов очистки препятствует усилиям по изучению белка в изоляции. И наоборот, было высказано предположение, что естественные пальмитатные, стеаратные и олеатные лиганды Bla g 1 (далее именуемые nMix) играют ключевую роль как в его аллергенности, так и в нативной биологической функции9. Однако эти лиганды отсутствуют в Bla g 1, полученном из рекомбинантных источников, что затрудняет оценку этой гипотезы. Аналогичные проблемы наблюдались для других аллергенов, связывающих липиды, таких как Bet v1 12,13. Чтобы облегчить систематическое изучение липидно-аллергенных взаимодействий, мы разработали протокол, с помощью которого аллергены могут быть количественно лишены своих эндогенно связанных липидов и восстановлены либо в Апо-форме, либо загружены специфическими лигандами.

Аллергены чаще всего очищают от их естественных или рекомбинантных источников с использованием аффинной хроматографии и/или хроматографии с исключением размера. Здесь мы вводим дополнительную стадию очистки в виде высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки C18 обратной фазы, из которой аллерген элюируется в органический растворитель, аналогичный протоколам, разработанным для белков14 связыванияжирных кислот. Полученный белок затем подвергают термическому отжигу в отсутствие или присутствие жирных кислот и/или фосфолипидов. В дополнение к восстановлению нативного Bla g 1 раза, повышенные температуры увеличивают растворимость и доступность липидных грузов, давая Bla g 1 либо в Апо-форме, либо равномерно загруженный желаемым гидрофобным лигандом. 31 31 Очищенные таким образом P-ЯМР спектры Bla g 1 подтвердили полное удаление эндогенно связанных лигандов и равномерное замещение желаемыми соединениями, в то время как круговой дихроизм подтвердил успешное восстановление Bla g 1 раза. Полезность этого метода подчеркивается в недавней работе, в которой было обнаружено, что связывание груза усиливает термостабильность Bla g 1 и протеолитическую резистентность, изменяя кинетику генерации эпитопов Т-клеток с потенциальными последствиями для сенсибилизации и аллергенности9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bla g 1 клонирование

  1. Получают ген таракана аллерген Bla g 1.0101 (остатки 34-216), представляющий собой единый повтор домена МА. Для простоты Bla g 1 будет использоваться на протяжении всей работы, чтобы представить этот единственный повтор, а не всю стенограмму Bla g 1.0101.
  2. Субклон ген Bla g 1 в нужный вектор. В этом исследовании ген, содержащий N-концевую метку глутатион-S-трансферазы (GST), связанную с участком расщепления протеазы вируса травли табака (TEV), был вставлен в вектор pGEX для экспрессии, как описаноранее 11.
  3. Преобразуйте вектор Bla g 1 pGEX в ячейки BL21 DE3 E. coli.
    1. Подготовьте запас нужного вектора 10 нг/мкл.
    2. Объедините 1 мкл 10 нг/мкл ДНК с 50 мкл клеток BL21 DE3, как это предусмотрено производителем.
    3. Инкубировать смесь BL21 DE3-ДНК в течение 30 мин на льду. Переложить на водяную баню при 42 °C в течение 1 мин, затем сразу же вернуть на лед для дополнительной инкубации 1 мин.
    4. Добавьте 200 мкл среды LB к клеткам и инкубируют в течение дополнительного 1 ч при 37 °C.
    5. Накладывайте трансформированные клетки на пластины LB-agar, содержащие 100 мг/л ампициллина, и растут при 37 °C в течение ночи.

2. Первоначальное выражение и очищение

  1. Инокулируют 1 л LB-среды, содержащей 100 мг/л ампициллина, одной колонией клеток BL21 DE3, преобразованных вектором Bla g 1, как описано в 1.3. Растут при 37 °C в течение ночи.
  2. На следующий день собирают клетки (OD600 ~ 1,5) путем центрифугирования при 6000 х г в течение 10 мин и повторно суспендировать в 2 л среды 2x YT, содержащей 100 мг / л ампициллина. Дайте клеткам расти в течение дополнительного 1 ч при 37 °C до OD600 > 0,6.
  3. Индуцируют экспрессию белка путем добавления 0,5 мМ IPTG. Перенесите клетки до 18 °C и высиживают в течение ночи.
  4. На следующий день собирают клетки, как описано в 2.2. Полученную ячейку гранулы можно заморозить и хранить при -20 °C.
  5. Гранулу повторного суспенда получают из 1 л культуры в 50 мл лизизного буфера (50 мМ Tris-HCl pH 8,5, 100 мМ NaCl), содержащего 1 таблетку ингибитора протеазы (или эквивалент) и 1 мкл нуклеазы бензоназы.
  6. Ячейки Lyse с помощью зондового ультразвукового аппарата (500 Вт, 20 кГц) настроены на мощность 30–50% в течение 4 мин с рабочим циклом 50%. Храните лисат в ледяной ванне во время ультразвуковой области.
  7. Центрифуга лисата при 45 000 х г в течение 20 мин. Отбросьте нерастворимую фракцию (гранулу).
    1. Удалить 28 мкл растворимого белка. Объедините с 7 мкл 5-кратного буфера SDS-PAGE и сохраните для анализа SDS-PAGE. Повторите этот шаг для фракций проточной, промывки и элюирования колонны GST до и после инкубации с TEV.
  8. Нанесите растворимые белки (супернатант) на колонку глутатионной смолы (~ 10 мл общего объема слоя), уравновешиваемую в PBS pH 7,4.
  9. Вымывайте любые несвязанные белки, используя 50 мл PBS.
  10. Elute GST-Bla g 1 с использованием 50 мл PBS, содержащего 10 мМ восстановленного глутатиона.
  11. Инкубировать элюированный белок с протеазой TEV 0,2 кЕД в течение ночи при 4 °C или комнатной температуре в течение 6 ч для удаления метки GST.

3. Эндогенное удаление липидов с помощью ВЭЖХ обратной фазы

  1. Соберите расщепленный Bla g 1 и сконцентрируйте его до ~2 мл с помощью центробежного фильтрующего блока с отсечкой молекулярной массы <10 кДа.
    1. Добавьте пробу <12 мл в верхнюю часть концентратора и открутите при 5000 х г в течение 10–15 мин в роторе с поворотным ковшом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца и скорость отжима будут варьироваться в зависимости от конкретного фильтра и типа используемого ротора. Перед использованием ознакомьтесь с документацией производителя.
  2. Загрузите концентрат в систему ВЭЖХ 250 x 10 мм, оснащенную реверсивной хроматографической колонкой C18, уравновешенной 97% буфером A (вода, 0,1% трифторуксусной кислоты) и 3% буфером B (ацетонитрил, 0,1% трифторуксусной кислоты).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться меньшие колонки, но белок, возможно, придется загружать и элюировать с использованием нескольких циклов, чтобы приспособиться к сниженной способности связывания. При выборе колонки убедитесь, что шарики смолы имеют размер частиц < 5 мкм и размер пор >200 Å, чтобы обеспечить эффективное разделение молекул размером с белок.
    ВНИМАНИЕ: Трифторуксусная кислота является высококоррозионной и должна дозироваться в вытяжном капюшоне с использованием соответствующих СИЗ (т.е. нитриловых перчаток, лабораторного халата и защитных плат). Ацетонитрил является умеренно токсичным, летучим и легковоспламеняющимся, его следует использовать и дозировать в вытяжном капюшоне с использованием соответствующих СИЗ (т. Е. Нитриловых перчаток, лабораторного халата и защитных платков).
  3. Elute Bla g 1 с использованием протокола, показанного в таблице 1 при скорости потока 1,5–4,0 мл/мин. Контролируйте процесс элюированием, используя флуоресцентное поглощение при 280 нм.
    1. Соберите и смешайте Bla g 1 фракции. Bla g 1 обычно элюируется при >74% буфера B, или ~34–40 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время элюирования будет немного варьироваться в зависимости от скорости потока или размера столбца. Собирайте фракции на основе A280 для достижения наилучших результатов.
Время (мин)Буфер A (%)Буфер B (%)
0973
10973
253565
55595
65595
70973

Таблица 1: Протокол элюции для Bla g 1. Таблица, иллюстрирующая градиент элюирования, используемый при выделении Bla g 1 с помощью столбца C18 ВЭЖХ.

  1. Аликвотирование образца в стеклянные пробирки, заполняя пробирки более чем наполовину (~4 мл). Накройте трубки парафиновой пленкой и процедийте покрытие двумя отверстиями, чтобы обеспечить вентиляцию.
    1. Приготовьте отдельную аликвоту 1 мл (тестовую аликвоту). Это будет использоваться для определения ожидаемой урожайности.
  2. Заморозьте образцы и протестируйте аликвоту, поместив их в морозильную камеру при -80 °C на 1 ч или погружая в жидкий азот. В случае с более поздним, трубка должна поворачиваться непрерывно, чтобы избежать поломки пробирки из-за расширения жидкой фазы при замерзании.
  3. Высушите полученные делипидированные образцы белка с помощью лиофилизатора. Высушенный белок может храниться при 4 °C в течение нескольких месяцев в герметичном контейнере.

4. Восстановление Апо- и грузового Bla g 1

  1. Определите ожидаемый выход Bla g 1.
    1. Ресуспендированная лиофилизированная, делипидированная (пост-ВЭЖХ) тестовая аликвота в 5 мл буфера рефолдирования (50 мМ HEPES pH 7,4, 100 мМ NaCl, 2% DMSO).
    2. Нагрейте смесь на водяной бане (500 мл с 250 мл воды и перемешайте бар над конфоркой) до 95 °C. Вихревые растворы периодически и инкубируют при 95 °С в течение 0,5–1 ч.
    3. Отведите тепло и медленно дайте водяной бане выравняться до комнатной температуры (~1 ч). Отожженный белок может храниться в этой форме в течение ночи при 4 °C, если это необходимо.
    4. Пропустите отожженную смесь Bla g 1-липидов через шприцевой фильтр 0,22 мкМ для удаления твердых частиц.
    5. Буферный обмен фильтрованного белка 3x на PBS pH 7,4 с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 кДа, как описано в 3.1, для удаления остаточных свободных жирных кислот и органического растворителя.
    6. Оцените концентрацию белка с помощью анализа BCA или другого предпочтительного метода, такого как поглощение ультрафиолетовым излучением. Используйте это для определения ожидаемого выхода для оставшихся аликвот Bla g 1.
  2. Восстановленный Апо- или грузовой Bla g 1
    1. Resuspend Bla g 1 aliquots в буфере переворачивания, как описано в 4.1.1.
    2. Чтобы получить Apo-Bla g 1, повторите шаги 4.1.2–4.1.6 для получения желаемого выхода.
    3. Для загрузки Bla g 1 жирными кислотами готовят 20 мМ запаса растворов нужного груза жирных кислот в метаноле или ДМСО.  Затем перейдите к шагу 4.2.5.
    4. Для загрузки Bla g 1 фосфолипидами подготовьте 10 мг/мл нужного груза в хлороформе внутри стеклянной пробирки.
      1. Выпарить хлороформ с получением липидной пленки. Добавьте PBS в пробирку для получения конечной концентрации фосфолипида 20 мМ.
        ВНИМАНИЕ: Хлороформ вреден при вдыхании или проглатывании. Используйте в химическом вытяжном вытяжке или используйте респиратор, если имеется недостаточная вентиляция. Используйте нитриловые перчатки, лабораторное покрытие и очки при обращении. Перед использованием проконсультируйтесь с MSDS.
      2. Регидратировать липидную пленку, нагревая ее выше температуры фазового перехода липидного груза и вихря до тех пор, пока раствор не станет мутным. Обратите внимание, что обработка ультразвуком может потребоваться для полного повторного суспендирования и регидратации некоторых грузов.
      3. Если требуется обработка ультразвуком, поместите пробирку в ультразвуковой аппарат для ванны (100 Вт, 42 кГц) и обжажайте ультразвуком на максимальной мощности до тех пор, пока груз не будет повторно суспендирован. Альтернативно, зондовый ультразвуковой аппарат (описанный в 2.6) может использовать мощность 10-20% с рабочим циклом 50%.
        ВНИМАНИЕ: Ультразвук использует высокочастотные звуковые волны, которые могут повредить слух. Используйте шумоподавляющие СИЗ (беруши или глушители). Если возможно, поместите ультразвуковой аппарат внутрь звукопоглощающего шкафа или камеры.
    5. Добавьте желаемую жирную кислоту или фосфолипидный груз для получения 20-кратного молярного избытка лигандов по отношению к Bla g 1 на основе ожидаемого выхода, определенного в 4.1. Общий объем органического растворителя, добавленного на этой ступени, не должен превышать 2%. Вихрь для смешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 л Bl21 DE3 клеток обычно дает ~0,25–0,4 нмоль белка, что соответствует ~400 мкМ лиганда на трубку.
    6. Отжиг белка, как описано в 4.1.

5. Подтверждение вывоза/погрузки фосфолипидного груза с помощью 31П-ЯМР

  1. Концентрировать образцы Апо- или грузового Bla g 1 до >100 мкМ с использованием центробежного фильтрующего блока, как описано в 3.1.
  2. Регидрат эталонного фосфолипида в буфере PBS до конечных концентраций 2, 1,5, 1, 0,5 и 0,25 мМ.
  3. Разбавлять образцы 1:1 холатным буфером (100 мМ Tris pH 8,0, 100 мМ NaCl, 10% мас./об.холата) до общего объема ~600 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Холат используется на этом этапе для полного извлечения и солюбилизации липидов из гидрофобной полости Bla g 1. Это гарантирует, что химическая среда, окружающая головные группы фосфолипида, согласуется между различными образцами, что позволяет проводить ее количественную оценку с использованием 31P-ЯМР. Применение холата может быть заменено хлороформом/метанолом, как описаноранее 15.
  4. Получение 1D 31P-ЯМР спектров холат-солюбилизированных образцов Bla g 1 и эталонных стандартов фосфолипида с помощью широкополосного зонда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 31P-ЯМР спектр, представленный в этой работе, был получен с использованием спектрометра 600 МГц. Однако предыдущие исследования, использующие аналогичные методы, показывают, что приемлемая чувствительность может быть достигнута при силе полей до 150-200МГц 15.
  5. Обрабатывайте полученные данные с помощью соответствующего программного обеспечения16.
  6. Получение пиковой интенсивности с помощью предпочтительного программного обеспечения для просмотра ЯМР17.
  7. Сравните спектры Bla g 1 31P-ЯМР с спектрами, полученными для эталонных образцов фосфолипида, чтобы подтвердить удаление эндогенно связанных лигандов и/или связывание желаемых лигандов на основе химических сдвигов видимых пиков (или их отсутствия).
    1. Подтвердите полную стехиометрию связывания, сравнив пиковую интенсивность спектра Bla g 1 с эталонами фосфолипида.

6. Подтверждение складывания Bla g 1

  1. Подготовьте 0,5 мкМ образцов Bla g 1 в cd-буфере (100 мМ KH2PO4,буферный рН 7,5). Загрузите 2 мл образца в 10-миллиметровую CD-кювету с магнитной перемешиной.
  2. Измерите CD-спектр Bla g 1 для подтверждения восстановления вторичной структуры. Убедитесь, что напряжение фотоумножителя (PMT) не превышает рекомендаций производителя (обычно 1 кВ).
    1. Измерение сигнала CD от 260–200 нм при 25 °C с шагом данных 0,2 нм и скоростью сканирования 20 нм/с при времени интеграции данных 1 с.
  3. Увеличьте температуру в cd-ячейке с 25 °C до 95 °C со скоростью 0,5 °C/мин. Активируйте магнитный перемешивной стерженок, чтобы обеспечить равномерное повышение температуры по всему образцу.
  4. Монитор CD при 222 нм, снимая показания каждые 2 °C.
  5. Подгонка полученных данных к 2-стейтовой кривой Больцмана для определения температуры плавления. Из-за высокой стабильности Bla g 1 температура плавления (MT25)была определена как температура, при которой белок потерял 25% своего исходного CD при 222 нм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя аффинную хроматографию, рекомбинантный GST-Bla g 1 легко изолировали до высокого уровня чистоты(Рисунок 1A),получая выход ~ 2-4 мг / л клеточной культуры. Ночной инкубации с протеазой TEV при 4 °C достаточно для удаления метки GST, в результате получения конечного продукта при ~24 кДа. Обратите внимание, что в этом случае в проточной и промывной фракциях имеется значительное количество GST-Bla g 1, что говорит о превышении связующей способности смолы глутатиона. Использование большего количеств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный в данной работе, был успешно применен для систематического изучения липидсвязывающих свойств Bla g 1. Это выявило корреляцию между связыванием груза, термостабильностью и эндосомальной обработкой, последняя из которых коррелировала со снижением генерации известного эпитопа Т-клеток с потенциальными последствиями для иммуногенности9,18. В дополнение к Bla g1, было показано, что другие аллергены, такие как Pru p 3 и Bet v 1, сохраняют свои эндог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Тома Кирби, Скотта Габеля и д-ра Роберта Лондона за их помощь и содействие на протяжении всей этой работы, а также д-ра Боба Петровича и Лори Эдвардс за использование их инструментов и их помощь в создании конструкций Bla g 1, используемых в этом исследовании. Мы благодарим Андреа Адамс за помощь в масс-спектрометрии и доктора Юджина ДеРоуза за помощь с приборами ЯМР. Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований NIH, Национальным институтом наук о здоровье окружающей среды, Z01-ES102906 (GAM). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национального института наук о гигиене окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bla g 1 Gene GenescriptN/aПользовательский сервис синтеза генов. GenBank Accession no AF072219 Остатки 34-216
Affinity очищенный натуральный Bla g 1 (nBla g 1)Внутренние биотехнологииН/д Индивидуальныйзаказ
Agilent 1100 Series HPLC SystemAgilentG1315B, G1311A, G1322AУФ-детектор, насос и дегазатор
Agilent DD2 600 МГц спектрометрAgilentN/a
Amicon Ultra-15 Центробежный фильтрующий блокAmiconUFC-1008
АмпициллинFisher ScientificBP1760-5
БензоназаSigma-AldrichE1014-5KU
Широкополосный 5 мм Z-градиентный зондVarianN/a
ChemStation для LC (Программное обеспечение)AgilentN/a
cOmplete Mini Ингибитор протеазы КоктейльRoche11836153001
Дистеароилфосфатидилхолин (18:0 шт)Avanti Polar Lipids850365C
E. Coli BL21 DE3 CellsNew England BiolabsC2530H
Freezone 4.5 Система сублимационной сушкиLabconco7750000
Глутатион смолаGenescript L00206
Глутатион, сниженныйнаучныйBP25211
ФишераИзопропил-&бета;-D-тиогалактопиранизид (IPTG)Fisher Scientific34060
Jasco  CD спектрополяриметрJascoJ-815
Millex Шприцевой фильтрующий блокEMD MilliporeSLGS033SS
NMRПипе (программное обеспечение)Delaglio et al. N/aDelaglio, F. et al. Nmrpipe - многомерная система спектральной обработки на основе Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277– 293 (1995).
NMRViewJ (Программное обеспечение)Johnson et al. Н/аДжонсон, Б. А. и Блевинс, Р. А. ЯМР Взгляд: Компьютерная программа для визуализации и анализа данных ЯМР. J. Biomol. NMR 4, 603– 614 (1994).
Олеиновая кислотаSigma-AldrichO1008
Пирс BCA Анализ белкаSigma-AldrichBCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10,0 мм Колонка ВЭЖХAgilentАртикул: A2000250X100
SD-200 Вакуумный насосVarianVP-195
Гидрат холата натрияSigma-AldrichC6445
ПальмитатнатрияSigma-AldrichP9767
Стеарат натрияSigma-AldrichS3381
vnmrJ (программное обеспечение)VarianN/a

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
  2. Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
  3. Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
  4. Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
  5. Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556(2019).
  6. Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
  7. Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
  8. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  9. Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294(2019).
  10. Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
  11. Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
  12. Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
  13. Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
  14. Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
  15. Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
  16. Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  17. Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
  18. Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
  19. Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
  20. Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
  21. Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279(2016).
  22. Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
  23. Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
  24. Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
  25. Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
  26. Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
  27. Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
  28. Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
  29. Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
  30. Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
  31. Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
  32. Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
  33. de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027(2020).
  34. Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
  35. Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
  36. Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bla g 131

Похожие статьи