Методическая статья

Некодирующая малая РНК MicC способствует вирулентности белков наружной мембраны Salmonella enteritidis

DOI:

10.3791/61808

⸱

27 января 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Agricultural Vocational College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система рекомбинации, опосредованная λ-красным, была использована для создания мутанта делеции небольшой некодирующей РНК micC.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некодирующая малая РНК (сРНК) является новым фактором регуляции экспрессии генов на посттранскрипционном уровне. Разновидность sRNA MicC, известная в Escherichia coli и Salmonella Typhimurium, может подавлять экспрессию белков внешней мембраны. Для дальнейшего изучения функции регуляции micC в Salmonella Enteritidis мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis 50336, а затем сконструировали мутант 50336Δ micC с помощью системы рекомбинации на основе λ Red и комплементированного мутанта 50336Δ micC/p micC, несущего рекомбинантную плазмиду pBR322, экспрессирующую micC. Результаты qRT-ПЦР показали, что транскрипция ompD в 50336Δ micC была в 1,3 раза выше, чем у штамма дикого типа, в то время как транскрипция ompA и ompC у 50336ΔmicC была в 2,2 раза и 3 раза выше, чем у штамма дикого типа. Они указывали на то, что micC подавляет экспрессию ompA и ompC. В следующем исследовании патогенность 50336ΔmicC была обнаружена как у 6-недельных мышей Balb/c, так и у 1-дневных цыплят. Результат показал, что LD 50 штамма дикого типа 50336, мутанты 50336Δ micC и 50336Δ micC/pmicC для 6-недельных мышей Balb/c составляли 12,59 КОЕ, 5,01 КОЕ и 19,95 КОЕ соответственно. LD50 штаммов для 1-дневных цыплят составляли 1,13 x 109 КОЕ, 1,55 x 10 8 КОЕ и 2,54 x 108 КОЕ соответственно. Он указал, что удаление micC повышает вирулентность S. Энтеритидис у мышей и цыплят путем регулирования экспрессии белков наружной мембраны.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некодирующие малые РНК (сРНК) имеют длину 40-400 нуклеотидов, которые обычно не кодируют белки, но могут быть транскрибированы независимо в бактериальных хромосомах 1,2,3. Большинство мРНК кодируются в межгенных областях (IGR) между областями, кодирующими гены, и взаимодействуют с целевыми мРНК посредством действий спаривания оснований и регулируют экспрессию генов-мишеней на посттранскрипционном уровне 4,5. Они играют важную роль в регуляции метаболизма веществ, синтезе белка внешней мембраны, восприятии кворума и экспрессии гена вирулентности5.

MicC представляет собой 109-нуклеотидный малый транскрипт РНК, присутствующий в сероварах Escherichia coli и Salmonella enterica Typhimurium, который может регулировать экспрессию нескольких белков внешней мембраны, таких как OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 и Omp36 6,7,8,9. MicC регулирует экспрессию OmpC путем ингибирования связывания рибосом с лидером мРНК ompC in vitro, и для его функции в Escherichia coli6 требуется шаперон РНК HfQ. В Salmonella Typhimurium MicC подавляет мРНК ompD через дуплекс РНК ≤12.н. в кодирующей последовательности (кодоны 23-26), а затем дестабилизирует эндонуклеолитическую мРНК7. Этому процессу регуляции помогает белок шаперона Hfq10. OmpC представляет собой обильный белок внешней мембраны, который, как считалось, важен в средах с высокими концентрациями питательных веществ и токсинов, например, в кишечнике6. Порин OmpD является наиболее распространенным белком наружной мембраны Salmonella Typhimurium и составляет около 1% от общего количества клеточного белка11. OmpD участвует в адгезии к макрофагам человека и эпителиальным клеткам кишечника12. MicC также подавляет экспрессию пор как OmpC, так и OmpD. Считается, что MicC может регулировать вирулентность. Чтобы исследовать новые гены-мишени, регулируемые MicC, и изучить функцию регуляции вирулентности micC, мы клонировали ген micC в штамме Salmonella Enteritidis (SE) 50336, а затем сконструировали мутант 50336ΔmicC и дополненный мутант 50336ΔmicC/p micC. Новые гены-мишени были проверены с помощью qRT-PCR. Вирулентность 50336ΔmicC была обнаружена мышами и куриными инфекциями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального исследовательского совета. Комитет по уходу за животными и их использованию Университета Янчжоу одобрил все эксперименты и процедуры, применяемые к животным (SYXK2016-0020).

1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования

  1. Используйте бактерии и плазмиды, перечисленные в таблице 1.
  2. Культивируйте бактерии в бульоне LB или на планшетах с агаром LB при 37 ° C в присутствии 50 мкг / мл ампициллина (Amp), когда это необходимо.
  3. Культуральные штаммы, содержащие чувствительные к температуре плазмиды, используются для построения делеционных мутантов при 30 ° C.

2. Клон гена micC S. Штамм Enteritidis 50336

  1. На основе восходящей и нисходящей последовательности гена micC S. Штамм Typhimurium SL1344, разрабатывает праймеры vmicC-F и vmicC-R для амплификации фрагмента, содержащего ген micC, методом ПЦР с использованием геномной ДНК SE50336 в качестве матрицы.
  2. Смешайте 5 мкл 10-кратного реакционного буфера ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймеров vmicC-F и vmicC-R соответственно, 5 мкл шаблона, 1 мкл ДНК-полимеразы Taq и 35 мкл ddH2O вместе для ПЦР.
  3. Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 53 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.
  4. Секвенируйте продукт ПЦР, чтобы получить последовательность гена micC .

3. Построение мутанта делеции micC

ПРИМЕЧАНИЕ: micC-отрицательный мутант штамма Salmonella Enteritidis 50336 был построен с использованием λ-красной опосредованной рекомбинации, как описано ранее13,14. Используемые грунтовки перечислены в таблице 2.

  1. Амплификация хлорамфеникола кассетой, содержащей фрагменты гомологии гена micC .
    1. Разработка праймеров micC-F и micC-R для амплификации кассеты хлорамфеникола (Cm) из плазмиды pKD3, включая расширения гомологии на 50.н. из 5' и 3' гена micC .
    2. Извлеките плазмиду pKD3 в качестве шаблона ПЦР.
    3. Смешайте 5 мкл 10-кратного реакционного буфера для ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймеров micC-F и micC-R, соответственно, 5 мкл шаблона, 1 мкл ДНК-полимеразы Taq и 35 мкл ddH2O вместе в качестве реакционной смеси ПЦР
    4. Амплифицируют кассету Cm при следующих условиях реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 1 мин, 52 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 10 циклов; 94 °C в течение 1 мин, 63 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.
    5. Определите размер продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле. Очистите и восстановите продукт ПЦР с помощью набора для восстановления геля ДНК и определите концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра.
      ВНИМАНИЕ: ПЦР необходимо проводить дважды. Первый продукт ПЦР разбавляли в соотношении 1:200 и использовали в качестве матрицы для вторичной ПЦР, чтобы исключить интерференцию дальнейшей рекомбинации плазмидой pKD3.
  2. Конструкция1-го рекомбинантного штамма 50336ΔmicC::cat
    1. Равномерно смешайте 100 мкл компетентных клеток SE50336 с 5 мкл плазмиды pKD46 и инкубируйте на льду в течение 30 мин. Тепловой шок вышеуказанной смеси при 42 ° C в течение 90 с и быстрый перенос смеси на лед в течение 2 мин для превращения плазмиды pKD46 в SE50336. Скрининг положительных колоний путем культивирования в течение ночи при 30 ° C на планшете, устойчивом к амперу (50 мкг / мл).
    2. Добавьте 30 мМ L-арабинозы в жидкую культуру SE50336/pKD46 и индуцируйте экспрессию рекомбиназы с помощью встряхивающей культуры при 30 °C в течение 1 часа. Затем подготовьте грамотные клетки.
    3. Смешайте 100 нг очищенного продукта ПЦР (этап 3.1) и 40 мкл компетентных клеток SE50336/pKD46 в чашку для электрошока (например, Bio-Rad). Осуществляют электрошоковое преобразование с параметрами напряжения 1,8 кВ, импульса 25 мкФ и сопротивления 200 Ω.
    4. После электропревращения смесь переносят в 1 мл среды SOC и встряхивают культуру при 150 об/мин и 30 °C в течение 1 ч. Затем намажьте смесь на планшет LB, резистентный к см (34 мкг / мл), и культивируйте при 37 ° C в течение ночи для скрининга положительной колонии.
    5. Культивируют вышеуказанную положительную колонию при 42 °C в течение 2 ч. Просейте колонию, чувствительную к Amp (50 мкг / мл), но устойчивую к Cm (34 мкг / мл) при 37 ° C в течение ночи, чтобы получить 1-й рекомбинантный штамм без pKD46.
  3. Определите 1-й рекомбинантный штамм 50336ΔmicC::Cat.
    1. Экстракт 50336ΔmicC::Геномная ДНК кошки в качестве шаблона ПЦР. Используйте те же компоненты реакции ПЦР, что и на шаге 2.1. Проведите ПЦР-реакцию в тех же условиях, что и на шаге 2.1.
    2. Определите размер продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле и секвенируйте продукт ПЦР.
  4. Сконструируйте делеционный мутант 50336ΔmicC.
    1. Электропорат 100 нг плазмиды pCP20 в 40 мкл 50336ΔmicC::Cat компетентные ячейки с параметрами напряжения 1,8 кВ, импульса 25 мкФ и сопротивления 200 Ω, экранные положительные трансформаторы на пластинах, устойчивых к амперу (50 мкг/мл), и см (34 мкг/мл) при 30 °C.
    2. Переносят вышеположительные превращения в нерезистентные LB и культивируют их в течение ночи при 42 ° C, а затем изолируют отдельные колонии на пластине LB при 37 ° C. Выберите колонию, чувствительную как к Amp, так и к Cm. Этот мутант является мутантом делеции micC SE50336Δ micC.
    3. Проверьте 50336ΔmicC с помощью ПЦР.
      1. Экстракт геномной ДНК 50336ΔmicC в качестве ПЦР-матрицы. Смешайте 5 мкл 10-кратного реакционного буфера для ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймера vmicC-F, 1 мкл праймера vmicC-R, 5 мкл шаблона, 1 мкл ДНК-полимеразы Taq и 35 мкл ddH2O для ПЦР.
      2. Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 53 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.

