Методическая статья

Гетерологичная экспрессия и функциональный анализ рецепторов запаха Aedes aegypti к запахам человека в ооцитах Xenopus

DOI:

10.3791/61813

⸱

8 июня 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представлен протокол, который функционально характеризует ОШ комаров в ответ на запахи человека с использованием системы экспрессии ооцитов Xenopus в сочетании с двухэлектродным зажимом напряжения, обеспечивая новую мощную технику для изучения реакции ОШ комаров на воздействие запахов человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комар Aedes aegypti (Linnaeus), переносчик многих важных заболеваний человека, включая желтую лихорадку, лихорадку денге и лихорадку Зика, отдает предпочтение людям-хозяевам перед другими теплокровными животными в качестве кровавой пищи. Обонятельные сигналы играют решающую роль для комаров, когда они исследуют окружающую среду обитания и ищут человека-хозяина для получения пищи из крови, тем самым передавая болезни человека. Известно, что рецепторы запаха (ОШ), экспрессируемые в обонятельных сенсорных нейронах, отвечают за взаимодействие комаров-переносчиков с запахами человека. Чтобы получить более глубокое представление об обонятельной физиологии Ae. aegypti и исследовать их взаимодействие с человеком на молекулярном уровне, мы использовали оптимизированный протокол гетерологичной экспрессии ооцитов Xenopus для функционального анализа обонятельных рецепторов Ae. aegypti в ответ на запахи человека. Представлены три примера экспериментов: 1) Клонирование и синтез кРНК OR и корецептора рецептора запаха (Orco) из четырех-шестидневных антенн Ae. aegypti ; 2) Микроинъекции и экспрессия ОШ и ОР в ооцитах Xenopus ; и 3) Запись тока всей клетки от ооцитов Xenopus , экспрессирующих ORs/Orco комаров с помощью двухэлектродного зажима напряжения. Эти оптимизированные процедуры предоставляют исследователям новый способ изучения восприятия запаха человеком у комаров Aedes и выявляют основные механизмы, управляющие их активностью по поиску хозяина на молекулярном уровне.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комар желтой лихорадки Ae. aegypti может переносить многие смертельные заболевания, включая желтую лихорадку, лихорадку денге и лихорадку Зика, вызывая огромные страдания и гибель людей. Комары используют несколько сигналов, таких как CO2, запах кожи и тепло тела, чтобы найти своих хозяев1. Учитывая, что как люди, так и другие теплокровные животные продуцируютCO2 и имеют одинаковую температуру тела, кажется вероятным, что самки Ae. aegypti полагаются в первую очередь на запах кожидля различения хозяина. Однако это создает сложную картину, поскольку в одном из ранних исследований было выделено более 300 соединений из эманации кожи человека. Дальнейшие поведенческие анализы показали, что некоторые из этих соединений вызывают поведенческие реакции у Ae. aegypti 4,5,6,7, но как именно эти соединения обнаруживаются комарами, остается в значительной степени неизвестным. Недавние исследования, проведенные нашей группой, выявили несколько человеческих запахов, которые могут быть вовлечены в деятельность Ae. aegypti по поиску хозяина, хотя их роль еще предстоит подтвердить дальнейшими поведенческими анализами. Каким образом эти важные для человека запахи расшифровываются в периферической сенсорной системе Ae. aegypti, еще предстоит установить.

Насекомые обнаруживают пахучие вещества через хемосенсорную сенсиллу на своих обонятельных придатках. Внутри каждой из сенсилл на мембране обонятельных сенсорныхнейронов экспрессируются различные обонятельные рецепторы, в том числе обонятельные рецепторы (ОШ), ионотропные рецепторы (ИР) и вкусовые рецепторы (ГР). Эти ОШ отвечают за восприятие многих запахов, с которыми сталкиваются насекомые, особенно запахов, связанных с пищей, хозяевами и партнерами по спариванию 10,11,12,13. Предыдущее исследование, посвященное десиротизации функции ОШ у Anopheles gambiae с использованием системы экспрессии Xenopus в сочетании с двухэлектродным зажимом напряжения, показало, что ОШ Anopheles специально настроены на ароматические соединения, которые являются основными компонентами в человеческих эманациях. Недавнее исследование генома выявило до 117 генов OR у Ae. aegypti15. Следовательно, способ систематического изучения функций этих ОШ Aedes в ответ на биологически или экологически важные пахучие вещества, такие как запахи человека или стимулы для яйцекладки, предоставит полезную информацию для тех, кто стремится глубже понять химическую экологию или нейроэтологию Ae. aegypti.

