Методическая статья

Анализ лимфатической системы и сети крови при ожирении

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61814

⸱

19 ноября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, 2Université Côte d'Azur, 3Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 13, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065, 4Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 7, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Ожирение является растущей глобальной проблемой общественного здравоохранения. Ранее он был связан с лимфатической дисфункцией, что предполагает жизненно важные перекрестные помехи между жировой тканью и лимфатической системой. В данной работе мы предлагаем доступную методологию, позволяющую четко маркировать кровеносные и лимфатические сосуды в подкожной жировой клетчатке.

Аннотация

Лимфатические собирающие сосуды и лимфатические узлы неизбежно внедряются в жировую ткань. Физиологическое значение этого наблюдения до сих пор не выяснено. Однако ожирение характеризуется нарушением лимфатической функции и повышенной проницаемостью сосудов. И наоборот, лимфатическая дисфункция вызывает ожирение у мышей, что предполагает значительное взаимодействие между лимфатическими сосудами и жировой тканью. Таким образом, понимание факторов, приводящих к лимфатической дисфункции, может открыть новые терапевтические окна для предотвращения ожирения и связанных с ним сопутствующих заболеваний. Первым этапом этого процесса является точная и детальная визуализация лимфатической сети в здоровой и воспаленной жировой ткани. В этой статье мы опишем быстрый, недорогой и эффективный метод, который позволяет маркировать и анализировать лимфатические и кровеносные сосуды. Этот подход использует преимущества дренирующей кожу локализации плечевых лимфатических узлов в подкожной жировой клетчатке. Лимфатическая арборизация этой ткани может быть выявлена путем подкожного введения лектинов, конъюгированных с фторхромом. Кроме того, подход к мечению in vivo позволяет оценить плотность и функции лимфатических сосудов. В сочетании с окрашиванием кровеносных сосудов, адипоцитов и иммунных клеток, протокол позволяет картировать подкожную жировую ткань с высоким разрешением с помощью 3D-визуализации.

Введение

Система лимфатического кровообращения играет решающую роль в поддержании тканевого гомеостаза и индуцировании эффективных иммунных реакций. Лимфатические сосуды идут параллельно кровеносным сосудам и переносят интерстициальную жидкость, метаболиты и иммунные клетки к местному дренажному лимфатическому узлу (ЛН) и, наконец, к венозному кровообращению1. Дисфункциональный лимфодренаж наблюдался при инфекциях, воспалениях и метаболических заболеваниях 2,3,4,5. Лимфатическая сосудистая сеть состоит из сосудов небольшого размера, называемых лимфатическими капиллярами. Лимфатические капилляры образованы одним слоем тонких лимфатических эндотелиальных клеток (ЛЭК), характеризующихся открытыми соединениями («пуговичными» соединениями), облегчающими проникновение интерстициальной жидкости, метаболитов и иммунных клеток, в основном дендритных клеток (ДК) и Т-клеток, в просвет лимфатического капилляра5. Лимфатические капилляры сливаются в более крупные сосуды, называемые лимфатическими собирательными сосудами. Лимфатические коллекторы характеризуются слоем LEC, окруженным мышечным слоем, обеспечивающим автономный сократительный тонус и поддерживающим поток жидкости5. Кроме того, сосуды для сбора имеют клапаны, обеспечивающие однонаправленный поток лимфы.

ЛЭК коллекторов и капилляров экспрессируют определенный набор маркеров, отличающих их от эндотелиальных клеток крови (БЭК). Среди этих факторов Prox1 является транскрипционным фактором, управляющим генерацией ЛЭК, и высоко экспрессируется в ЛЭК, но отсутствует в БЭК. Критическое участие Prox1 в биологии LEC было проиллюстрировано получением и анализом мышей с дефицитом Prox16. Гетерозиготные мыши Prox1 имеют дефект развития лимфатической сосудистой сети, характеризующийся снижением плотности лимфатических сосудов и повышением проницаемости сосудов6. LEC высоко экспрессируют VEGFR3, подопланин и CCL215. Эти маркеры не обнаружены на БЭК и позволяют отдельно анализировать сеть лимфатических и кровеносных сосудов. Lyve1 избирательно экспрессируется лимфатическими капиллярами при отсутствии на собирательных сосудах5.