4. Конструкция дополненного штамма micC

  1. Дизайн праймеров pBR-micC-F и pBR-micC-R с рестрикционными сайтами NheI и SalI.
    1. Амплификация полноразмерного гена micC с боковыми последовательностями с использованием реакционной смеси ПЦР, содержащей 5 мкл геномной ДНК SE50336 в качестве матрицы, праймеры 1 мкл pBR-micC-F и 1 мкл pBR-micC-R в качестве праймеров, 5 мкл 10-кратного реакционного буфера для ПЦР, 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 2 мкл смеси dNTP (2,5 мМ) и 35 мкл ddH2O.
    2. Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 52 °C в течение 50 с, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин. Очистите и восстановите продукт ПЦР.
  2. Переваривают продукт ПЦР и плазмиду pBR322 соответственно с использованием рестрикционных ферментов NheI и SalI и лигируют их с помощью Т4-лигазы при 16 ° C в течение ночи для получения плазмиды pBR322-micC.
  3. Преобразуйте pBR322-micC в компетентные ячейки SE50336ΔmicC и просеивайте положительный преобразователь для получения дополненного штамма SE50336ΔmicC/pmicC. Извлеките плазмиду pBR322-micC из комплементарного штамма и проверьте ее с помощью рестрикционного фермента, расщепления и секвенирования.

5. Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени

  1. Культивирование SE50336, 50336ΔmicC и 50336ΔmicC/pmicC в среде LB в течение ночи при 24 °C с 180 об/мин встряхивают культивирование до OD600 2,0. Собирают бактериальный посев центрифугированием при 13000 об/мин в течение 2 мин.
  2. Извлеките общую РНК с помощью реагента TRIzol. Инкубируют 50 мкл изолированной РНК с 2 мкл ДНКазы I и 6 мкл 10-кратного буфера при 37 ° C в течение 30 мин для удаления ДНК. Определите количество РНК путем пипетирования 1 мкл образца РНК на микроспектрофотометр.
  3. Синтез кДНК
    1. Используйте 1 мкг общей РНК для синтеза кДНК в 20 мкл реакционной системы обратной транскрипции (4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл смеси фермента RT, 1 мкл смеси праймеров RT, 10 мкл общей РНК и 4 мкл ddH2O). Инкубировать над реакционной системой при 37 °C в течение 15 мин, а затем при 85 °C в течение 5 с.
  4. Дизайн праймеров основан на последовательности генов-мишеней ompA, ompC и ompD. Проведите ПЦР с обратной транскрипцией с использованием набора реагентов ЛТ. Компоненты реакции ПЦР содержат 2,5 мкл 10-кратного реакционного буфера ПЦР, 1 мкл смеси dNTP (2,5 мМ), 1 мкл праймеров гена-мишени (ompA, ompC или ompD), 2,5 мкл матрицы, 0,5 мкл ДНК-полимеразы Taq и 17,5 мкл ddH2O.
    1. Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 94 °C в течение 4 мин; 94 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 1 мин, 72 °C в течение 1 мин в течение 25 циклов и продление при 72 °C в течение 10 мин.
  5. Проведите ПЦР в режиме реального времени с использованием зеленого набора ОТ-ПЦР SYBR в приборе ОТ-РСТ в трех экземплярах.
    1. Используйте следующие компоненты реакции ПЦР: 10 мкл 2x буфера SYBR, 0,4 мкл прямого праймера и обратного праймера соответственно, 0,4 мкл RoxDye II, 2 мкл кДНК и 6,8 мкл свободного РНКазы H2O.
    2. Используйте следующие условия реакции ПЦР: предварительная денатурация при 95 °C в течение 1 мин в течение одного цикла; 95 °C в течение 5 с, 60 °C в течение 34 с в течение 40 циклов.
    3. Нормализуйте все данные к эндогенному эталонному гену gyrA. Используйте метод 2-ΔΔCT для количественной оценки данных15.