Метод двухэлектродного зажима напряжения (TEVC) был первоначально разработан для изучения функции мембранных ионных каналов в середине 1990-х годов16,17. С тех пор TEVC используется для исследования ОШ различных видов насекомых 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Это функциональное исследование ОШ внесло существенный вклад в ответ на важные экологические вопросы у насекомых, в том числе: 1) Как насекомые находят источники пищи? 2) Как их привлекают летучие половые феромоны, выделяемые их брачными партнерами? 3) Как они находят идеальное место для откладки яиц для своего потомства? и 4) Существуют ли какие-либо соединения, растительного происхождения или синтетические, которые могут эффективно защитить человека от укусов насекомых? Ответы на эти вопросы имеют решающее значение для борьбы с такими важными переносчиками болезней, как комары.

Ряд других подходов, в том числе основанных на клеточной линии 293 эмбриональной почки человека (HEK293), системе пустых нейронов дрозофилы, нуклеазе цинкового пальца, эффекторной нуклеазе активатора транскрипции и системе редактирования генов CRISPR/Cas9, также использовались в функциональных исследованиях ОР 12,20,35,36,37. Тем не менее, все эти методы требуют навыков опытного молекулярного биолога и включают в себя множество потенциально искажающих факторов. Экспрессия TEVC/ооцитов способна напрямую измерять токи рецепторов, вызванные запахом, и ионную проводимость, а также имеет дополнительное преимущество, заключающееся в быстром быстром времени настройки, необходимом для экспрессии рецепторов из кРНК. Поэтому в данном исследовании мы использовали TEVC для изучения реакции одного Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) на несколько запахов, имеющих потенциальную биологическую значимость, показав, что ооциты, экспрессируемые с AaegOR55•AaegOrco, показали дозозависимую реакцию на человеческий запах бензальдегида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол для этой процедуры, «Уход за лабораторными животными и их использование», одобрен и контролируется (Комитет по уходу за животными и их использованию Обернского университета: утвержденный протокол # 2016-2987).

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез генов на заказ является жизнеспособной альтернативой клонированию генов комаров OR.

1. Коллекция комаров и обонятельных придатков (антенн)

  1. Поддерживайте комаров Ae. aegypti (получено от доктора Джеймса Бекнела, Министерство сельского хозяйства США, ARS, Исследовательское подразделение комаров и мух) при температуре 25 ± 2°C и фотопериоде 12: 12 (L:D) ч (освещение в 8 утра).
  2. Обезболить ~800 4-6-дневных самок комаров в возрасте 4-6 дней без кровного кормления с использованием CO2. Разрежьте усики комара (обонятельные ткани) под микроскопом (40x) с помощью ножниц и соберите в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, хранящуюся на сухом льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные усики можно хранить в морозильной камере при температуре -80 °C или использовать немедленно.

2. ОР Клонирование из усиков Ae. aegypti

  1. Извлеките общую РНК из антенн с помощью коммерчески доступного набора полной РНК в соответствии с протоколом производителя.
  2. Расщепите общую РНК с помощью коммерческого набора без ДНК, чтобы удалить ДНКазу и другие ионы в соответствии с протоколом производителя.
  3. Синтезируйте кДНК из 1,5 мкг свободной ДНК РНК с использованием системы синтеза первой нити Oligo d(T)20-primed SuperScript IV13,30.
  4. Разрабатывайте ПЦР-праймеры для генов OR в соответствии с последовательностями, доступными на VectorBase (https://www.vectorbase.org/), и специальными требованиями к месту разрезания фермента. Добавьте последовательность Козака (GCCACC), которая инициирует трансляцию у большинства эукариотических организмов, между местом разреза и стартовым кодоном в каждом прямом праймере30.
  5. Клонировать кодирующие последовательности генов OR методом ПЦР с использованием ген-специфичных праймеров, содержащих сайты эндонуклеазы рестрикции, и последовательность Козака в соответствии с протоколом производителя.
  6. Обнаруживайте продукты ПЦР с помощью 1% агарозного геля и очищайте с помощью коммерческого набора для экстракции геля в соответствии с протоколом производителя.
  7. Выполнение рекомбинантного конструирования плазмид путем клонирования продуктов ПЦР в вектор pT7Ts после расщепления ферментами рестрикции в соответствии с протоколом производителя.
  8. Верифицируйте рекомбинантные плазмиды с помощью секвенирования по Сэнгеру и подтвердите с помощью базы данных VectorBase.

3. Синтез кРНК

  1. Линеаризация сконструированных плазмид с помощью специфического фермента (ферментов) рестрикции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК плазмиды должна быть линеаризирована ферментом рестрикции, расположенным ниже по течению от транскрибируемого гена.
  2. Используйте линеаризованные плазмиды для синтеза кРНК с помощью коммерческого набора T7 в соответствии с предыдущим описанием 13,30.
  3. Предварительно смешайте кРНК OR и Orco (1:1) в центрифужной пробирке и аликвотируйте смешанную кРНК в объеме 2 мкл (250 нг/мкл/каждая) для каждой ПЦР-пробирки. Перед применением аликватированную кРНК храните при температуре -80 °C.

4. Сбор ооцитов Xenopus

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура проводится в соответствии с инструкцией Schneider et al.38.

  1. Обезболить Xenopus laevis в течение 20-30 мин в 1 л ультраочищенной воды с 1 г этилм-аминобензоата метансульфоната соли (рис. 1А). Ущипните один из пальцев ноги лягушки пальцами рук; Если реакции нет, лягушка достаточно обезболена и готова к операции. Переложите лягушку под наркозом на ледяную подушку.
  2. Хирургия
    1. Натрите брюшную область лягушки 10% раствором повидон-йода и протрите раствор чистыми ватными шариками. Повторите этот шаг 2 раза.
    2. Сделайте небольшой разрез на животе (10-15 мм, рисунок 1Б) с помощью одноразового скальпеля. Проникают в кожу, фасциально-мышечный слой отдельно. Разрез находится в нижней части живота, латерально по отношению к средней линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не травмируйте внутренние органы.
    3. Обхватите части долей яичников щипцами и аккуратно потяните наружу. Поднимите яичник и отрежьте его ножницами на уровне стенки тела. Повторите несколько раз, пока не будет получено достаточное количество материалов для яичников (~200 яйцеклеток, Рисунок 1C). Перенесите материалы яичников в буфер для промывки (96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 5 мМ MgCl2•6H2O, 5 мМ натриевая соль HEPES, 10 мкг/мл гентамицина, pH 7,6).
    4. Закройте операционные раны (как мышечные, так и кожные) рассасывающимися швами, которые обычно разрушаются и выпадают естественным образом через 10-14 дней.
    5. После каждой операции помещайте лягушку в 1 л восстановительного раствора (содержащего 3,4 г соли для консервирования и маринования и 2 г растворимой морской соли) до тех пор, пока она не проснется, а затем верните ее обратно в помещение для содержания лягушек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На каждой лягушке может быть проведено до 4 операций. Интервал между операциями каждой лягушки должен составлять более 2 месяцев.
  3. Ферментативное дефолликулированное пищеварение и культивирование ооцитов
    1. Разделите ооциты (~200 яйцеклеток, рисунок 1C) на небольшие кусочки.
    2. Перенесите все ооциты в раствор для пищеварения, включая 10 мл промывочного буфера (раздел 4.2.3) и 2 мг/мл коллагеназы В в течение 40-60 мин при температуре окружающей среды, чтобы удалить слои фолликулярных клеток. Исследуйте образцы под микроскопом, чтобы определить, были ли полностью дефолликулированы 80% ооцитов; Если нет, проверяйте каждые 10 минут, пока большая часть ооцитов не будет готова.
    3. Промыть ооциты 1x раствором Рингера (96 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 5 мМ MgCl2·6H2O, 5 мМ натриевой солью HEPES, pH 7,6), промывочным буфером (раздел 4.2.3), модифицированным солевым раствором Барта (78 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,33 мМ Ca(NO3)2·4H2O, 0,41 мМ CaCl2·2H2O, 0,82 мМ MgSO4·7H2O, 2,4 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES натриевая соль, 1,8 мМ пируват натрия, 10 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл стрептомицина, pH 7,6) последовательно (5 раз для каждого буфера, используя 10 мл каждый раз). Обширная промывка ооцитов буферами для удаления незрелых и некачественных ооцитов.
    4. Собирают ооциты на стадии V-VI по классификации Дюмона. Перенесите здоровые/качественные ооциты на стадии V-VI с четким разделением на белый/темный и без визуально очевидных повреждений (рис. 1D) в чашку Петри размером 100 мм x 15 мм, содержащую модифицированный физиологический раствор Барта (раздел 4.3.3). Выбросьте ооциты плохого качества (рисунок 1E). Поддерживайте переваренные ооциты в камерах роста насекомых при температуре 18 °C в течение примерно 24 часов перед микроинъекцией.

5. Микроинъекция кРНК и экспрессия рецепторов запаха (ORs) и корецепторов OR (Orco) в ооцитах Xenopus

  1. Поместите металлическую матрицу в чашку Петри размером 100 мм x 15 мм, добавляя модифицированный физиологический раствор Барта (раздел 4.3.3) до тех пор, пока матрица не погрузится в воду. Перенесите ооциты на матрикс, а ооциты отбросьте, которые не соответствуют размеру. Расположите ооциты так, чтобы вегетативные полюса располагались на верхней стороне (рис. 1F).
  2. Вытяните свежий стеклянный капилляр (наружный диаметр 1,0 мм x внутренний диаметр 0,5 мм, длина = 100 мм) для каждого образца с помощью съемника микротрубки (Heat = 525, Pull = 50, Velocity = 50, Time = 250) и заточите с помощью фаски для микропипеток под углом 25°. Установите капиллярную трубку на нанолитровый инжектор.
  3. Перед введением извлеките из морозильной камеры одну пробирку с предварительно смешанными кРНК OR и Orco (раздел 3.3) и положите ее на лед до полного растворения. Заполните капиллярную трубку смесью OR/Orco, нажав кнопку Fill на нанолитровом инжекторе.
  4. Введите 10 нг (5 нг ИЛИ + 5 нг Orco; ~20 нл) предварительно смешанной кРНК для каждого ооцита с помощью нанолитрового инжектора на станции, свободной от РНК. (Рисунок 1F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед инъекцией мы нажимаем кнопку EMPTY, чтобы выпустить небольшое количество смеси, чтобы убедиться, что капиллярная трубка не заблокирована. Подождите около 5 секунд, чтобы кРНК полностью проникли в ооцит.
  5. После инъекции ооциты храните на стерильном 24-луночном планшете для культивирования клеток с модифицированным физиологическим раствором Барта при температуре 18°C в течение 3-7 дней до регистрации целых клеток.

6. Регистрация тока всей ячейки с помощью двухэлектродной системы напряжения-зажима (Рисунок 2)

  1. Перед записью двухэлектродного зажима напряжения растворите отдельные соединения одоранта в диметилсульфоксиде (ДМСО) для получения серии исходных растворов (100 мкг/мкл). Разбавьте эти стоковые растворы 1x ND96 буфером (91 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2·2H2O, 2 мМ MgCl2·6H2O, 5 мМ натриевой солью HEPES, pH 7,6) в 1000 раз до получения набора рабочих растворов (0,1 мкг/мкл).
  2. Убедитесь, что все элементы виброизоляционного стола TMC, включая металлический экран, микроскоп, источник света и отработанный насос, тщательно заземлены, чтобы уменьшить влияние внешних электрических шумов на запись сигнала всей ячейки.
  3. Подготовьте микроэлектроды, вытягивая стеклянный капилляр (наружный диаметр 1,20 мм x внутренний диаметр 0,94 мм, длина = 750 мм) с помощью съемника микротрубок (Тепло = 525, Вытягивание = 50, Скорость = 50, Время = 250). Заполните капилляры 3 М KCl. Хлорируйте провода Ag/AgCl в течение 2-5 минут в 10% хлорном отбеливателе до тех пор, пока они не приобретут темно-серый цвет (бледно-серые провода Ag/AgCl необходимо хлорировать).
  4. Включите аппарат, включив зажим для ооцитов и дигитайзер Digidata (рис. 3A). Откройте программное обеспечение (например, Clampex 10.3) и нажмите кнопку «Запись ». Включите переключатель для 1x буфера ND96 (раздел 6.1) и насос для буфера отходов.
  5. Проведите предварительный тест, вставив микроэлектроды в проточный буфер, а затем нажав кнопки Vm Electrode Test и Ve Electrode Test для проверки сопротивления микроэлектродов. Vm должно быть < 40 мВ, а Ve должно быть < 40 мкА. Выключите поток 1x ND96 buffer (раздел 6.1) и насос для отходов после предварительного испытания.
  6. Поместите каждый ооцит в перфузионную камеру (Рисунок 2), заполненную 1x ND96 буфером (Раздел 6.1), и аккуратно расположите ооциты растительными полюсами вверх у стеклянной гусеницы. Медленно введите электроды в ооцит (рисунок 3B). Установите параметр Vm в 0, а затем параметр Ve в 0. Переведите кнопку зажима с ВЫКЛ на БЫСТРО. Отрегулируйте кнопку Gain в положение ~-80 мВ.
  7. Проверяем значение Ve, которое должно быть постоянным. Если нет, то есть утечка по крайней мере в одном из двух микроэлектродов. Если это произошло, замените неисправные компоненты новыми капиллярами.
  8. Записывайте токи целых клеток от введенных ооцитов с помощью зажима для ооцитов с потенциалом удержания ~−80 мВ (рис. 2).
  9. Сбор и анализ данных.
    1. Возобновите подачу 1x буфера ND96 (раздел 6.1) и включите насос для отходов.
    2. Подача раствора одоранта через систему перфузии: выключите 1x буфер ND96 (раздел 6.1) и подайте раствор одоранта в течение 10 секунд. Затем запишите пиковое значение. Чтобы получить реакцию операционной на тестируемый одорант, вычтите базовое значение из пикового значения.
    3. Остановите подачу раствора одоранта и переключитесь на 1x буфер ND96 (раздел 6.1). Промойте ооцит с помощью буфера до тех пор, пока текущий след не восстановится после предыдущей стимуляции одоранта. После этого ооцит готов к стимуляции другим раствором одоранта. Как правило, один ооцит может быть использован для обнаружения 20-30 химических стимуляций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При тестировании реакции, зависящей от концентрации, всегда следует сначала применять самую низкую концентрацию, прежде чем переходить к более высоким концентрациям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя метод записи одного сенсиллума (SSR), мы недавно точно определили запахи человека, которые, как считается, важны для поведения Ae. aegypti по поиску хозяина8. Тем не менее, молекулярный механизм, управляющий процессом восприятия запахов человека в периферической сенсорной системе Ae. aegypti, остается неизвестным. ОШ играют важную роль в обнаружении лигандов запаха у большинства насекомых 10,11,12.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ТЭПК является классической методикой, которая широко используется для изучения функции мембранных рецепторов. Несмотря на то, что уже опубликован подробныйпротокол43 , который имеет значительное сходство с процедурой, представленной здесь, предложенный здесь метод вносит некоторые важные изменения. Например, в данном случае кРНК как OR, так и Orco предварительно смешивают и аликвотируют в образцы небольшого объема сразу после синтеза и хранят при -80°С до использо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот проект был поддержан грантом от Алабамской сельскохозяйственной экспериментальной станции (AAES) Multistate/Hatch Grants ALA08-045, ALA015-1-10026 и ALA015-1-16009 для N.L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночный планшет для культивирования клетокCytoOneCC7682-7524Используется для культивирования ооцитов
Африканская когтистая лягушкаNascoLM00535Используется для сбора ооцитов Xenopus
Ag/AgCl проволочный электродWarner Instruments64-1282Используется для микроэлектродов
Clampex 10.3AxonN.A.Используется для записи сигналов
Clampfit 10.3Axon Instruments Inc.Н.А.Используется для анализа данных
Коллагеназа BSigma11088815001Используется для переваривания ооцитов
Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440AИспользуется для сбора данных
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini kitOmegaD6942-01Используется для плазмидного препарата
Этил-М-аминобензоат метансульфонатсоль Sigma886-86-2Используется для обезболивания лягушек
Стекло капиллярFHC30-30-1Используется для микроинъекции
Стеклянный капиллярWarner Instruments64-0801Используется для приготовления микроэлектродов
GyroMini Nutating MixerLabnetS0500Используется для переваривания ооцитов
Камеры роста насекомыхCaron Productsмодель 6025Используется для инкубации ооцитов
Leica MicroscopeLeicaS6 DИспользуется для резки комарных антенн
Источник светаSchottA20500Обеспечение источников света для наблюдения
Магнитная стойкаNarishigeGJ-1Используется для удержания электрода сравнения
МикроманипуляторLeica115378Используется для незначительного перемещения электрода
Съемник микротрубSutterмодель P-97Используется для вытягивания капилляров
Устройство для снятия фаски с микропипеткамиSutterмодель BV-10Используется для заточки капилляров
mMESSAGE mMACHINE T7 kitInvitrogenAM1344Используется для синтеза кРНК
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond3-000-204Используется для микроинъекций
Oligo d(T)20-primed SuperScript IV First-Strand Synthesis SystemInvitrogen18091050Используется для синтезирующая кДНК
Olympus МикроскопOlympusSZ61Используется для микроинъекций
One Shot TOP10 Химически компетентные клетки E. coliInvitrogenC404003Используется для трансформации
Усилитель зажима ооцитовWarner Instrumentsмодель OC-725CИспользуется для записи TEVC
QIAquick набор для экстракции геляQiagen28704Используется для геля
Виброизоляционный стол TMC63-500Используется для изоляции вибрации от оборудования
ТУРБО Набор без ДНКInvitrogenAM1907Используется для удаления ДНКазы и других ионов в РНК

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

XenopusOrco
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи