Методическая статья

Очистка Тубулина с контролируемыми посттрансляционными модификациями и изотипами из ограниченных источников по циклам полимеризации-деполимеризации

DOI:

10.3791/61826

⸱

5 ноября 2020 г.

 ,  ,  , 
1PSL Research University, CNRS UMR3348, Institut Curie, 2Université Paris-Saclay, CNRS UMR3348, Université Paris Sud

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает очистку тубулина из малых/средних источников, таких как культурные клетки или мозг одной мыши, используя циклы полимеризации и деполимеризации. Очищенный тубулин обогащается в конкретных изотипах или имеет специфические посттрансляционные модификации и может быть использован в анализах восстановления in vitro для изучения динамики и взаимодействий микротрубочек.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из важных аспектов исследований цитоскелета микротрубочек является исследование поведения микротрубочек в экспериментах по восстановлению в пробирке. Они позволяют анализ внутренних свойств микротрубочек, таких как динамика, и их взаимодействия с микротрубочками связанных белков (MAPs). "Трубулин код" является новой концепцией, которая указывает на различные изотипы тубулина и различные посттрансляционные модификации (ПТМ) в качестве регуляторов свойств и функций микротрубочек. Для изучения молекулярных механизмов кода тубулина крайне важно проводить эксперименты по восстановлению в пробирке с использованием очищенного тубулина с конкретными изотипами и ПТМ.

На сегодняшний день, это было технически сложной задачей, как мозг тубулин, который широко используется в экспериментах in vitro, гавани многих PTMs и имеет определенный состав изотипа. Поэтому мы разработали этот протокол для очистки тубулина из разных источников и с различными изотипными композициями и контролируемыми ПТМ, используя классический подход циклов полимеризации и деполимеризации. По сравнению с существующими методами, основанными на сродстве очистки, этот подход дает чистый, полимеризации компетентных тубулин, как тубулин устойчивы к полимеризации или деполимеризации отбрасывается в ходе последовательных шагов очистки.

Мы описываем очищение тубулина от клеточных линий, выращенных либо в суспензии, либо как культуры адептов, так и из мозгов одной мыши. Метод сначала описывает генерацию массы клеток как в условиях подвески, так и в настройках адепта, этап лиза, за которым следуют последовательные этапы очистки тубулина циклами полимеризации-деполимеризации. Наш метод дает тубулин, который может быть использован в экспериментах, касаясь влияния кода тубулина на внутренние свойства микротрубочек и микротрубочек взаимодействия с сопутствующими белками.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микротрубоконы играют важную роль во многих клеточных процессах. Они придают клеткам свою форму, строят мейотические и митотические шпиндели для хромосомной сегрегации и служат следами внутриклеточного транспорта. Для выполнения этих разнообразных функций микротрубоконы организуются по-разному. Один из интригующих вопросов в этой области заключается в том, чтобы понять молекулярные механизмы, которые позволяют структурно и эволюционно сохраненных микротрубочек адаптироваться к этому множеству организаций и функций. Одним из потенциальных механизмов является диверсификация микротрубочек, которая определяется понятием, известным как «трубулин код»1,2,3. Код тубулина включает в себя два основных компонента: дифференциальное включение α- и β-тубулиных генных продуктов (трубулиновых изотипов) в микротрубобулы и трубулиновые посттрансляционные модификации (ПТМ).

С 1970-х годов эксперименты по восстановлению в пробирке, в сочетании с развивающимися методами световой микроскопии, проложили путь для важных открытий о свойствах микротрубочек:динамическая нестабильность 4 и беговая дорожка 5, иих другие механизмы и функции 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Почти все эксперименты in vitro, выполненные до сих пор, были основаны на тубулине, очищенном от ткани мозга с использованием повторных циклов полимеризациии деполимеризации 16,17. Хотя очищение от ткани мозга дает преимущество получения высококачественного тубулина в больших количествах (обычно граммовых количествах), одним из важных недостатков является неоднородность, так как тубулин, очищенный из тканей мозга, представляет собой смесь различных тобулиных изотипов и обогащен многими тубулиными ПТМ. Такая неоднородность не позволяет разграничить роль конкретного тубулина PTM или изотипа в управлении свойствами и функциями микротрубочек. Таким образом, для решения молекулярных механизмов трубулинового кода необходимо производить сборочно-компетентный тубулин ПТМ и однородный изотипный состав.

Недавно был разработан подход к очищению тубулина с помощью хроматографии с использованием микротрубочек-связывающих TOG (опухолево-переэкспрессивного гена)дрожжейStu2p. В этом методе тубулин в сырых лизах клеток или тканей проходит через столбец, где он связывается с матрично-иммобилизованным доменом TOG, что позволяет анализ всего пула тубулина данного, даже очень маленького, образца. В последние годы также был описан долгожданный подход к очистке рекомбинантного тубулина. Он основан на бакуловирусной системе, в которой в клетках насекомых19α-β двухтубулиновых генов. Тем не менее, этот метод является очень громоздким и трудоемким и поэтому в основном используется для изучениявоздействия мутаций тубулина 20 и трубулинизотипов 21,22,23 in vitro.

В текущем протоколе мы описываем метод, который использует хорошо затвердевшей и широко используемый подход полимеризации-деполимеризации как план для генерации тубулина с различными уровнями модификации либо из клеточных линий, либо изткани мозга мыши 24. В этой процедуре тубулин циклически циклически проносят между растворимым (тубулиновый димер при 4 градусов по Цельсию) и полимеризованной формой (микротрубочка при 30 градусов по Цельсию при наличии гуанозина 5'-трифосфата (ГТП). Каждая форма отделяется последовательными шагами центрифугации: тубулинский димеры останутся в супернатанте после холодного (4 градусов по Цельсию) спина, в то время как микротрубоколы будут гранулироваться при 30 градусах Цельсия. Кроме того, один шаг полимеризации осуществляется при высокой концентрациипиперазина-N,N-бис(2-этанесульфоновая кислота) (PIPES), что позволяет удалить микротрубочные белки из микротрубочек и, таким образом, из окончательно очищенного тубулина. Тубулин очищены от HeLa S3 клетки, выращенные в качестве подвески или адепт культур практически не имеет каких-либо тубулин PTM и был использован в последние экспериментыэкстракорпорального восстановления 25,26,27,28. Мы также адаптировали метод очистки тубулина от мозгов одной мыши, который может быть использован для большого количества моделей мышей с изменениями в изотипах тубулина и ПТМ.

В протоколе мы сначала описываем генерацию исходных материалов (клеточной массы или мозговой ткани), его лиза(рисунок 1A),а затем последовательные шаги полимеризации тубулина и деполимеризации для очистки тубулина(рисунок 1B). Далее мы описываем процесс оценки чистоты(рисунок 2A,B)и количества(рисунок 3A,B) очищенного тубулина. Метод может быть адаптирован для производства тубулина, обогащенного выбранным PTM путем переэкспрессирования изменяемого фермента в клетках до очистки тубулина(рисунок 4B). Кроме того, в процессе очистки в тубулин можно добавить ферменты, изменяющие тубулин. Наконец, мы можем очистить тубулин без конкретных изотипов или ПТМ из мозга мышей, не хватает соответствующих тубулин-изменяющих ферментов (рисунок 4B)29.

Метод, который мы описываем здесь, имеет два основных преимущества: i) он позволяет за относительно короткое время произвести достаточно большое количество тубулина, и ii) он генерирует высококачественный, чистый тубулин, либо с специфическим составом изотипа тубулина, либо с ПТМ. В связанном видео этой рукописи мы подчеркиваем некоторые из важнейших шагов, связанных с этой процедурой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Уход за животными и их использование для этого исследования были проведены в соответствии с рекомендациями Европейского сообщества (2010/63/UE). Экспериментальные процедуры были специально утверждены комитетом по этике Института Кюри CEEA-IC #118 (разрешение No 04395.03, данное Национальным органом) в соответствии с международными руководящими принципами.

1. Подготовка реагентов для очистки Тубулина

ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы, используемые для очистки тубулина должны содержать соли калия и не соли натрия30.

  1. Подготовка 1 л полной среды: модифицированный Eagle среднего Dulbecco (DMEM), с 10% плода бычьей сыворотки (FBS, 100 мл), 200 мМ L-глутамин (10 мл 2 М запасов), и 1x пенициллин-стрептомицин (10 мл 100x запасов). Хранить при 4 градусов по Цельсию.
  2. Приготовьте 10 М гидроксида калия (KOH) путем растворения 140 г KOH в воде, отрегулируйте конечный объем до 250 мл и храните при комнатной температуре.
  3. Приготовьте тетраакетную кислоту 0,5 М этилендиамина (ЭДТА), рН 8, растворив 36,5 г ЭДТА в воде, отрегулируйте рН до 8,0 с помощью KOH (иначе ЭДТА не растворится), а конечный объем до 250 мл, фильтр-стерилизовать и хранить при комнатной температуре.
  4. Приготовьте 5 мМ фосфат-буферный солевой раствор (PBS)-EDTA, добавив 5 мл 0,5 М EDTA до 500 мл PBS, фильтр-стерилизовать, и хранить при комнатной температуре.
  5. Приготовьте 0,5 М K-PIPES, рН 6.8, растворив 75,5 г PIPES в воде, отрегулируйте до рН 6.8 с KOH (иначе PIPES не растворится) и окончательный объем до 500 мл, фильтр-стерилизовать, и хранить при 4 градусах Цельсия.
  6. Приготовьте 1 М K-PIPES, рН 6.8, растворив 15,1 г PIPES в воде, отрегулируйте до рН 6,8 с KOH и конечный объем до 50 мл, фильтр-стерилизовать, и хранить при 4 градусах Цельсия.
  7. Подготовка 0,5 М калия-этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир)-N,N, N, N, N-тетраацетическая кислота (K-EGTA, рН 7,7) путем растворения 47,5 г EGTA в воде, настроить до рН 7,7 с KOH и конечный объем до 250 мл, фильтр-стерилизовать, и хранить в комнате температуры.
  8. Подготовка BRB80 (80 мММ K-PIPES, рН 6,8; 1 мМ К-ЕГТА; 1 мм магниевогохлорида «MgCl 2»)раствор путем смешивания 3,2 мл 0,5 М PIPES, 40 МКЛ 0,5 М К-ЕГТА и 20 л 1 М МгКл2 и отрегулируйте конечный объем до 20 мл. Хранить при 4 градусов по Цельсию.
  9. Подготовка 0,1 М фенилметанесульфонил фторид (PMSF) путем растворения 435 мг ПМСФ в изопропаноле, чтобы получить окончательный объем 25 мл и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  10. Подготовка ингибиторы протеазы смесь (200x) путем растворения 10 мг апротинина, 10 мг лейпептина, и 10 мг 4-(2-аминоэтил)-бензенсульфонил фторид в воде, чтобы получить окончательный объем 2,5 мл, сделать aliquots 100 йл, и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  11. Приготовьте 10% Triton X-100, смешивая 5 мл Triton X-100 в 45 мл воды, фильтр-стерилизовать и хранить при комнатной температуре.
  12. Подготовка буфера лиза (BRB80, дополненный 1 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 1x ингибиторы протеазы и, по желанию для клеток HEK-293, 0,2% Triton X-100) в день очистки тубулина путем смешивания 20 мл BRB80 с 1,5 МЛ 2-меркаптоэтанола, 200 МЛ 0,1 М PMSF, 100 йл ингибиторов протеазы смеси и, по желанию для HEK-293 клеток , 400 МКЛ 10% Тритон X-100.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 2-меркаптоэтанол является токсичным и должны быть использованы в дым капот.
  13. Приготовьте 0,2 М ГТП, растворив 1 г ГТП в 9,5 мл воды, отрегулируйте рН до 7,5 с помощью KOH, сделайте алициты по 20 МЛ и храните при -20 градусах Цельсия. Избегайте повторных циклов замораживания-оттепели.
  14. Подготовка 1 M tris (гидроксиметил) аминометан-гидрохлорид (Tris-HCl) путем растворения 60,56 г Триса в воде, настроить до рН 6,8 с HCl, в комплекте с окончательным объемом 500 мл, фильтр-стерилизовать, и хранить при комнатной температуре.
  15. Подготовка 5x Лаеммли образец буфера (450 мМм дитиотрейтол (DTT); 10% додекилульфат натрия (SDS); 400 МКМ Трис-HCl, рН 6,8; 50% глицерол; 0,006% бромофено-голубой) путем добавления 4 г SDS до 16 мл предварительно разогретого 1 M Tris-HCl, pH 6.8, и смешать раствор мягко. Добавить 2,6 г DTT и 20 мл 100% глицерола в смесь и перемешать, пока раствор не станет однородным. Добавьте нужное количество бромофено-голубого (2,5 мг), чтобы достичь требуемой интенсивности цвета. Сделать 5 мл aliquots и хранить при -20 градусов по Цельсию. Подготовь 2x рабочий раствор буфера образца Laemmli путем разбавления 5x бульона в дистиллированной воде.

2. Источники усиления и сбора тубулина

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе были использованы три источника тубулина: i) клетки (HeLa S3 и HEK-293), выращенные как культуры подвески; ii) клетки, выращенные как культуры адептов (HEK-293, HeLa и U2 OS); и iii) ткани мозга мыши. Этот протокол рассматривает день очистки тубулина как "день 0" и, соответственно, другие шаги были описаны по отношению к 0-му дню.

  1. Усиление ячеек
    1. Клетки, выращенные как культуры подвески
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для успешного очищения тубулина от культур подвески используйте не менее 2 л культуры подвески.
      1. Для 2 l культуры подвески, оживить и вырастить предпочтительный тип клетки, чтобы получить 6 × 107 клеток за 10 дней до дня подготовки. Днем -10, пластины клетки на шесть 15 см в диаметре блюда на 107 клеток на тарелку.
      2. Днем -8, разогреть необходимое количество полного среднего до 37 градусов по Цельсию. Добавьте 1 л предварительно разогретой среды к каждой бутылке спиннера в стерильных условиях. Поместите спиннеры на перемешивают стол, установленный на 20-25 об / мин внутри инкубатора культуры клеток, слегка откройте боковой спиннер шапки, чтобы среда равномерный в атмосферу инкубатора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать загрязнения, тщательно очистить внешнюю поверхность средств массовой информации и спиннер бутылки с использованием 70% этанола.
      3. На день -7, трипсилизовать и собирать клетки выросли до 80-90% слияния (примерно 1,8 × 108 клеток). Соберите клетки из 3 блюд одновременно, вращайся вниз (200 × г,5 мин, комнатная температура) и повторно приостанавливай все клетки в 10 мл DMEM.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная диссоциация клеток на данный момент очень важно, чтобы избежать образования больших агрегатов в спиннер бутылки, которая влияет на выживание клеток и приводит к низкой урожайности тубулина.
      4. Добавьте 5 мл клеточной подвески к каждой бутылке спиннера, содержащей 1 л DMEM, верните спиннеры к столу мешалки в инкубаторе культуры клеток и позвольте клеткам расти в течение одной недели.
    2. Клетки, выращенные как адепт культуры
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы успешно очистить тубулин от адептов клеток, используйте как минимум 10 блюд 80-90% слияния.
      1. Оживить и усилить желаемый тип клетки, чтобы получить 1 × 108 клеток за три дня до дня приготовления тубулина.
      2. На день -3, пластины этих клеток на десять 15 см посуды на 1 × 107 клетокна блюдо и позволяют им расти 80-90% слияния.
      3. На день -1, при необходимости, трансфектные клетки с плазмидой, чтобы выразить трубулин-изменяющий фермент или определенный изотип тубулина.
  2. Сбор клеток/мозговой ткани
    1. Клетки, выращенные как культуры подвески
      1. Передача клеточной суспензии из спиннеров в 1 л центрифуг бутылки(таблица материалов)и гранулы клетки на 250 × г, 15 мин, комнатная температура. Для немедленного начала другой культуры HeLa S3 клеток в спиннер бутылки, оставить 100 мл клеточной подвески в спиннеры, и добавить 1 л полной, предварительно нагретой DMEM в бутылку спиннера.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно проверьте на бактериальное загрязнение, прежде чем приступить к очистке тубулина.
      2. Resuspend гранулированные клетки из каждой бутылки центрифуги в 10 мл ледяной PBS, и передать все клетки в 50 мл винт-шапка труб. Во время повторной суспензии держите клетки на льду. Пеллет клетки при 250 × г,15 мин, 4 градусов по Цельсию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям по очистке и хранению бутылок спиннера (см. таблицу материалов).
      3. Откажитесь от супернатанта и определите объем клеточной гранулы. От 2 л культуры подвески (две бутылки спиннера), ожидать ячейки гранулы 5-6 мл.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанной ниже, объем гранул клетки, как предполагается, составляет 10 мл. Отрегулируйте эксперимент в соответствии с объемами гранул.
      4. Добавьте 1 том (10 мл) буфера лиза и повторно приостановит ячейку гранулы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение объема клеточных гранул к объему буфера лиза очень важно для успешной очистки тубулина. Добавление дополнительного буфера лиза снижает концентрацию тубулина, которая затем не достигает критической концентрации, необходимой для полимеризации, тем самым значительно снижая урожайность тубулина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, повторно засыкаемые в буфере лиза, могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 градусов по Цельсию в течение двух месяцев.
    2. Клетки, выращенные как адепт культуры
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки из культур приверженцев должны быть собраны очень быстро для успешной очистки тубулина (примерно 15 минут для сбора десяти 15 см посуды). В этом этапе протокола приняли участие три человека.
      1. Удалите среду из 15 см посуды путем наклона посуды, а затем аккуратно промыть клетки с 7 мл PBS-EDTA при комнатной температуре (человек 1). Работайте только с тремя 15 см посуды в то время, чтобы избежать выхода из клеток без среднего или буфера.
      2. Добавьте 5 мл PBS-EDTA в клетки и инкубировать их в течение 5 минут при комнатной температуре.
      3. Используйте сотовый подъемник, чтобы аккуратно отсоединить клетки, лопатой их к одному краю блюда (человек 2), и собрать все клетки в 50 мл винт-шапка трубки (человек 3). Промыть каждую тарелку дополнительными 2 мл PBS-EDTA, чтобы собрать оставшиеся клетки из посуды. Во время этого шага держите 50 мл винт-шапка трубки, содержащей подвеску клетки на льду.
      4. Пеллет клетки при 250 × г,10 мин, 4 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта и определите объем клеточной гранулы. Ожидайте объем 1 мл от десяти 15 см посуды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанной ниже, объем гранул клетки, как предполагается, составляет 10 мл. Отрегулируйте эксперименты в зависимости от объемов гранул.
      5. Повторное увеличение ячеек в 1 томе (10 мл) буфера лиза.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки, повторно засыкаемые в буфере лиза, могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение двух месяцев.
    3. Ткань мозга
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши любого возраста, пола или генетического происхождения могут быть использованы. Выбор трансгенного штамма мыши будет зависеть от научного вопроса, который необходимо решить. В этой рукописи мы покажем пример тубулина, очищенного от ttll1-/- мыши, не хватает основного фермента глутамилации мозга, тубулина тирозина лигазы, как 1 (TTLL1)белка 31.
      1. Пожертвуй мышью при вывихе шейки матки, быстро обезглавите и соберите мозг в круглую нижнюю трубку. Если есть избыток крови на мозг, быстро мыть с лиза буфера. Соберите мозг, как только мышь принесена в жертву, как посмертная задержка может повлиять на успех очистки тубулина. Используйте трубы с круглым дном для размещения ширины зонда, используемого для гомогенизации.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные мозги мыши могут быть snap-frozen в жидком азоте и хранить на -80 C на up to 3 лет.
      2. Добавьте 500 МКЛ буфера лиза в один мозг, извлеченный из взрослой мыши. Для остальной части протокола объем добавленного буфера лиза предполагается 10 мл. Отрегулируйте для вашего эксперимента в зависимости от количества мозгов, которые будут использоваться.

3. Лиз клеток или тканей мозга

  1. Клетки, выращенные как культуры подвески
    1. Для HEK-293, лизировать клетки на льду, повторно трубопроводов вверх и вниз с помощью пипетки советы различной ширины. Во-первых, прикрепите наконечник p1000 к 10 мл пипетки, и пипетка подвески ячейки вверх и вниз каждые 5 минут, в течение 10 минут (три цикла пипетки). Во-вторых, приложите наконечник p200 к кончику p1000 и далее пипетку каждые 5 минут, в течение 20 минут (пять циклов пипетки).
    2. Для HeLa S3, подышечные клетки с помощью французской прессы (см. Таблицу материалов для настроек).
    3. Возьмите 1/100й том смеси лиза (L) (200 л для 20 мл L), и добавить тот же объем 2x laemmli буфера, кипятить в течение 5 минут, и хранить при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
  2. Клетки, выращенные как адепт культуры
    1. Перенесите клетки в 14 мл круглой нижней трубки, высота которой была уменьшена для размещения зонда sonicator (см. Таблицу материалов для настроек). Sonicate клетки для 45 импульсов, и подтвердить лиз клеток путем отбора проб капли лиза смесь под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество импульсов может варьироваться в зависимости от типа клеток, используемых для очистки тубулина. Sonicating клетки слишком много может привести к тубулин осадков и негативно повлияет на урожайность очистки.
    2. Pipette клетки вверх и вниз по льду каждые 5 минут в течение 20 минут (пять циклов пипетки), используя p200 отзыв.
    3. Возьмите 1/100-й том смеси лиза (L) (200 л для 20 мл L) и добавьте тот же объем 2x буфера Laemmli, кипятите в течение 5 минут и храните при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
  3. Ткань мозга
    1. Излишейте ткани мозга с помощью тканевого блендера (см. Таблицу материалов для настроек). Кроме того, подлизать ткани с помощью микротрубки пестик или эквивалентное оборудование и пипетки вверх и вниз по льду с 1 мл шприц с иглой 18 G.
    2. Возьмите 1/100й том смеси лиза (L) (200 л для 20 мл L), и добавить тот же объем 2x laemmli буфера, кипятить в течение 5 минут, и хранить при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.

4. Очистка Тубулина

  1. Лисейт разъяснения
    1. Очистите лизат (разделяя гранулы и растворимую долю смеси лиза) центрифугой при 150 000 × г,4 градусов по Цельсию, 30 мин. Подробнее о роторах и трубках ultracentrifuge можно узнать за таблицей материалов. Для клеточных экстрактов после центрифугации часто образуется белый плавающий слой. Не переносите этот плавающий слой вместе со супернатантом, так как он мешает полимеризации тубулина. Используйте шприц соответствующего объема, прикрепленный к длинной игле 20 G или 21 G, чтобы аккуратно удалить супернатант, не нарушая плавающий слой. Если супернатант по-прежнему облачно, центрифуга на 5000 × г,4 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
    2. Перенесите супернатант (SN1) в ультрацентрифугную трубку и обратите внимание на ее объем. Для гранулы 10 мл клеток, ожидать объем 12 мл для SN1.
    3. Возьмите 1/100-й том SN1 (120 л для 12 мл SN1), и добавить тот же объем 2x laemmli буфера, кипятить в течение 5 минут, и хранить при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
    4. Повторное использование гранул (P1) в BRB80(Таблица материалов)с использованием того же объема, что и SN1. Возьмите 1/100-й том P1 (200 л для 20 мл P1), и добавить тот же объем 2x буфера Laemmli, кипятить в течение 5 мин, и хранить при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
  2. Первая полимеризация в буфере с низким содержанием моли
    1. Подготовьте смесь полимеризации, объединив 1 том SN1 (12 мл), 1/200-й объем 0,2 М GTP (60 МКЛ; окончательная концентрация 1 мМ) и 0,5 тома предварительно нагретого глицерола (6 мл) в винтовой крышке трубки соответствующего объема.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глицерол используется в качестве скученного агента в шагах полимеризации на протяжении всего протокола и, таким образом, не рассматривается при расчетах концентраций других компонентов.
    2. Pipette смешивать вверх и вниз, осторожно избегая образования пузырьков воздуха и передать его в соответствующие ультрацентрифуг трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе смеси в трубки, настроить вес труб (в парах). Это позволяет экспериментатору непосредственно переходить к осадочных микротрубочкам после шага полимеризации. Сделай это для всех шагов полимеризации на протяжении всего протокола.
    3. Обложка трубки с парафильмом, передача на водяную баню при 30 градусов по Цельсию, и инкубировать в течение 20 минут.
    4. Центрифуга труб при 150 000 ×, 30 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Удалите супернатант (SN2) и держите гранулы полимеризованных микротрубочек (P2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы microtubule могут быть застыли и хранятся при -80 градусов по Цельсию на срок до 1 года.
    5. Возьмите 1/200-й том SN2 (90 л для 18 мл SN2) и добавьте тот же объем 2x буфера Laemmli, кипятите в течение 5 минут, и храните при -20 C для дальнейшего анализа.
  3. Первая деполимеризация
    1. Деполимеризируйте микротрубочные трубы, добавляя ледяной BRB80 в гранулы P2, и оставьте на льду на 5 мин: для тубулина из клеток добавьте 1/60 тыс. (200 МКЛ), а для тубулина из мозга добавьте 1/20тыс. (600 МЛ) объема SN1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем ледяного BRB80, добавленного в гранулы во время шагов по деполимеризации, всегда относительно объема SN1.
    2. Аккуратно перерасходуйте гранулы микротрубочек, избегая пузырьков воздуха, пока раствор не станет полностью однородным. Используйте наконечник p1000 в течение нескольких циклов пипетки следуют p200 отзыв каждые 5 минут, в течение 20 минут (пять циклов пипетки). Это важный шаг для успеха очистки тубулина.
    3. Перенесите раствор в соответствующие ультрацентрифуговые трубки и вращайся вниз при 150 000 × г,4 градусов по Цельсию в течение 20 мин. Перенесите SN3 на новую ультрацентрифугную трубку 1,5 мл. Гранулы, образоваваемые после этого шага центрифугации (P3), содержат осажденные белки (микробубуль-ассоциированные белки или MAPs) и недеполимерированные микротрубоколы. Супернатант (SN3) содержит растворимые компоненты: деполимеризованные тубулиные димеры и МАПы, которые отделились от деполимеризованных микротрубочек.
    4. Возьмите 1-4 л SN3 и добавьте 9 томов 2x буфера Laemmli, варите 5 минут и храните при -20 градусах цельсия для дальнейшего анализа.
    5. Resuspend гранулы P3 в BRB80 (в том же объеме SN3), принять 1-4 л, и добавить 9 томов 2x Laemmli буфера, кипятить в течение 5 минут, и хранить при -20 градусов по Цельсию.
  4. Вторая полимеризация (в буфере высокой молити)
    1. Подготовьте смесь полимеризации, объединив 1 том SN3 (200 МКЛ), 1 том предварительно нагретых 1 M PIPES (200 МКЛ, окончательная концентрация 0,5 М), 1/100-й объем 0,2 М ГТП (2 МКЛ, окончательная концентрация 1 мМ) и 1 том предварительно нагретого глицерола (200 МКЛ) в трубке соответствующего объема.
    2. Pipette смешивать вверх и вниз, избегая образования пузырьков воздуха, и передать его в ультрацентрифуг труб.
    3. Обложка трубки с parafilm, передать их на водяную баню, установленную при 30 градусов по Цельсию, и инкубировать в течение 20 минут.
    4. Центрифуга труб при 150 000 г ×,30 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Удалите супернатант (SN4) и храните гранулы полимеризованных микротрубочек (P4). Гранулы P4 содержат полимеризованные микротрубоконы, а супернатант SN4 содержит неполимеризованный тубулин, МАПы и другие растворимые белки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы микротрубочек после второго шага полимеризации могут быть заморожены и храниться при -80 градусов по Цельсию на срок до 1 года.
    5. Возьмите 1-4 Л и добавьте 9 томов 2x буфера Laemmli, кипятите в течение 5 минут и храните при -20 градусах по Цельсию для дальнейшего анализа.
  5. Вторая деполимеризация
    1. Деполимеризировать микротрубочные трубы, добавляя ледяной BRB80 в гранулу P4, и оставить на льду на 5 мин: для тубулина из клеток, добавить 1/100тыс. (120 МКЛ), а для тубулина из мозга, добавить 1/40тыс. (300 йл) объема SN1.
    2. Pipette вверх и вниз с p200 отзыв каждые 5 минут, в течение 20 минут (пять циклов трубопроводов).
    3. Перенесите раствор в 1,5 мл ультрацентрифуг трубки, и спина вниз на 150000 × г, 4 КК в течение 20 мин. Перенесите SN5 на новую ультрацентрифугную трубку 1,5 мл. Гранулы, образоваваемые после этого шага центрифугации (P5), содержат недесполимерированные микротрубоконы. Супернатант (SN5) содержит растворимый тубулин.
    4. Возьмите 1-4 Л и добавьте 9 томов 2x буфера Laemmli, кипятите в течение 5 минут и храните при -20 градусах по Цельсию для дальнейшего анализа.
    5. Resuspend гранулы P5 в BRB80 (тот же объем SN5), принять 1-4 л, и добавить 9 томов 2x Laemmli буфера, кипятить в течение 5 минут, и хранить при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
  6. Третья полимеризация (в буфере с низким уровнем молити)
    1. Подготовьте смесь полимеризации: 1 том SN5 (120 МКЛ), 1/200-й том 0,2 М ГТП (0,6 МКЛ, окончательная концентрация 1 мМ) и 0,5 тома предварительно нагретого глицерола (60 КЛ) в трубке соответствующего объема.
    2. Pipette смешивать вверх и вниз, мягко избегая образования пузырьков воздуха, и передать его в соответствующие ультрацентрифуг трубки.
    3. Обложка трубки с parafilm, передать их на водяную баню, установленную при 30 градусов по Цельсию, и инкубировать в течение 20 минут.
    4. Центрифуга труб при 150 000 г ×,30 градусов по Цельсию в течение 30 мин. Гранулы (P6) содержат полимеризованные микротрубоконы, а супернатант SN6 содержит небольшое количество небер полимеризованного тубулина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы microtubule могут быть snap-frozen и храниться при -80 градусов по Цельсию на срок до 1 года.
    5. Возьмите 1-4 Л и добавьте 9 томов 2x буфера Laemmli, кипятите в течение 5 минут и храните при -20 градусах по Цельсию для дальнейшего анализа.
  7. Третья деполимеризация
    1. Деполимеризируйте микротрубочные трубы, добавляя ледяной BRB80 в гранулу P6, и оставьте на льду на 5 минут: для тубулина из клеток добавьте 1/100тыс. (120 МКЛ), а для тубулина из мозга добавьте 1/40тыс. (300 йл) объема SN1.
    2. Pipette вверх и вниз с p200 отзыв каждые 5 минут, в течение 20 минут (пять циклов трубопроводов).
    3. Перенесите раствор в соответствующие ультрацентрифуговые трубки и вращайся вниз при 150 000 × г,4 градусов по Цельсию в течение 20 мин. Перенесите SN7 на новую ультрацентрифугную трубку 1,5 мл. Гранулы (P7) содержат небольшое количество неразгладимых микротрубочек. Супернатант (SN7) содержит исключительно деполимеризованные микротрубоконы (растворимый тубулин).
    4. Возьмите 1-4 Л и добавьте 9 томов 2x буфера Laemmli, кипятите в течение 5 минут и храните при -20 градусах по Цельсию для дальнейшего анализа.
    5. Resuspend гранулы P7 в BRB80 (тот же объем SN7), принять 1-4 л, и добавить 9 томов 2x Laemmli буфера, кипятить в течение 5 минут, и хранить при -20 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
    6. Количественная оценка количества тубулина (см. результаты представителя)и aliquot SN7 в небольших объемах, snap-freeze, и хранить при -80 градусов по Цельсию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной целью этого метода является производство высококачественных, сборочных трубулинов в количествах, достаточных для проведения повторных экспериментов в пробирке с очищенными компонентами. Микротрубоконы, собранные из этого тубулина, могут быть использованы в анализах восстановления на основе общей внутренней рефлексии флуоресценции (TIRF) микроскопии с динамической или стабильной микротрубочек, в экспериментах тестирования микротрубочек динамики, взаимодействия с MAPs или молекулярных двигателей, и

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь метод обеспечивает платформу для быстрого генерации высококачественных, сборочных трубулинов в средних больших количествах из клеточных линий и мозгов одной мыши. Он основан на золотом стандартном протоколе очистки тубулина от бычьего мозга, используемого в полев течение многих лет 16,17. Одним из особых преимуществ этого подхода является использование культур подвески клеток HeLa S3, которые, как только установлено, дает большое количество клеток...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 и Институт конвергенции NO-жизни ANR-17-CONV-0005. CJ поддерживается Институтом Кюри, Французское национальное исследовательское агентство (ANR) присуждает ANR-12-BSV2-0007 и ANR-17-CE13-0021, Грант Института национального рака (INCA) 2014-PL BIO-11-ICR-1, и Фонд за Recherche Medicale (FRM) грант DE'20170336756. МММ поддерживается Фондом Vaincre Альцгеймера грант FR-16055p, и Франция Альцгеймера грант AAP SM 2019 n'2023. JAS была поддержана научно-исследовательской и инновационной программой Европейского союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения Мари Склодовской-Кюри No 675737 и грантом FRM FDT201904008210. SB был поддержан грантом FRM FDT201805005465.

Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Janke, в частности Дж.Супхрона, а также Г. Лакисича (Институт MICALIS, AgroParisTech) и А. Гаутреу (Политехническая школа) за помощь при создании протокола. Мы хотели бы поблагодарить животноводию Института Кюри за помощь в разведении и уходе за мышами.

Антитело 12G10, разработанное J. Frankel и M. Нельсон, было получено из развития исследований Hybridoma банка, разработанного под эгидой NICHD и поддерживается Университетом штата Айова.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1  M MgCl2 Sigma#M1028
1-литровые сосуды для клеточных культурTechne F7610 Используется для блесны культур. Никогда не перемешивайте пустые бутылки из-под спиннера. Когда вращающиеся флаконы находятся в инкубаторе для клеточных культур, всегда держите боковые клапаны вращающихся бутылок слегка приоткрытыми, чтобы облегчить балансировку среды с инкубатором». . После использования немедленно наполните вращающиеся бутылки водопроводной водой, чтобы избежать высыхания оставшихся ячеек на стенках бутылки. Вымойте бутылки деионизированной водой, добавьте около 200 мл деионизированной воды и автоклав. Под стерильный колпак для клеточных культур удалите воду и дайте флаконам полностью высохнуть, все еще под колпаком, в течение нескольких часов. Никогда не используйте моющие средства для очистки бутылок с вращающимися бутылками, потому что любые следовые количества моющего средства могут нанести вред клеткам.
Тубы 1,5 и 2 мл Тубы
14 мл с круглым дном
Стерильные чашки
с завинчивающейся крышкой
2 меркаптоэтанола Сигма #M31482-меркаптоэтанол токсичен и его следует использовать под капотом.
4-(2-аминоэтил)-бензолсульфонилфторид Сигма 
40% Акриламид Био-Рад #161-0140
5-, 10-20-мл
Стерильные пипетки
винтовой крышкой 50-мл
Персульфат аммония (АФС)Сигма#A3678
Антитела к альфа-альфа-тубулину, 12G10 Разработано Д. Франкелем и М. Нельсоном, получено из банка гибридома исследований развития, разработано под эгидой NICHD и поддерживается Университетом Айовы. Разведение: 1/500
антиглутамилированного тубулинового антитела, GT335 AdipoGen #AG-20B-0020разведение: 1/20 000
апротинина Сигма 
Balance (0,1 – 10 г)
Beckman 1-л полипропиленовые бутылки Для сбора прядильных культур
Beckman Avanti J-26 XP Центрифугасбора прядильных культур
Биологическая мешалка Техне MCS-104L Устанавливается в инкубатор клеточных культур (для спиннерных культур), 25 об/мин для клеток Hela S3 и HEK 293
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide Био-Рад #161-0201
Блендер IKA Ultra-Turrax®  Для лизиса мозговой ткани используйте 5-миллиметровый зонд, при этом аппарат настроен на мощность 6 или 7. Смешайте ткани мозга 2-3 раза в течение 15 с на льду.
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Sigma 
Бромфенол синий Сигма #1.08122
Карбоксипептидаза А (CPA)Сигма#C9268Концентрация: 1.7  U/µ l
для клеточных культур
Инкубатор для клеточных культур установлен при 37°С; C, 5% диметилсульфоксида CO2
(ДМСО)  Сигма #D8418ДМСО может повысить проницаемость клеток и кожи других соединений. Избегайте контактных контактов и используйте средства защиты кожи и глаз.
DMEM medium Технологии жизни #41965062
DTT, DL-дитиотреитол Сигма 
EDTAEuromedex#EU0007-C
EGTASigma 
Абсолют этанола Фишер Кемикал #E/0650DF/15
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma 
Французский пресс под давлением Thermo electron corporation #FA-078Aс ячейкой #FA-032; для лизирования большого количества клеток. Устанавливается на среднее соотношение и манометрическое давление 1 000 фунтов на квадратный дюйм (соответствует 3 000 фунтов на квадратный дюйм внутри камеры разрушения).
Глицерин  VWR Chemicals #24388.295
Глицинсигма#G8898
ГТФ Сигма 
Нагревательный блок Стюарт 
Клетки Хела ATCC® CCL-2&торговля;
Клетки Hela S3 ATCCATCC® CCL-2.2&торговля;
Соляная кислота (HCl)VWR#20252.290
Инвертированный микроскоп С флуоресценцией, если необходимо верифицировать трансфекцию клеток
: Изопропанол VWR #20842.298
jetPEIPolyplus #101
Ротор JLA-8.1000 Для сбора прядильных культур
KOH Сигма #P1767KOH вызывает коррозию и ожоги; используйте средства защиты глаз и кожи.
L-глютамин Технологии жизни #25030123
Лабораторная центрифуга для пробирок 50 млSigma4-16 K 
ЛойпептинСигма#L2884
Жидкий азот 
Микропипетки p2.5, p10, p20, p100, p200 и p1000 и соответствующие наконечники
МикропестикиEppendorf#0030 120.973
Ткани мозга мыши Уход за животными и их использование в этом исследовании проводились в соответствии с рекомендациями Европейского сообщества (2010/63/UE). Экспериментальные процедуры были специально одобрены комитетом по этике Института Кюри CEEA-IC #118 (разрешение No 04395.03, выданное Национальным органом) в соответствии с международными руководящими принципами.
Иглы 18G x 1 ½ ” (1,2 X 38 ммTerumo#18G
иглы 20G x 1 ½ ” (0,9 X 38 ммTerumo#20G
иглы 21G x 4 ¾ ” (0,8 X 120 ммБ.Браун#466 5643
Парафильм
PBS Технологии жизни #14190169
Пенициллин-стрептомицин Технологии жизни #15140130
pH-метр
Фенилметансульфонилфторид (PMSF)Sigma #P7626порошок PMSF опасен. Используйте средства защиты кожи и глаз при приготовлении растворов PMSF.
ТРУБЫ Сигма 
пипеток
Beckman 70.1 Ti; ТЛА-100.3; и оборудование для электрофореза TLA 55
SDS-PAGE Био-Рад 
SDS, додецилсульфат натрия VWR #442444HДля приготовления буфера Леммели 
SDS, Додецилсульфат натрия Сигма #L5750Для приготовления 'TUB' SDS-PAGE гелей
Sonicator Брэнсон#101-148-070Используется для лизирования клеток, выращенных в качестве адгезивных культур. Используйте щуп диаметром 6,5 мм, установите ультразвуковой аппарат в положение « Управление выходом" 1, « Рабочий цикл" 10% и время в зависимости от типа используемой ячейки.
Настольная центрифуга для пробирок 1,5 млEppendorf5417R 
TEMED, N, N, N′, N′-тетраметилэтилендиамин Sigma#9281
Трихостатин А (ТСА)Сигма#T8552
Тритон Х-100Сигма 
База Тризма (Трис)Sigma 
Трипсин Life Technologies#15090046
Роторы ультрацентрифуг Роторы TLA-55, TLA-100.3 и 70.1 Tiустановлены на 4°С; С или 30°С; C исходя из необходимости проведения эксперимента 
Ультрацентрифужные пробирки Бекман#357448 для использования с ротором TLA-55
Ультрацентрифужные пробирки Beckman#349622для использования с роторными
ультрацентрифужными трубкамиБекман#355631 для использования с ротором 70.1 Ti
УльтрацентрифугиBeckmanOptima L80-XP (или аналоги) и Optima MAX-XP (или аналогиУстановлены на 4°Град; С или 30°С; C исходя из необходимости проведения эксперимента 
Вихревой смеситель
Водяная баня с поплавками или держателямиУстановлен на 30° С 
для культуры диаметром 15 смТубы #A8456Шприцы 5-мл, 10-мл, 25-млПробирки с#A1153 для #A7906Колпак #D9779#E3889#F7524#G8877#SBH130D#P6757 Роторы для #1658001FC#T9284#T1503 TLA-100.3 ) трубок

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
  2. Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  3. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  4. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  5. Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
  6. Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
  7. Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
  8. Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
  9. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  10. Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  11. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  12. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  13. Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
  14. Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
  15. Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
  16. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  17. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  18. Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
  19. Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
  20. Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
  21. Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
  22. Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
  23. Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
  24. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
  25. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  26. Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
  27. Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
  28. Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18(2020).
  29. Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705(2019).
  30. Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
  31. Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440(2018).
  32. Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
  33. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  34. Magiera, M. M., Janke, C. Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. Correia, J. J., Wilson, L. , Academic Press. 247-267 (2013).
  35. Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
  36. Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
  37. Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
  38. Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
  39. Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
  40. Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
  41. Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDS PAGEin vitro

Похожие статьи