Были описаны три типа жировой ткани на основе их митохондриального содержимого и последующей окраски. Богатая митохондриями термогенная бурая жировая ткань играет ключевую роль при воздействии холода и расположена в межлопаточной области у мышей 7,8. Белые и бежевые адипоциты имеют меньшую плотность митохондрий и в основном участвуют в запасании энергии в виде липидных капель. Белые и бежевые адипоциты расположены в висцеральных и подкожных депо9.

Клинические наблюдения установили связь между ожирением и лимфатической дисфункцией10. Ожирение вызывает морфологические изменения жировой ткани, лимфатической сосудистой сети и приводит к нарушению транспорта лимфы11. Данные, полученные в доклинических моделях, показали, что диета с высоким содержанием жиров (HFD) вызывает лимфатическое ремоделирование, а мыши с ожирением имеют меньшие лимфатические узлы и меньшее количество лимфатическихсосудов. Тем не менее, точные молекулярные механизмы, управляющие этим фенотипом, еще предстоит выяснить. Участие ЛЭК при ожирении также подтверждается наблюдениями на генетических моделях с нарушениями развития лимфатических сосудов. Как обсуждалось ранее, у гетерозиготных мышей Prox1 (Prox1+/-) наблюдается плохо функционирующая лимфатическая система, и по совпадению у них развивается чрезмерное накопление висцеральной жировой ткани по сравнению с животными с достаточным количеством Prox16. Интересно, что этот фенотип жировой ткани спасается восстановлением лимфатической функции13. В совокупности эти результаты выявили прочные взаимосвязи между лимфатическими сосудами и жировой тканью, которые требуют дальнейшего изучения.

В контексте воспаления, являющегося отличительным признаком ожирения, измененная экспрессия маркеров LEC и BEC ставит под угрозу анализ этих клеток с помощью классического окрашивания антителами 14,15. Были разработаны генетические модели для специфической маркировки LEC и BECs, которые позволяют смягчить эту проблему 16,17,18,19. Тем не менее, использование генетических репортерных линий требует нескольких этапов селекции и значительно увеличивает продолжительность и стоимость проекта. Таким образом, мы предлагаем использовать инъекции фторхром-конъюгированных лектинов для исследования кровеносной и лимфатической систем кровообращения в подкожной жировой клетчатке, что является простым и относительно недорогим подходом. Лектины, конъюгированные с различными флуорохромами, коммерчески доступны и могут вводиться внутривенно для мечения кровеносных сосудов или подкожно для маркировки дренирующих кожу лимфатических сосудов, встроенных в подкожную жировую ткань. Этот подход основан на использовании отдельных конъюгатов флуорохром-лектина для каждой инъекции и позволяет четко маркировать каждую сосудистую сеть. Этот метод также совместим с использованием генетических моделей для мечения лимфатической или кровеносной сосудистой сети. Важно отметить, что он предоставляет многократные показания для анализа общего состояния здоровья подкожной жировой ткани и крови и лимфатических сосудов, перфузирующих ее. Эта процедура может быть легко применена для анализа лимфатической и кровеносной сети при острых и хронических кожных заболеваниях, включая псориаз и инфекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с местными этическими комитетами.

ПРИМЕЧАНИЕ: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) и Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, Ai9, Jax #007914) были получены из лаборатории Джексона и скрещены для получения индуцируемой лимфатической репортерной линии мыши Prox1-cre-ERT2::tdTomato. Мыши скрещивались с фоном C57BL/6 в течение 10 поколений. Шестинедельные самцы мышей Prox1-cre-ERT2::tdTomato получали тамоксифен в течение 3 недель. Тамоксифен диета от Envigo Teklad (диетический No ТД.130857; 500 мг/кг). Эксперименты проводились на мышах в возрасте 12-14 недель. Этот протокол применим к мышам любого возраста, пола и штамма.

1. Подготовка материала

  1. Стерилизуйте ножницы, щипцы и препарирующие штифты с использованием 70% этанола.
  2. Подготовьте два шприца объемом 1 мл с иглами от 25 до 27 калибра. Для подкожного введения мы рекомендуем с помощью микрошприца ввести 10 мкл в верхнюю подушечку стопы.
  3. В пластиковой пробирке объемом 1,5 мл приготовьте 200 мкл лектина, конъюгированного с DyLight 488, разведенного в стерильном PBS в конечной концентрации 100 мкг/мл.
  4. В другом пластике в 1,5 мл пробирки готовят 100 мкл 649-конъюгированного лектина DyLight, разведенного в стерильном PBS в конечной концентрации 100 мкг/мл.
  5. Приготовьте 6-луночную тарелку, содержащую PBS, и держите ее на льду.
  6. Приготовьте раствор из 4% параформальдегида и 30% сахарозы.

