Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс

Summary

Здесь мы представляем гидрофобный метод очистки тканей, который позволяет рассматривать молекулы-мишени как часть неповрежденных структур мозга. Этот метод в настоящее время подтвержден для борьбы с F344/N и трансгенных крыс с ВИЧ-1 обоих полов.

Abstract

Гидрофобные методы очистки тканей — это легко регулируемые, быстрые и недорогие процедуры, которые позволяют изучать интересующую молекулу в неизмененных образцах тканей. Традиционные процедуры иммуномаркировки требуют разрезания образца на тонкие срезы, что ограничивает возможность маркировки и изучения неповрежденных структур. Однако, если ткань мозга может оставаться неповрежденной во время обработки, структуры и схемы могут оставаться нетронутыми для анализа. Ранее установленные методы очистки занимают значительное время, чтобы полностью очистить ткани, а агрессивные химические вещества часто могут повредить чувствительные антитела. Метод iDISCO быстро и полностью очищает ткани, совместим со многими антителами и не требует специального лабораторного оборудования. Этот метод был первоначально одобрен для использования в тканях мышей, но текущий протокол адаптирует этот метод к изображению полушарий контроля и трансгенного мозга крыс. В дополнение к этому, настоящий протокол также вносит несколько корректировок в ранее существовавающий протокол, чтобы обеспечить более четкие изображения с меньшим фоновым окрашиванием. Антитела к Iba-1 и тирозингидрилазе были подтверждены у трансгенных крыс с ВИЧ-1 и у контрольных крыс F344/N с использованием настоящего гидрофобного метода очистки тканей. Мозг представляет собой переплетеную сеть, где структуры работают вместе чаще, чем по отдельности друг от друга. Анализ мозга как целой системы в отличие от комбинации отдельных частей является наибольшим преимуществом этого метода очистки всего мозга.

Introduction

Несколько методов очистки тканей были проверены для использования в головном мозге: гидрогелевые, гидрофильные и гидрофобные. Эти методы направлены на то, чтобы сделать ткань прозрачной путем делипидации, обесцвечивания и декальцирования путем введения растворителей. Как только показатель преломления образца ткани соответствует индексу преломления выбранной среды визуализации, может быть получено четкое изображение образца. Методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY, защищают биомолекулы в ткани, связывая их с гидрогелями на основе акрилов, что предотвращает структурное повреждение и потерю белков^1. Тем не менее, методы гидрогеля используют агрессивные химические вещества, которые могут повредить более хрупкие ткани, и более плотные образцы тканей могут быть несовместимы с протоколом гидрогеля. Некоторые методы гидрогеля могут потребовать дорогостоящего оборудования или привести к расширению тканей. Гидрофильные методы, такие как CUBIC, сохраняют 3D-структуру путем образования водородных связей внутри^{ткани 2.} Расширение тканей также может происходить в определенном гидрофильном протоколе. Очищающая способность гидрофильных методов часто не соответствует способности, которой обладают гидрофобные методы, что важно для более плотных и толстых тканей^3.

Гидрофобные методы, как правило, быстрые, не требуют специального оборудования и производят образец, который прост в обращении и хранении. iDISCO - это гидрофобный метод, который устраняет усадку, которая может возникнуть в другом гидрофобном протоколе. Первоначально метод очистки тканей iDISCO был описан Renier et al.⁴ для эмбрионов и плотных взрослых органов мышей. Этот метод удаляет воду из ткани на начальной ступени обезвоживания, тем самым уменьшая рассеяние света. Ткань проницаема во время предварительной обработки, чтобы обеспечить глубокое проникновение антител. Красители Alexa Fluor в дальне-красном спектре используются для иммуномаркировки, чтобы избежать автофлуоресценции ткани на более низких длинах волн^5. Ткани, прошедшие гидрофобные протоколы очистки, могут легко обрабатываться и могут быть изображены несколько раз благодаря долговечности красителей Alexa Fluor. При правильном хранении ткани могут предоставлять изображения в течение нескольких месяцев до года после первоначальной обработки.

В настоящем протоколе антитело к тирозингидроксилазе (TH), антитело Iba1 и субъединица токсина холеры B (CTB) использовались как на мужском, так и на женском контроле и трансгенном (Tg) мозге крыс с ВИЧ-1. Крыса ВИЧ-1 Tg обладает семью из девяти генов, составляющих вирусный геном ВИЧ-1, что приводит к неинфекционной модели длительного воздействия белка ВИЧ-1^6,7,8. Дофаминергические изменения ранее были продемонстрированы у крысы с ВИЧ-1 Tg, а сам ПОИВ-ВИЧ-1 является воспалительным заболеванием, поэтому выбор антител был актуален для экспериментальной конструкции^9,10,11,12. CTB - это индикатор, который прикрепляется к нейронам через связывание ганглиозидов и может быть использован для отслеживания афферентных проекций в мозге. CTB ранее использовался для изучения проекций от прилежания ядра к области нигры субстанции, двух областей мозга, сильно связанных с дофаминергическими путями^13,14,15.

В этом протоколе TH будет служить маркером для выработки дофамина, а Iba1 будет маркивать активированную микроглию. Используемое антитело TH избирательно маркирует одну полосу при приблизительно 62 кДа, что соответствует тирозинде гидроксилазе. Антитело Iba1 соответствует карбокси-терминальной последовательности Iba1. Оба антитела были выращенные у кролика и были поликлональными. CTB будет использоваться для ретроградного отслеживания нейронов от области прилежащих ядер до области substantia nigra. Текущий протокол также предлагает руководство по корректировке оригинального протокола iDISCO двумя различными способами: 1) общее уменьшение фонового окрашивания путем изменения реагентов сыворотки на этапах блокировки и 2) масштабирование времени инкубации, чтобы быть пригодным для более крупных образцов тканей. В целом, настоящий протокол предоставляет постоянные доказательства того, что методы гидрофобной очистки возможны в тканях мозга крысы, не имеют заметных вредных взаимодействий с вирусными белками ВИЧ-1 и совместимы с антителами TH, антителами Iba1 и CTB.

Protocol

Все протоколы для животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Южной Каролины.

1. Приготовление раствора на складе

1. Раствор 1 (1 л): К 900 мл деионизированного_H2O добавляют 100 мл 10x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и 2 мл Triton X-100.
2. Раствор 2 (1 л): К 900 мл деионизированного_H2O добавляют 100 мл 10x PBS, 2 мл Tween-20 и 1 мл 10 мг/мл раствора Гепарина.
3. Раствор 3 (500 мл): К 400 мл раствора 1 добавляют 11,5 г г глицина и 100 мл диметилсульфоксида (ДМСО).
4. Раствор 4 (50 мл): К 42 мл раствора 1 добавляют 3 мл соответствующей сыворотки и 5 мл ДМСО.
5. Первичный раствор антител (50 мл): К 46 мл раствора 2 добавляют 2,5 мл ДМСО и 1,5 мл соответствующей сыворотки.
6. Вторичный раствор антител (50 мл): К 48,5 мл раствора 2 добавляют 1,5 мл соответствующей сыворотки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для раствора 4, первичного раствора, и вторичного раствора используют сыворотку, которая соответствует вторичным антителам (например, козьему, лошадиной, бытовой).

2. Пробоподготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги с 2.1 по 2.7 в вытяжном капюшоне из-за ограничения воздействия ПФА.

1. Глубоко обезболивают молодняк (3-6 недель) крыс с помощью севофлурана; перейти к 2.2, когда крыса не реагирует и не реагирует на защемление нога и хвоста.
2. Уложите крысу в положение лежа на спине и сделайте разрез через брюшную стенку с помощью ножниц радужной оболочки глаза.
3. Прорежьте дно грудной клетки до ключицы с обеих сторон грудной клетки ножницами Майо.
4. Прикрепите грудину и ребра подальше от сердца и легких гемостатом.
5. Проткните левый желудочек иглой 23 Г, прикрепленной к перфузионному насосу, и разрезайте правое предсердие ножницами Iris.
6. Выполните транскардиальную перфузию примерно 75 мл 100 мМ (1x) PBS.
7. Продолжают транскардиальную перфузию примерно 100 мл 4% параформальдегида (PFA), буферизованным в 1x PBS.
8. Удалите мозг из черепа с помощью щипцов.
9. Поместите мозг в сагиттальное положение и нарежьте на 4 равных участка (примерно 3 мм в ширину) с помощью лезвия бритвы и матрицы мозга крысы.
10. Зафиксируйте каждую секцию в 4% PFA в 1x PBS в герметичной пластиковой трубке объемом 5 мл на ночь при 4 °C на шейкере.
11. Продолжают фиксировать в 4% PFA в 1x PBS при комнатной температуре (RT) на шейкере в течение 1 ч.
12. Вымойте каждую секцию с 1x PBS на RT в течение 30 мин, 3 раза.

3. Обезвоживание и депигментация

1. Инкубировать образец в 20% метаноле/80% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
2. Инкубировать образец в 40% метаноле/60% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
3. Инкубировать образец в 60% метаноле/40% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
4. Инкубировать образец в 80% метаноле/20% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
5. Инкубировать образец в 100% метаноле в течение 1 ч при РТ. Повторить с более чем 100% метанолом, инкубируя в течение 1 ч при РТ.
6. Охладите образец в 100% метаноле при 4°С в течение приблизительно 10 мин.
7. Приготовьте 66% раствор дихлорметана (DCM)/33% метанола.
8. Инкубировать образец в течение ночи в растворе DCM/метанола на RT, встряхивая.
9. Промыть метанолом на RT в течение 30 мин, 2 раза.
10. Охладите образец в 100% метаноле при 4°С в течение приблизительно 10 мин.
11. Отбеливатель в охлажденный, свежеприготовленный 5% перекись водорода в метаноле на ночь при 4°С.
12. Инкубировать образец в 80% метаноле/20% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
13. Инкубировать образец в 60% метаноле/40% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
14. Инкубировать образец в 40% метаноле/60% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
15. Инкубировать образец в 20% метаноле/80% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
16. Инкубировать образец в 1x PBS в течение 1 ч на RT.
17. Промыть раствором 1 в течение 1 ч при РТ, 2 раза.

4. Маркировка субъединицы B холеротоксина

1. Вставьте кончик иглы из шприца 1 мл в участок прилежания ядра.
2. Медленно вводят 2,5 мкл 1% биотина-CTB в течение 20 с.
3. Оставьте наконечник иглы на месте в течение 1 мин и медленно снимайте в течение 10 с, чтобы предотвратить утечку.

5. Применение антител

1. Инкубировать образец в растворе 3 в течение 2 дней при 37 °С на водяной бане.
2. Инкубировать образец в растворе 4 в течение 2 дней при 37 °C на водяной бане.
3. Инкубировать с первичным антителом в течение 7 дней при 37 °С на водяной бане.
4. Промыть раствором 2 по 5 раз, инкубируя 1 ч на стирку. Хранить в растворе 2 в RT на ночь.
5. Инкубировать с вторичными антителами в течение 7 дней при 37 °C на водяной бане.
6. промыть в растворе 2 по 5 раз, инкубируя 1 ч на промывку; хранить в Растворе 2 на RT на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы, начиная с 5.6, включая конечное хранение, должны происходить при слабом освещении. Пробоотборники могут быть экранированы алюминиевой фольгой. Концентрации, используемые для антител в этом протоколе, были: TH в 1:100, Iba1 в 1:200 и вторичное антитело в 1:100. Добавьте дополнительный раствор 2 к шагам 5.1-5.6, чтобы обеспечить полное заполнение трубок.

6. Очистка тканей

1. Инкубировать образец в 20% метаноле/80% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
2. Инкубировать образец в 40% метаноле/60% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
3. Инкубировать образец в 60% метаноле/40% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
4. Инкубировать образец в 80% метаноле/20% деионизированном водном растворе в течение 1 ч при РТ.
5. Инкубировать образец в 100% метаноле в течение 1 ч на РТ.
6. Инкубировать в свежем 100% метаноле в течение ночи на РТ.
7. Инкубировать в 66% DCM/33% метаноле в течение 3 ч, при встряхивании, при комнатной температуре.
8. Инкубировать в дибензиловом эфире (ДБЭ) без встряхивания. Оставьте образец в DBE до очистки и храните в DBE до тех пор, пока не будете визуализии.

7. Монтаж

1. Получите 3D-печатную камеру из кристаллической смолы Visijet M3 (шаблоны доступны на веб-сайте idisco.info).
2. Закрепите камеру на слайде микроскопа с помощью эпоксидной смолы.
3. Поместите образец в квадратное пространство в середине камеры.
4. Заполните камеру полностью DBE.
5. Поместите крышку толщиной 0,17 мм на камеру и применяйте давление до тех пор, пока крышка не полностью соприкосется со стенками камеры.
6. Запечатайте края крышки к камере с помощью эпоксидной смолы.
7. Поверните камеру, чтобы пузырьки воздуха вытегали из заполнения.
8. Заполните камеру дополнительным DBE.
9. Запечатайте заливное отверстие эпоксидной смолой и дайте отверждения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избыток DBE будет выплескиваться во время монтажа.

8. Визуализация

1. Используйте систему конфокального микроскопа для выполнения z-сканирования с 4-кратным увеличением (см. прилагаемое 3D-видео).
2. Достигайте флуоресцентного возбуждения образца с помощью лазерного набора для излучения на длине волны, аналогичной длине волны, заданной вторичным антителом. Возбуждение TH было достигнуто с использованием лазерного набора HeNe для испускания на 632 нм.
3. Установите детектор на длину волны, близкую к лазерному излучению. Для настоящего протокола детектор для TH был установлен на 650 нм.
4. Повышайте коэффициент усиления детектора до тех пор, пока не появится видимый сигнал. Коэффициент усиления 650LP для изображений был установлен на 7,50 B.
5. Используя опцию «Сканирование» в программном обеспечении для конфокальной визуализации, перемещайте стадию микроскопа до тех пор, пока образец не будет сфокусирован.
6. Перемещайтесь по ткани на всех равнинах и получайте либо одиночные изображения, либо изображения z-стека с помощью программного обеспечения для конфокальной визуализации.
7. После завершения визуализации извлеките образец из камеры. Поместите его обратно в трубку, полностью заполненную DBE, и храните в RT в темном месте, предпочтительно покрытом алюминиевой фольгой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть повторно смонтированы и отображены до тех пор, пока сигнал флуоресценции все еще силен.

Results

Полная очистка больших участков ткани мозга крыс f344/N и ВИЧ-1 была достигнута с использованием этого модифицированного протокола очистки гидрофобной ткани. На рисунке 1 показано типичное конфокальное изображение для TH в области черновой субстанции. Рисунок 1А представляет собой плотное, положительное окрашивание. Плотные области, такие как эти, могут быть проанализированы путем фокусировки через плоскость «Z», чтобы подтвердить положительное окрашивание и пра...

Discussion

Очистка тканей предлагает решение ограничений традиционного протокола IHC. Прозрачный образец минимизирует рассеяние и поглощение света, что обеспечивает оптический доступ на клеточном уровне к неповрежденным тканям^18,19. Методы очистки тканей превращают ткань в прозрачную посредством делипидации, обесцвечивания и декальценции с введением растворителей. Как только показатель преломления образца ткани соответствует индексу преломления выбранной среды визуализации,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Субъединица токсина холеры B (рекомбинантная), Alexa Fluor 488	Invitrogen	C34775
DBE	Sigma-Aldrich	108014-1KG
DCM	Sigma-Aldrich	270997-100mL
DMSO	Sigma-Aldrich	472301-1L
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
Goat Anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647	Invitrogen	A32733
Сыворотка для коз	Sigma Life Science	G9023-10mL
Гепарин	Acros Organics	41121-0010
Первичное антитело Iba1	FUJIFILM Wako	019-19741
Kwik-sil эпоксидная смола	VWR	70730-062
Метанол	Sigma-Aldrich	34860-1l-R
PBS	Биореагенты Фишера	BP2944-100
Перфузионный аппарат	VWR	70730-062	мини насос переменного
расхода PFA	Sigma-Aldrich	158127-3KG
TH первичное антитело	Millipore Sigma	AB152
TritonX-100	Биореагенты	Фишера BP151-500
Tween-20	Биореагенты	ФишераБП337-500