Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямая биопечать 3D многоклеточных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети

4.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61791

⸱

2 ноября 2020 г.

 , 
1Department of Biology, Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

В этой статье

Краткое содержание

Целью этого протокола является непосредственно биопечать эпителиальных клеток молочной железы в качестве многоклеточных сфероидов на предварительно сформированные эндотелиальные сети для быстрого создания 3D эндотелиальных моделей совместной культуры груди, которые могут быть использованы для исследования скрининга наркотиков.

Аннотация

Биопечать становится перспективным инструментом для изготовления 3D-моделей рака человека, которые лучше резюмируют критические признаки архитектуры тканей in vivo. В текущей биопечати экструзии слоя за слоем отдельные клетки экструдируются в биоинке вместе со сложными пространственными и временными сигналами для содействия самосожасыванию иерархических тканей. Тем не менее, этот метод биофабрики опирается на сложные взаимодействия между клетками, биоинки и биохимические и биофизические сигналы. Таким образом, самос сборка может занять несколько дней или даже недель, может потребовать конкретных биоинкв, и не всегда может произойти, когда есть более чем один тип клеток участие. Поэтому мы разработали метод непосредственно биопечати предварительно сформированных 3D груди эпителиальных сфероидов в различных биоинк. Биопечатные предварительно сформированные 3D эпителиальные сфероиды груди поддерживали свою жизнеспособность и поляризованную архитектуру после печати. Мы дополнительно напечатали 3D сфероиды на сосудистых эндотелиальных клеточных сетях, чтобы создать модель совместной культуры. Таким образом, новая методика биопечати быстро создает более физиологически релевантную 3D модель груди человека при более низких затратах и с более высокой гибкостью, чем традиционные методы биопечати. Этот универсальный метод биопечати может быть экстраполирован для создания 3D-моделей других тканей в дополнительных биоинках.

Введение

3D в пробирке сосудистой опухоли модели являются важными инструментами для механистического исследования роста рака и метастазов. Для рака молочной железы, в частности, эпителиальные клетки молочной железы, культурные в Matrigel организовать в поляризованных сфероидов, которые больше напоминают in vivo mammary acinusархитектуры 1,2,3,4,5,6,7,8. 3D груди эпителиальной клеточной культуры также влияет на функцию клеток, с 3D культур, показывающих различия в эпидермального фактора роста (EGF)модуляции рецепторов 8,9; онкоген функции, в том числе ErbB210; рост и апоптоз сигнализации11,12; ихимиотерапевтического сопротивления 13,14. Сосудистые эндотелиальные клетки одинаково по-разному реагируют на экологические стимулы в 3D против традиционной 2Dкультуры 15,16,17,18. Тем не менее, большая часть понимания сосудистых эндотелиальных и грудных эпителиальных взаимодействий происходит от 2D культуры с использованием условных средних или Transwell вставки, или 3D-модели, в которых два типаклеток физически разделены 19,20,21,22,23. Эти модели совместной культуры обеспечивают ограниченное физиологическое понимание, так как и 3D-культура, и контакт клеток имеют решающее значение для сосудистого эндотелиального - взаимодействияэпителиальных клеток молочной железы 24,25,26.

3D модели рака были изготовлены с использованием различных методов, в том числе висячие капли сфероидов формирования, биопечати, магнитной сборки и культуры в гидрогелях или на инженерии леса5,27,28,29. Совсем недавно были созданы 3D-модели опухолей с несколькими типами клеток, расположенными в их соответствующих 3D структурах. В одном из примеров опухоли на чипе платформы, рак, эндотелиальные и стромальные клетки были смешаны в матрицу, а затем введены в три центральные камеры ткани в устройстве polydimeylsiloxane (PDMS). Камеры тканей были граничит с двумя внешними каналами, которые представляли артерию и венуле. После 5-7 дней культуры, эндотелиальные клетки сформировали микрососудикулярную сеть и раковые клетки размножались, чтобы сформировать небольшие опухоли вблизи сосудов. Эта платформа была затем использована для проверки наркотиков и комбинаций наркотиков30. Дополнительные платформы опухоли-на-чипе были созданы для изучения метастазов и типов рака с конкретными механическими стимулами (например, механический штаммв легких) 31,32. Тем не менее, эти платформы, как правило, не включают как сосуды и рак в их соответствующих 3D структур.

Биофабрика показывает большие перспективы в продвижении 3D в пробирке васкуляризированных моделей опухоли, так как это позволяет жесткий пространственный контроль над расположением клеток. Несмотря на рост биопечати за последнее десятилетие, лишь немногие исследования сосредоточены конкретно наопухолях 33,34. В одном примере для создания модели рака шейки матки in vitro использовалась 3D-печать клеток HeLa в гидрогеле из желатина/альгината/фибриногена. Опухолевые клетки были биопечать в качестве отдельных клеток, а затем позволило сформировать сфероиды, которые показали более высокий уровень распространения, увеличение экспрессии матрицы металлопротеиназы, и более высокую химиорезистансность, чем клетки в 2Dкультуры 35. В этих исследованиях, как и вомногих других 36,37, диссоциированных клеточных суспензий были биопечати, а затем клеточные культуры были предоставлены необходимые механические и биохимические сигналы, чтобы клетки, чтобы сформировать 3D структуру. Тем не менее, клеточная самосвеывание может занять несколько дней или недель, может потребовать сложных пространственных и временных экологических сигналов, или не может произойти, когда два типа клеток совместно культуры. Например, эпителиальные клетки молочной железы индуцированных клеточной смерти в эндотелиальных клетках в 2D совместной культуры, и диссоциированных клеток груди эпителиальной не образуют 3D сфероидов, когда биопечать в альгинат / желатингидрогелий 38. Диссоциированные эпителиальные или раковые клетки молочной железы образуют сфероиды в биоинках на основе альгината только тогда, когда они в ловушке в круглых формах PDMS. В других случаях, сфероиды были сформированы с использованием подвесных капель в ультра-низкой крепления круговых пластин хорошо, а затем смешивается в альгинат наоснове биоинк 39,40.

Теперь в этом протоколе мы описываем альтернативный метод биофактирования 3D-тканей. Вместо того, чтобы семена диссоциированных клеток и ждать этих клеток, чтобы сформировать 3D структуры, мы описываем, как создать и биопечать 3D-сфероидов опухоли на сосудистой сети трубки для создания опухоли совместно культуры модели, которые могут быть использованы почти сразу. Опухолевые сфероиды могут быть выращены в пробирке или получены из тканей человека (органоидов). Аналогичным образом, сосудистые трубки могут быть выращены или могут быть получены из жировой ткани микрососудистых фрагментов. Биоинкс может варьироваться от биологически неактивного альгината до высоко биологически активного Matrigel41. Так как эта 3D-модель совместной культуры опухоли может быть создана с различными клеточными структурами и биоинками, она может включать в себя несколько типов клеток, внеклеточные матрицы, и химиокинградиенты 15,42. Хотя в своей нынешней формулировке эндотелиальные сети не могут быть пронизаны, будущие итерации могут интегрировать этот метод с микрофлюидами или системами-чипами. Биопечать 3D эпителиальных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети позволяет быстро биофабрикацию моделей груди человека для тестирования на наркотики и персонализированной точноймедицины 27.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Рост эпителиальных клеток молочной железы и анализ СРЕДСТВ массовой информации

  1. Эпителиальные клетки молочной железы MCF10A
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неоморогенная увековеченная линия эпителиальных клеток молочной железы происходит от пациента с фиброзистным заболеванием43. Клетки не выражают рецептор эстрогена.
    1. Для подготовки 20 мкг/мл эпидермального фактора роста (EGF) растворяют 100 мкг лиофилизированного EGF в 500 МКЛ стерильного dH2O, чтобы сделать 200 мкг/мл EGF. Добавьте 500 мкл из 200 мкг/мл EGF в 4,5 мл стерильных 0,1% BSA в dH2O, чтобы сделать 20 мкг/ мл EGF фондовый раствор. Хранить подготовлено 20 мкг/мл ЕГФ aliquots при -20 градусов по Цельсию на срок до 12 месяцев.
    2. Для приготовления гидрокортизона 500 мкг/мл разбавляют 1 мг гидрокортизона в 1 мл абсолютного этанола (200 доказательств). Добавьте 1 мл стерильного DMEM F:12 в эту смесь, чтобы сделать раствор гидрокортизона 500 мкг/мл. Хранить гидрокортизон акции aliquots при -80 градусов по Цельсию на срок до 12 месяцев.
    3. Чтобы подготовить 10 мкг/мл холерного токсина, растворите 1 мг лиофилизированного порошка токсина холеры в 1 мл стерильного dH2O, чтобы сделать раствор токсина 1 мг/мл холеры. Храните запасы токсинов холеры при -80 градусов по Цельсию в течение 12 месяцев.
    4. Для подготовки среды роста добавьте 500 л EGF (20 мкг/мл), 500 л гидрокортизона (500 мкг/мл), 5 мкл токсина холеры (1 мг/мл), 500 л бычьего инсулина (10 мг/мл), 10 мл пенициллина и стрептомицина, и 25 мл конской сыворотки до 500 мл DMEM F:12 для окончательной концентрации 20 нг/мл EGF, 500 нг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл токсина холеры, 10 нг/мл бычьего инсулина, 2% v/v пенициллин и стрептомицин, и 5% v/v сыворотки лошади. Концентрация антибиотиков была увеличена до 2% с учетом снижения стерильности в процессе биопечати; однако концентрация антибиотиков может быть снижена до 1%.
    5. Для подготовки Assay Medium добавьте 500 л гидрокортизона (500 мкг/мл), 5 л токсина холеры (1 мг/мл), 500 л бычьего инсулина (10 мг/мл), 10 мл пенициллина и стрептомицина, и 25 мл конской сыворотки до 500 мл DMEM F:12 для окончательной концентрации 500 нг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл токсина холеры, 10 нг/мл бычьего инсулина, 2% в/в пенициллин и стрептомицин, и 5% v/v сыворотки лошади.
  2. МДА-МБ-231
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тройной отрицательный (отсутствие рецептора эстрогена, рецептор прогестерона, и рецептор эпидермального фактора роста 2) эпителиальной клеточной линии рака молочной железы создается из плеврального выпота пациентки с метастатической аденокарциномоймолочной железы 44. Клетки представляют собой агрессивный, инвазивный и плохо дифференцированный рак молочной железы.
    1. Для подготовки роста и анализа среднего, добавить 50 мл сыворотки крупного рогатого скота плода, 10 мл пенициллина и стрептомицина, и 25 мл сыворотки лошади до 500 мл DMEM для окончательной концентрации 10% v/v сыворотки крупного рогатого скота плода, 2% v/v пенициллин и стрептомицин, и 5% v/v сыворотки лошади.

2. Культура эпителиальных клеток молочной железы

  1. Семя 500000 MCF10A или MDA-MB-231 клеток в 10 см (P100) ткани культуры блюдо с 10 мл MCF10A или MDA-MB-231 роста средств массовой информации. Клетки MCF10A и MDA-MB-231 достигают 90% слияния за 48 часов.
  2. Для прохождения эпителиальных клеток молочной железы сначала промывка клеток с 10 мл теплого PBS.
  3. Отсоедините эпителиальные клетки груди, добавив в блюдо 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Поместите блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 20-25 минут.
  4. Добавьте 5 мл MCF10A или MDA-MB-231 Growth Medium в трипсинизированные клетки для нейтрализации трипсина. Pipette ячейки-медиа смесь вверх и вниз, чтобы повторно использовать клетки и разбить кластеров клеток.
  5. Добавьте подвеску клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу при 1200 х г в течение 3 минут. Тщательно аспирировать супернатант и повторно использовать клеточные гранулы в 5 мл MCF10A или MDA-MB-231 Среднего роста.
  6. Плита 1 мл клеточной подвески в 5 новых 10 см ткани культуры блюда вместе с MCF10A или MDA-MB-231 Среднего роста. Поместите блюда в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Клетки будут готовы к прохождению снова через 2-3 дня. Клетки MCF10A могут поддерживаться до прохождения no35, после чего они показывают морфологические изменения. Клетки MDA-MB-231 могут поддерживаться до 24-го прохода, после чего они показывают морфологические изменения.

3. Формирование эпителиального сфероида молочной железы

  1. Заморозить 200 мкл пипетки советы в течение 30 минут до начала анализа. Держите фактор роста уменьшенный матричный раствор (например, Matrigel) (10 мг/мл) на льду в течение всего процесса.
  2. Медленно пипетка 30 йл ледяного матричного раствора с использованием ледяного 200 МКЛ пипетки советы в каждый колодец 8-ну камерный слайд. Начните со стороны и перетащите наконечник пипетки по углам, добавив окончательное падение в центр хорошо, чтобы обеспечить даже покрытие каждого хорошо. Избегайте пузырьков воздуха во время этого шага, чтобы обеспечить единый слой решения матрицы. Используйте новые советы пипетки для каждой хорошо.
  3. Инкубационный камера скользит в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 15-20 минут для полимеризации матричного раствора.
  4. Resuspend трипсинированных клеток MCF10A в MCF10A Анализ Средний на 200000 клеток / МЛ или повторного анализа трипсинизированных MDA-MB-231 клеток в MDA-MB-231 Среднего роста на 200000 клеток / МЛ.
  5. При использовании клеток MCF10A подготовьте свежие MCF10A Spheroid Growth Medium, добавив 5 МКЛ EGF (20 мкг/мл) и 100 МКЛ матричного раствора к 5 мл Assay Medium для окончательной концентрации 2% матричного раствора.
  6. Удалите камерный слайд, предварительно на покрытие матричного раствора, из инкубатора. Добавьте 50 МКФ10А или MDA-MB-231 клеточной подвески (10 000 клеток) к каждой хорошо. При использовании клеток MCF10A добавьте 450 МКЛ mcF10A Spheroid Growth Medium. При использовании клеток MDA-MB-231 добавьте 450 МКЛ MDA-MB-231 Growth Medium, предварительно смешанных с 2% матричным раствором (9 МЛ). Немедленно поместите горку камеры в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  7. Замените носитель каждые 4 четыре дня. Тщательно пипетка 200 йл старых средств массовой информации из одного угла каждой хорошо с помощью 200 йл пипетки отзыв. Во время этого процесса наклоните слайд камеры на 45 градусов, чтобы гарантировать, что сфероиды не нарушаются. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного MCF10A Spheroid Growth Medium или MDA-MB-231 Growth Medium, ранее смешанного с 2% матричным раствором для каждой хорошо на углу в каплях, чтобы гарантировать, что сфероиды остаются прикрепленными к матричному слою. Только 50% средств массовой информации заменяется таким образом, чтобы все цитокины, производимые сфероидами, не были полностью истощены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MCF10A груди эпителиальных сфероидов занять до 8 дней, чтобы поляризовать и сформировать полые центры. MDA-MB-231 груди эпителиальных сфероидов занять до 5 дней, чтобы сформировать и не имеют полых центров.

4. Формирование эндотелиальной сотовой сети

  1. Человеческая пупочная вена эндотелиальная клетка (HUVEC) Культура
    1. Добавьте содержимое одного эндотелиального набора роста Medium-2, содержащего фактор роста инсулина, фактор роста фибробластов, сосудистый эндотелиальный фактор роста, аскорбиновую кислоту, эпидермальный фактор роста, гепарин и гентамицин-амфотерицин В, а также 50 мл сыворотки крупного рогатого скота плода, 5 мл пенициллина-стрептомицина и 5 мл 200 мл глутамина до 500 мл эндотелиального базального среднего-2 (EBM-2) для создания полного эндотелиального роста среднего (EGM-2).
    2. Семя 500000 эндотелиальных клеток в 10 см ткани культуры блюдо в 10 мл EGM-2. Поместите клетки в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 до тех пор, пока они не достигнут 80% слияния (около 48 часов).
    3. Чтобы пройти клетки, мыть эндотелиальные клетки с 10 мл теплого PBS. Отсоедините HUVEC, добавив 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА к 10 см ткани культуры блюдо. Внимательно следите за клетками с помощью фазовой контрастной микроскопии. Клетки готовы, когда они с мячом, но остаются прикрепленными к блюду.
    4. Тщательно аспирировать трипсина из блюда. Добавьте в блюдо 8 мл EGM-2. Вымойте клетки с тарелки, трубя EGM-2 вверх и вниз по всей поверхности тарелки.
    5. Кроме того, добавьте 5 мл EGM-2 в трипсинизированные клетки для нейтрализации трипсина. Pipette ячейки-медиа смесь вверх и вниз, чтобы повторно использовать клетки и разбить кластеров клеток. Добавьте подвеску клетки в коническую трубку 15 мл и центрифугу при 1200 х г в течение 3 минут. Тщательно аспирировать супернатант и повторно помыть клеточные гранулы в 10 мл EGM-2.
    6. Добавьте 1 мл клеточной суспензии до 9 мл EGM-2 в 10-сантиметровую культурную тарелку. Поместите блюда в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Обмен 2/3 среды со свежим EGM-2 каждые 2 дня. Клетки будут готовы к прохождению через 3-5 дней. HUVEC может поддерживаться до прохождения 8, после чего они не образуют сети.
  2. Формирование сети эндотелиальных клеток (HUVEC)
  3. Заморозить 200 мкл пипетки советы в течение 30 минут до начала анализа. Держите фактор роста уменьшенный матричный раствор (10 мг/мл) на льду в течение всего процесса.
  4. Медленно пипетка 30 йл ледяного матричного раствора с использованием ледяного 200 МКЛ пипетки советы в каждый колодец 8-ну камерный слайд. Начните со стороны и перетащите наконечник пипетки по углам, добавив окончательное падение в центр хорошо, чтобы обеспечить даже покрытие каждого хорошо. Избегайте пузырьков воздуха во время этого шага, чтобы обеспечить единый слой решения матрицы. Используйте новые советы пипетки для каждой хорошо.
  5. Инкубационный камера скользит в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 15-20 минут для полимеризации Matrigel.
    1. Предварительно пятно 10 см блюдо HUVEC с 10 йл красных клеток трекер (1:1000) в течение 30 минут в 37 КК, 5% CO2 инкубатор.
    2. Вымойте эндотелиальные клетки с 10 мл теплого PBS. Отсоедините HUVEC, добавив 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА к 10 см ткани культуры блюдо. Поместите блюдо в инкубатор 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 5 минут, чтобы полностью отделить клетки.
    3. Добавьте 5 мл EGM-2 в блюдо, чтобы нейтрализовать трипсин. Перенесите подвесную клетку на коническую трубку 25 мл. Центрифуга HUVEC при 1200 х г в течение 5 минут. Аспирировать супернатант и повторно помыть клеточные гранулы в 5 мл без сыворотки EBM-2.
    4. Подсчитайте клетки, использующие Trypan blue для определения жизнеспособных клеток. Создайте решение 1 x 106 cell/mL.
    5. Добавьте 100 000 HUVEC к каждому колодец с 200 йл сыворотки бесплатно EBM-2. Если добавить больше ячеек, они создадут поверхностный монослой, а не трубчатую сеть.
    6. Инкубировать HUVEC в инкубаторе 37 градусов по Цельсию, 5% CO2. Через 6 часов изображение HUVEC сети фазовой контрастной микроскопии. Сети теперь готовы к совместной культуре с сфероидами груди.

5. Биопечать эпителиальных сфероидов молочной железы на предварительно сформированных сетях HUVEC

ПРИМЕЧАНИЕ: Для процесса биофабрикации следует использовать двойную систему биоотсада сопла. В этом случае система имела три рукоятки движения, позволяющие микрон-масштабу пространственного контроля осаждения материала, а также два винтовых двигателя для депонирования биоуровни от шприцев 10 мл. Система должна быть функциональной с высокой эффективностью системы фильтрации твердых частиц воздуха, а также УФ-стерилизации возможностей для поддержания стерильной среды во время биопечати. Биопринтер стерилизуется в течение часа до начала процесса печати.

  1. Создание груди эпителиальных сфероидов и HUVEC сетей, как описано ранее. Оцените количество эпителиальных сфероидов молочной железы в каждой хорошо, подсчитывая сфероиды в репрезентативной фазе контрастной микроскопии изображений.
  2. Отрежьте 0,5 см от конца наконечника пипетки 1000 мкл. Используйте наконечник вырезать пипетку, чтобы тщательно пипетки все сфероиды из 8-ну камеры слайда и в 50 мл трубки. Resuspend сфероиды в выбранном биоинке на 100 сфероидов/100 йл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие концентрации сфероидов могут привести к кластеризации сфероидов и предотвратить визуализацию взаимодействий между сфероидами и эндотелиальными сетями.
  3. Передавайте сфероидную смесь через 70 мкм-клеточный ситечко, чтобы удалить любые крупные или кластерные сфероиды.
  4. Загрузите саплоиды в стерильный шприц 10 мл и крышка его с 25-го калибра стерильной иглой. Прикрепите шприц к системе био-осаждения.
  5. Аспирировать среды от сетей HUVEC в 8-колодец камеры слайда.
  6. Экструд 100 МКЛ эпителиальных сфероидов молочной железы на 6 скважин сетей HUVEC со скоростью потока 1 мл/мин. Поддерживайте 2 скважины сетей HUVEC в качестве элементов управления.
  7. Добавьте 400 МКФ10А Spheroid Growth Medium при использовании сфероидов MCF10A, напечатанных в сетях HUVEC, или добавьте 400 МКВ MDA-MB-231 Growth Medium, ранее смешанную с 2% матричным раствором при использовании сфероидов MDA-MB-231, напечатанных на сетях HUVEC. Соответствующая среда роста сфероидов должна использоваться в контрольных скважинах HUVEC.
  8. Инкубировать совместно культур в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор в течение 24 - 96 часов без изменения средств массовой информации. Со-культуры будут оставаться жизнеспособными в первоначальной среде на срок до четырех дней.

6. Конфокальные микроскопии

  1. Иммунофторесценция и PBS-Глицин мыть буфер подготовки
    1. Подготовка иммунофторесценции (IF) буфер 10x фондовый раствор, добавив 2,5 г азида натрия, 5 г бычьего альбумин сыворотки, 10 мл Triton X-100, и 2,05 мл Tween-20 в 500 мл 10x PBS. Отрегулируйте рН до 7,4. Храните раствор на складе до года при 4 градусах Цельсия, чтобы избежать осадков.
    2. Создайте рабочий буфер IF, разбавляя 50 мл буфера 10x IF в 450 мл стерильной деионизированной воды. Храните рабочий раствор при комнатной температуре до одной недели.
    3. Подготовье 10x PBS-Glycine буферный запас раствор, добавив 37,5 г глицина до 500 мл 10x PBS. Отрегулируйте рН до 7,4. Храните раствор на складе до 6 месяцев при 4 градусах Цельсия, чтобы избежать осадков.
    4. Создайте рабочий раствор PBS-Glycine, разбавляя 50 мл буфера 10x PBS-Glycine в 450 мл стерильной деионизированной воды. Храните рабочее решение при 4 градусов по Цельсию в течение одной недели.
  2. Этикетка Биопечатные образцы и изображения по конфокальные микроскопии
    1. Аспират среды из биопечатных 3D-ко-культур и промыть 3 раза с теплой PBS. Исправить биопечатные 3D-ко-культуры с 4% параформальдегида для 1 ч при комнатной температуре. Промыть образцы 3 раза в течение 20 минут с 1x PBS-глицин.
    2. Блок образцов с буфером IF смешивается с 10% козьей сыворотки в течение 90 минут (первичный блок), а затем 40 минут с буфером IF плюс 10% козьей сыворотки и фрагмент Affinipure Fab (1:100, вторичный блок).
    3. При использовании сфероидов MCF10A, образцы этикетки с первичным антителом для интегрина No 6 (1:100) во вторичном блокируя буфере на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию, а затем Alexa Fluor 488 вторичных антител (1:200) и Hoescht 33342 (1:1000) для 1 ч при комнатной температуре защищены от света. Клеточные линии MCF10A выражают высокий уровень интегрина No6, который необходим для отображения сфероидной поляризации и морфологии.
    4. При использовании сфероидов MDA-MB-231, которые выражают низкий уровень интегрина No6, этикетки образцов с Alexa Fluor 488 фаллоидин (1:100) и Hoescht 33342 (1:1000) во вторичном блокируя буфер в течение 4 часов при комнатной температуре защищены от света. Фаллоидин позволяет актин нити визуализации так сфероидных аморфных и инвазивных морфологии могут быть оценены.
    5. Вымойте образцы с 1X PBS-глицин 3 раза в течение 20 минут.
    6. Подготовьте образцы для монтажа, удалив слайд камеры с помощью инструмента производителя. Добавьте небольшую каплю антифадного раствора к каждой хорошо. Поместите 22 мм х 60 мм крышки на каждой камере слайд и тщательно запечатать края с четким лаком для ногтей.
    7. Образцы изображений с использованием конфокального микроскопа в качестве стеков из 10 ломтиков в 5 мкм шагов. При желании сжать плоскости в одну плоскость, используя команду Extended Focus в программном обеспечении для визуализации клеток.
    8. Количественная оценка сфероидной адгезии к эндотелиальным сетям с помощью изображения J. Количество прилипаемых сфероидов можно количественно определить с помощью плагина анализа с соответствующим размером частицы и круговоротом. Нормализует количество прикрепленных сфероидов к области изображения.
    9. Для обеспечения воспроизводимости, количественно количество придерживающихся сфероидов в 4 х 4 черепичные изображения со-культур. Если число сфероидов статистически значительно ниже, чем в других экспериментах, эксперимент следует повторить.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Грудные эпителиальные клетки должны самообориться в 3D сфероиды после 5-8 дней культуры на матричном растворе и в культурной среде с 2% матричным раствором. Неоморогенные MCF10A груди эпителиальных сфероидов должны появиться круглые и имеют полый центр, с интегрином No 6 поляризованы на внешний край сфероида (Рисунок 1, вставка показывает полые центры). Высокоинвазивные МДА-МБ-231 эпителиальные клетки рака молочной железы образуют нерегулярные сфероиды. Сфероиды должны использоваться, когда ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол является первым в своем роде биопечать сфероидов в их 3D архитектуры для совместной культуры с эндотелиальных клеток также в их 3D архитектуры. Критические этапы протокола включают первоначальное образование сетей эпителиальных сфероидов молочной железы и HUVEC. Чрезвычайная осторожность должна быть приняты при кормлении груди эпителиальных сфероидов, так как они легко нарушаются из матричного раствора. Аналогичным образом, эпителиальные сфероиды груди должны рассматриваться с осторожностью, когда они трубч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось NIH 1R01HL140239-01 для AMC. Мы хотели бы поблагодарить Центр визуализации клеток при Университете Дрекселя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
37° C инкубатор, 5% CO2 и 95% влажностиSanyoMCO-20AICCell инкубационный
3D биопринтерна заказНетИспользуется для биопечати
8-луночные камерные слайдыVWR, Radnor, PA53106-306для посева сфероидов
игла 25 калибраSigma, Сент-Луис, МиссуриZ192406-100EAбиопечать шприц игла
Абсолютный этанол (200 пруф) Sigma, Сент-Луис, МиссуриE7023-500MLвосстановление компонентов среды
Affinipure F(ab′)2 фрагмента козьего антимышиного IgGJackson ImmunoResearch, Вест Гроув, Пенсильвания115006020вторичный блок - Иммунофлуоресценция
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Вторичное антитело - Иммунофлуоресцентный
бычий инсулинSigma, Сент-Луис, МиссуриI-035-0.5MLMCF10A Медиадобавка
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma, Сент-Луис, МиссуриA2153-500GБлокатор -Иммунофлюоресцентный
Falcon 70 & микро; m Сетчатый фильтрCorning, Corning, NY352350Удалить большие или кластеризованные сфероиды
CellTracker™ Красный краситель CMTPXThermo Fisher, Waltham, MAC34552предварительная морилка для пробирок HUVEC
Компактная центрифугаHermle-Labnet, Edison, NJZ206AДля клеточных центрифугий
Холерный токсинSigma, Сент-Луис, МиссуриC8052-.5MGMCF10A Медиадобавка
Конические пробирки 15 млVWR, Radnor, PA62406-200Сбор и ресуспендирование клеток
Countess II-FL Счетчик клетокThermo Fisher, Waltham, MAAMQAF1000счетные клетки
Стеклянные пипетки (10 мл)VWR, Radnor, PA76184-746ресуспензия клеток
DMEM F:12Thermo Fisher, Waltham, MA11320033MCF10A базальная среда
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 базальная среда
Эндотелиальная базальная среда-2 (EBM-2)Lonza, Durham, NCCC-3156HUVEC базальная среда
для роста эндотелия-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162В комплекте с набором пуль (содержащих факторы роста)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MAМаркировка MDA-MB-231 сфероиды
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаCytiva, Logan, UTSH30071.03HUVEC/MDA-MB-231 медиа добавка
Козья сывороткаThermo Fisher, Waltham, MA16210064Иммунофлуоресцентный компонент мечения
GlycineSigma, St.Louis, MOG8898-500Gиммунофлуоресцентный буферный компонент
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249Окрашивание ядер иммунофлуоресценцией
Лошадиная сывороткаThermo Fisher, Waltham, MA16050130MCF10A Медиа добавка
ГидрокортизонСигма, Сент-Луис, МиссуриH0888-5GMCF10A Медиааддитивная добавка
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs)Применение в клетках, Сан-Диего, Калифорния200-05fЭндотелиальные клеточные линии
Integrin α 6Millipore, Billerica, MAMAB1378Иммунофлуоресцентный компонент мечения сфероидов
Live DeadThermo Fisher, Waltham, MAL3224Анализ окрашивания живых и мертвых клеток на жизнеспособность клеток
LSM 700 Confocal microscope Zeiss, Thornwood, NYИспользуется для визуализации клеток
Matrigel - сниженный фактор роста 10 мг/млVWR, Radnor, PA354230Spheroid формация
MCF10A клеткиATCCCRL-10317Клеточная линия молочной железы
MDA-MB-231 клеткиATCCHTB-26Клеточная линия молочной железы
ПараформальдегидSigma, Сент-Луис, Миссури158127-500Gклеточный фиксатор
пенициллин и стрептомицинThermo Fisher, Waltham, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Медиа добавка
Фосфат буферизованный Физиологический раствор 1X (PBS)Thermo Fisher, Waltham, MA7001106Промывочный буфер для клеток перед трипсинизацией
Фосфатный буфер физиологический раствор 10XThermo Fisher, Waltham, MAAM9625иммунофлуоресцентный буферный компонент
Prolong gold antifadeThermo Fisher, Waltham, MAP36934иммунофлуоресцентная монтирующая среда
Рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека, EGFPeprotech, Rocky Хилл, Нью-ДжерсиAF-100-15MCF10A/ компонент пробирной среды
Азид натрияСигма, Сент-Луис, МиссуриS2002-25Gиммунофлуоресцентный буферный компонент
Стерильный шприц (10 мл)VWR, Раднор, Пенсильвания75846-757процесс биопечати
Чашка для культуры тканей (10 см)VWR, Раднор, Пенсильвания25382-166монослойная клеточная культура
Triton X-100Sigma, Сент-Луис, МиссуриT8787-250MLиммунофлуоресцентный буферный компонент
Трипановый синий 0,4%Thermo Fisher, Waltham, MA15250061клеточная контраддитивная добавка
Trypsin-EDTA 0,05%Thermo Fisher, Waltham, MA25300054отслоение клеток
Tween -20Thermo Fisher, Waltham, MA85113иммунофлуоресцентный буферный компонент
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20HUVEC Программное
обеспечение для визуализации клеток Volocity 6.3PerkinElmer, Hopkinton, MAZ Stack Compresser

Ссылки

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19(2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66(2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671(2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589(2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101(2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003(2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285(2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145(2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3DHUVEC
Прямая биопечать 3D многоклеточных сфероидов молочной железы на эндотелиальные сети
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.