6. Анализы на вирулентность

  1. Культивируют SE50336, 50336ΔmicC и 50336ΔmicC/pmicC в средней и ранней стационарной фазе LB (OD600 из 2-3) при 24 °C, собирают центрифугированием и разбавляют до соответствующего КОЕ мл-1 в стерильном PBS.
  2. При мышиных инфекциях разбавляйте культивируемые штаммы до 10 КОЕ/200 мкл, 102 КОЕ/200 мкл и 103 КОЕ/200 мкл градиентной ресуспензии. Инфицируйте группы из пяти 6-8-недельных мышей Balb/c на штамм путем подкожной инъекции. Введите контрольной группе 200 мкл физиологического раствора.
  3. При куриных инфекциях разбавьте более трех штаммов до 107 КОЕ / 200 мкл, 108 КОЕ / 200 мкл и 109 КОЕ / 200 мкл градиентной ресуспензии. Заражают группы из двадцати 1-дневных цыплят на штамм путем подкожной инъекции.
  4. Ежедневно следите за признаками болезни и падежа подопытных животных. РассчитайтеLD 50 (средняя смертельная доза) через 14 дней после заражения, как описано ранее16. Обработайте данные с помощью программного обеспечения для анализа данных.
  5. В инфекционных группах собирают сердце, печень, селезенку, легкие и почки только что умерших цыплят. Отдельно взвесьте 0,5 г вышеперечисленных тканей и измельчите их стерильной операцией. Постепенно разбавляйте измельченные образцы, распределяйте их на пластине LB и культивируйте в течение 8-10 ч при 37 °C. Запишите количество штаммов сальмонеллы, колонизированных в тканях цыплят.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Построение мутанта 50336Δ micC и дополненного штамма 50336Δ micC /p micC
Результат клонирования гена micC показал, что этот ген состоял из 109.н., демонстрируя 100% идентичность с геном S. Тифимурий. На основе данных последовательности были успешно построены делеционный мутант 50336ΔmicC и дополненный мутант 50336ΔmicC/pmicC . В ч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С. Энтеритидис является важным факультативным внутриклеточным патогеном, который может инфицировать молодых цыплят и вызывает симптомы от энтерита до системной инфекции и смерти17,18. Кроме того, S. Enteritidis вызывает латентные инфекции у взрослых цыплят, а хронические носители загрязняют продукты птицеводства, что приводит к инфекциям пищевого происхождения у людей19. Патогенный механизм S. Enteritidis еще пре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам раскрывать нечего.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами Китайского национального научного фонда (No 31972651 и 31101826), Научного фонда высшего образования провинции Цзянсу (No 14KJB230002), Государственной ключевой лаборатории ветеринарной биотехнологии (No SKLVBF201509), гранта Фонда естественных наук Янчжоу (No YZ2014019), проекта, финансируемого Приоритетной академической программой развития высших учебных заведений провинции Цзянсу (PAPD).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
декстрозаSangon BiotechA610219для приготовления бульона
набор для очистки ДНКTIANGENDP214для очистки ДНК
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm Химический реагент10017608для приготовления бульона
K2HPO4Sinopharm Химический реагент20032116для приготовления бульона
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-Red
Mini Plasmid KitTIANGENDP106плазмидная экстракция
NaClSinopharm Химический реагент10019308для приготовления
бульона(NH4)2SO4Sinopharm Химический реактив10002917для приготовления бульона
PrimeScriptRRT Набор реактивов с gDNA Eraser TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202Лигирование
TRIzol Выделение РНК Invitrogen15596018
TryptoneOxoidLP0042для приготовления бульона
Экстракт дрожжейOxoidLP0021для приготовления бульона
центрифугаEppendorf5418
Аппарат для электрофорезаBio-Rad164-5050Электрофорез&
nbsp; Система электропорацииBio-Rad165-2100для бактериальной трансформации
СпектрофотометрBioTekEpochAbsorbance Detection
система ПЦР в реальном времениПрикладная система Biosystems7500qRT-PCR

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MicC RNAGene DeletionLambda Red RecombinationqRT PCR AnalysisLD50 AssayChloramphenicol CassetteElectroporation TransformationVirulence Enhancement

Похожие статьи