2. Мечение подкожной жировой клетчатки, кровеносных и лимфатических сосудов.

  1. Обезболивайте мышь путем ингаляции 5% изофлурана. Оцените глубину анестезии, сильно ущипнув животное за лапу, чтобы убедиться, что животное не пострадает во время процедуры. Анестезия должна поддерживаться до окончания этапов инъекции лектина или до эвтаназии.
  2. Введите 100 мкл конъюгированного лектина DyLight 488 внутривенно в хвостовую вену для маркировки кровеносной сосудистой системы. Подождите 15 минут, прежде чем приступать к забору тканей.
  3. С помощью другого шприца введите 10 мкл конъюгированного лектина DyLight 649 подкожно в верхнюю подушечку ноги животного, чтобы пометить дренирующие лимфатические сосуды. Подождите 15 минут, прежде чем приступать к забору тканей.
  4. Усыпьте мышь при вывихе шейки матки или контакте сCO2 через 15 минут после инъекции.

3. Забор подкожной жировой клетчатки

  1. Положите мышь на спину на доску для вскрытия.
  2. Простерилизуйте шерсть мыши, используя 70% этанол.
  3. Подтяните кожу бока с помощью щипцов и сделайте поперечный разрез, чтобы обнажить плечевой жировой пакет.
  4. Аккуратно потяните за кожу, чтобы отделить ее от депо плечевой жировой ткани, тем самым обнажив всю подкожную плечевую жировую ткань, содержащую лимфатический узел и лимфатический сосуд-коллектор.
  5. С помощью щипцов и ножниц аккуратно удалите подкожные жировые отложения и перенесите их в посуду, содержащую холодный ПБС. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем удалять жировые депо как единое целое.
  6. С этого момента защищайте ткань от света.

4. Фиксация тканей

  1. Погрузите собранную ткань в раствор, содержащий 4% параформальдегида и 30% сахарозы.
  2. Инкубируйте ткань в этом растворе по крайней мере в течение ночи перед подготовкой к визуализации.

5. Окрашивание и визуализация

  1. Для достижения оптимальных результатов выполните очистку тканей и 3D-конфокальную съемку, как описано Гиллероном и коллегами20. Для анализа крупных тканей рекомендуется использовать световой листовой микроскоп. Дополнительное окрашивание может быть выполнено в процессе очистки.
  2. Для достижения наилучшего картирования тканей используйте следующие антитела:
    Для адипоцитов: Перилипин
    Для макрофагов: окрашивание CD68 и CD11b.
    Для дендритных клеток: MHC II и CD11b.
    Для В-клеток: окрашивание B220 (CD45R).
    Для Т-клеток: окрашивание CD3.
    Примечание: Этот метод совместим с использованием генетических моделей для мечения иммунных клеток.
  3. Для анализа лимфатического коллекторного сосуда методом прижизненной 2-фотонной микроскопии лектин вводят подкожно в нижнюю подушечку стопы и визуализируют подколенный лимфатический собирающий сосуд.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для проведения топологического анализа кровеносных и лимфатических сетей плечевой жировой ткани мы подкожно вводили лектин, конъюгированный с Alexa Fluor 649, и внутривенно вводили конъюгированный лектин Alexa Fluor 488. Плечевая жировая ткань была тщательно иссечена, зафиксирована, подвергнута протоколу очистки и проанализирована путем окрашивания по всей длине. Схематическое изображение процедуры приведено на рисунке 1А. Кровеносные сосуды обозначены зеленым цветом, а лимфатические – красн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Такой подход обеспечивает эффективную и надежную маркировку крови и лимфатических сосудов подкожной жировой клетчатки. Отдельный анализ эндотелиальных сетей крови и лимфатических систем может выявить патологические механизмы, влияющие на одну или обе системы кровообращения при ожирении или других патологических состояниях. Этот протокол направлен на анализ архитектуры сосудистых систем, их взаимодействия со стромальными и иммунными клетками, а также их функциональности во время здоровья ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не могут заявлять о раскрытии информации и конфликте интересов.

Благодарности

SI поддерживается Национальным институтом здоровья и медицинских исследований (INSERM) и Национальным агентством исследований (ANR-17-CE14-0017-01 и ANR-19-ECVD-0005-01). AG поддерживается правительством Франции в рамках проекта UCAJedi Investments in the Future, управляемого Национальным исследовательским агентством (ANR) под номером ANR-15-IDEX-01. РСК поддерживается FA-2020-01-IBD-1 от Лоуренса С. Пакулы, MD IBD Education & Innovation Fund».

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лектин DyLight 649Vector LabsDL-1178-1Описан в протоколе
Lectin DyLight 488Vector LabsDL-1174Описан в протоколе
ПараформальдегидVWR Chemicals9713.1000
СахарозаEuromedexCAS Номер 57-50-1
АнтиподопланинAngioBio11-033Разведение: 1/50
Lectin DyLight 594Vector LabsDL-1177Описан в протоколе
Anti-MHCII (Клон M5/114.15.2)Biolegend107618Разведение: 1/100
Anti-CD11b (Клон M1/70)Biolegend101218Разбавление: 1/100
Anti-CD68 (клон FA.11)Biolegend137004Разведение: 1/100
Anti-B220 (клон RA3-6B2)Biolegend103225Разведение: 1/100
анти-перилипин (клон PERI 112.17)Разведение про 651156 гена: 1/50
анти-CD3 (клон 17A2)Biolegend100210Разведение: 1/100

Ссылки

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. Journal of Experimental Medicine. 204 (10), 2349-2362 (2007).
  2. Fonseca, D. M., et al. Microbiota-Dependent Sequelae of Acute Infection Compromise Tissue-Specific Immunity. Cell. 163 (2), 354-366 (2015).
  3. Thomas, S. N., et al. Impaired humoral immunity and tolerance in K14-VEGFR-3-Ig mice that lack dermal lymphatic drainage. The Journal of Immunology. 189 (5), 2181-2190 (2012).
  4. Kuan, E. L., et al. Collecting lymphatic vessel permeability facilitates adipose tissue inflammation and distribution of antigen to lymph node-homing adipose tissue dendritic cells. The Journal of Immunology. 194 (11), 5200-5210 (2015).
  5. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2017).
  6. Harvey, N. L., et al. Lymphatic vascular defects promoted by Prox1 haploinsufficiency cause adult-onset obesity. Nature Genetics. 37 (10), 1072-1081 (2005).
  7. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  8. Wu, J., Cohen, P., Spiegelman, B. M. Adaptive thermogenesis in adipocytes: is beige the new brown. Genes and Development. 27 (3), 234-250 (2013).
  9. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
  10. Kataru, R. P., et al. Regulation of Lymphatic Function in Obesity. Frontiers in Physiology. 11, 459(2020).
  11. Escobedo, N., Oliver, G. The Lymphatic Vasculature: Its Role in Adipose Metabolism and Obesity. Cell Metabolism. 26 (4), 598-609 (2017).
  12. Weitman, E. S., et al. Obesity impairs lymphatic fluid transport and dendritic cell migration to lymph nodes. PLoS One. 8 (8), 70703(2013).
  13. Escobedo, N., et al. Restoration of lymphatic function rescues obesity in Prox1-haploinsufficient mice. JCI Insight. 1 (2), (2016).
  14. Commerford, C. D., et al. Mechanisms of Tumor-Induced Lymphovascular Niche Formation in Draining Lymph Nodes. Cell Reports. 25 (13), 3554-3563 (2018).
  15. Gregory, J. L., et al. Infection Programs Sustained Lymphoid Stromal Cell Responses and Shapes Lymph Node Remodeling upon Secondary Challenge. Cell Reports. 18 (2), 406-418 (2017).
  16. Ivanov, S., et al. CCR7 and IRF4-dependent dendritic cells regulate lymphatic collecting vessel permeability. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1581-1591 (2016).
  17. Zhong, W., et al. Prox1-GFP/Flt1-DsRed transgenic mice: an animal model for simultaneous live imaging of angiogenesis and lymphangiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 581-598 (2017).
  18. Choi, I., et al. Visualization of lymphatic vessels by Prox1-promoter directed GFP reporter in a bacterial artificial chromosome-based transgenic mouse. Blood. 117 (1), 362-365 (2011).
  19. Pham, T. H., et al. Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning. Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 17-27 (2010).
  20. Gilleron, J., et al. Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  21. Ivanov, S., Merlin, J., Lee, M. K. S., Murphy, A. J., Guinamard, R. R. Biology and function of adipose tissue macrophages, dendritic cells and B cells. Atherosclerosis. 271, 102-110 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи