Рабочий процесс количественной протеомики с использованием множественного мониторинга реакций на основе обнаружения белков из ткани мозга человека

В течение последнего десятилетия быстрое развитие масс-спектрометрии (МС) в сочетании с более глубокое понимание методов хроматографии значительно помогло в продвижении протеомики на основе РС. Методы, основанные на молекулярной биологии, такие как западное блоттинг и иммуногистохимия, уже давно страдают от проблем воспроизводимости, медленного времени обработки, изменчивости между наблюдателями и их неспособности точно количественно оценивать белки, и это лишь некоторые из них. С этой целью превосходная чувствительность высокопроизводительных подходов к протеомике продолжает предлагать молекулярным биологам альтернативный и более надежный инструмент в их стремлении лучше понять роль белков в клетках. Тем не менее, подходы к протеомике дробовика (Data dependent Acquisition или DDA) часто не могут обнаружить низкие обильные белки в сложных тканях, помимо того, что они в значительной степени зависят от чувствительности и разрешения инструмента. За последние пару лет лаборатории по всему миру разрабатывали такие методы, как Data Independent Acquisition (DIA), которые требуют увеличения вычислительной мощности и надежного программного обеспечения, которое может обрабатывать эти очень сложные наборы данных. Тем не менее, эти методы все еще находятся в процессе разработки и не очень удобны для пользователя. Целевые подходы протеомики на основе РС обеспечивают идеальный баланс между высокопроизводительный характер подходов к РС и чувствительностью подходов молекулярной биологии, таких как ИФА. Целевой эксперимент по протеомике на основе масс-спектрометрии фокусируется на обнаружении белков или пептидов, основанных на гипотезах, из экспериментов по протеомике на основе открытия дробовика или через доступную литературу^1,2. Множественный мониторинг реакций (MRM) является одним из таких целевых подходов MS, который использует тандемный квадрупольный масс-спектрометр для точного обнаружения и количественной оценки белков / пептидов из сложных образцов. Метод предлагает более высокую чувствительность и специфичность, несмотря на необходимость использования инструмента с низким разрешением.

Квадруполь состоит из 4 параллельных стержней, каждый из которых соединен с диагонально противоположным стержнем. Флуктуирующее поле создается между квадрупольными стержнями путем подачи переменных напряжений ВЧ и постоянного тока. На траекторию ионов внутри квадруполя влияет наличие одинаковых напряжений на противоположных стержнях. Применяя радиочастотное напряжение к постоянному току, траектория ионов может быть стабилизирована. Именно это свойство квадруполя позволяет использовать его в качестве массового фильтра, который может избирательно пропускать определенные ионы. В зависимости от необходимости квадруполь может работать как в статическом, так и в сканирутном режиме. Статический режим позволяет проходить только ионам с заданным m/z, что делает режим очень селективным и специфичным для интересующих ионов. Режим сканирования, с другой стороны, позволяет проходить ионам во всем диапазоне m/z. Таким образом, тандемные квадрупольные масс-спектрометры могут работать 4 возможными способами: i) первый квадруполь, работающий в статическом режиме, а второй – в режиме сканирования; ii) первый квадруполь, работающий в режиме сканирования, а второй – в статическом режиме; iii) оба квадруполя, работающие в режиме сканирования; и iv) оба квадруполя, работающие в статическом режиме^3. В типичном эксперименте MRM оба квадруполя работают в статическом режиме, что позволяет контролировать конкретные прекурсоры и их результирующие продукты после фрагментации. Это делает технику очень чувствительной и избирательной, что позволяет проводить точную количественную оценку.

Для молекулярных биологов ткань мозга человека и ее клетки являются сокровищницей. Эти замечательные единицы вечно интересного органа человеческого тела могут обеспечить молекулярное и клеточное понимание его функционирования. Протеомные исследования мозговой ткани могут не только помочь нам понять системное функционирование здорового мозга, но и клеточные пути, которые дисрегулируются при заболевании^4. Однако мозговая ткань со всей ее неоднородностью является очень сложным органом для анализа и требует согласованного подхода для лучшего понимания изменений на молекулярном уровне. Следующая работа описывает весь рабочий процесс, начиная с извлечения белков из мозговой ткани, создания и оптимизации методов анализа MRM, до проверки целей(рисунок 1). Здесь мы систематически освещаем основные шаги, связанные с успешным экспериментом на основе MRM с использованием ткани человеческого мозга с целью представления техники и ее проблем более широкому исследовательской аудитории.

Это исследование включает образцы мозговой ткани от людей-участников, рассмотренные и одобренные TMH и IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Участники предоставили свое информированное и письменное согласие на участие в этом исследовании.

1 Извлечение белка из мозговой ткани

1. Взвесьте около 50 мг мозговой ткани и промыть ткань 300 мкл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) с помощью микропипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для удаления любой крови на внешней поверхности ткани и должен быть повторен при необходимости. Желательно удалить как можно больше крови из ткани, так как это мешает последующей оценке и обработке белка.
2. После промывки PBS добавьте 300 мкл лизисного буфера (buffer A) в трубку, содержащую ткань. Буфер А содержит 8 М мочевины, 50 мМ Tris pH 8,0, 75 мМ NaCl, 1 мМ_MgCl2 и коктейль ингибитора протеазы (согласно инструкциям производителя).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выход белка варьируется в зависимости от нескольких факторов, начиная от условий, в которых хранятся образцы, количества исходного материала и эффективности обработки образцов во время обработки. Уменьшают объем буфера А пропорционально при работе с количеством ткани ниже 50 мг.
3. Разжижайте ткань с помощью зондового ультразвукового аппарата, сохраняя трубку на ледяной ванне. Используйте следующие параметры для обработки ультразвуком: амплитуда 40%, цикл вкл. и выключение 5 секунд в течение 2:30 мин.
4. Продолжайте гомогенизацию тканей с помощью бисерного битерного битера, чтобы полностью лизезовать ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует выполнять на средней скорости в течение 90 секунд с последующей инкубацией на льду в течение 3-5 минут.
5. Центрифугируют содержимое пробирки при 6 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Переложите супернатант в свежий тюбик и однородно перемешайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте аликвоты образца и храните при -80°C до дальнейшего использования.

2 Количественная оценка и проверка качества белка

1. Количественно оценить образцы до пищеварения, используя стандартный график, составленный с известными концентрациями BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что анализ, используемый для оценки белка, совместим с буфером, используемым для получения лизата белка. Проверьте качество лизата белка, икомпустив гель SDS-PAGE.

3 Переваривание белка

1. Возьмите 50 мкг белка в микроцентрифужной трубке и уменьшите белки, добавив Tris 2-карбоксиэтилфосфин (TCEP) таким образом, чтобы конечная концентрация была 20 мМ. Инкубировать содержимое при 37 °C в течение 1 ч.
2. После инкубации алкилируют восстановленные белки, добавляя йодоацетамид (IAA) в пробирку таким образом, чтобы его конечная концентрация была 40 мМ. Инкубировать тюбик в темноте в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте IAA заново непосредственно перед его добавлением в тюбик.
3. Добавьте буфер В в пробирку, содержащую восстановленные и алкилированные белки таким образом, чтобы конечная концентрация мочевины в пробирке была менее 1 М.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер B состоит из 25 мМ Tris (рН 8,0) и 1 мМ_CaCl2 и используется для разбавления образцов. При разбавлении убедитесь, что содержимое трубки имеет рН 8 для оптимального переваривания белка после добавления трипсина.
4. Добавьте трипсин в соотношении фермента к белку 1:30 и инкубируют трубки в течение ночи при 37 °C с постоянным встряхиванием.
5. После переваривания сконцентрируйте переваренный продукт в вакуумном концентраторе. На этом этапе пептиды могут быть либо восстановлены и обессолины, либо сохранены при -80 °C для будущего использования.

4 Обессоливание и количественная оценка пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Обессоливание или очистка пептидов необходимы перед загрузкой образцов для LC-MS / MS. Соли и другие загрязняющие вещества в образце могут засорить колонны и привести к повреждению прибора. Процесс может быть выполнен с использованием коммерчески доступных наконечников ступеней или колонн C18.

1. Активируйте наконечник стадии с помощью 20 мкл 50% ацетонитрила (ACN) в 0,1% муравьиной кислоты (FA). Центрифугировать содержимое в 1000 х г в течение 1 минуты и выбросить поток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия центрифугирования одинаковы до конца процедуры.
2. Добавьте 20 мкл 100% ACN в 0,1% FA и центрифугируют содержимое, как на этапе 4.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги активации можно повторить пару раз.
3. После активации пропустите 20 мкл восстановленного пептидного образца через наконечник ступени и центрифугу, как это выполнено на этапе 4.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не отбрасывайте поток на этом шаге.
4. Повторите этап 4.3 с прохождением через не менее 5 раз, чтобы обеспечить максимальное связывание пептидов с наконечником ступени.
5. Пропустите 20 мкл 0,1% FA через наконечник ступени и отбросьте поток через него.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг еще два раза для получения лучших результатов.
6. Элюдирует связанные пептиды в свежей микрофьюжной трубке путем прохождения возрастающих концентраций ACN, т.е. на 40%, 60% и 80% соответственно.
7. Высушите пептиды в вакуумном концентраторе и приступайте к количественной оценке пептидов.
8. Восстановить высушенные пептиды в 0,1% FA и количественно оценить с помощью метода^{Scopes 5.}

5 Подготовка перечня переходных процессов для окончательных целевых показателей

ПРИМЕЧАНИЕ: Переход относится к паре прекурсоров (Q1) к продукту (Q3) m/z значений в эксперименте MRM. Пептид может иметь от одного до многих переходов, с одинаковым значением Q1, но разными значениями Q3. Тройной квадрупольный масс-спектрометр требует информации о переходах для обнаружения пептидов и их продуктов. Следовательно, прежде чем начать целевой эксперимент, необходимо подготовить список переходов. Это можно сделать с помощью онлайн-репозитория SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) или программного обеспечения с открытым исходным кодом под названием Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Загрузите недавний файл FASTA протеома человека из UniProt (https://www.uniprot.org/) и создайте фоновый файл протеома, вставив его в Skyline. В настройках пептидов перейдите в раскрывающийся список Фоновый протеом и нажмите Добавить. Лента в файле последовательности FASTA протеома человека. Убедитесь, что выбрана эта база данных и значение разрешенного пропущенного расщепления установлено в 0, прежде чем переходить к следующему шагу.
2. Теперь под вкладкой Фильтр в настройках пептидов разграничьйте длину принимаемых пептидов от 8 до 25 аминокислот.
3. В разделе Параметры переходана вкладке Фильтр установите для параметра Сборы прекурсоров значение 2,3, для параметра Ионные заряды — значение 1 и для параметра Типы ионов значение y. Ионы продукта могут быть выбраны в зависимости от выбора пользователя. Выберите N-терминал для пролин для специальных ионов и оставьте все остальные параметры по умолчанию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки пептида и перехода могут варьироваться в зависимости от эксперимента.
4. Вставьте интересующие пептиды или белки, нажав на Edit и перейдя к Insert. Чтобы вставить белки, скопируйте их идентификаторы присоединения и вставьте конкретные пептиды, скопируйте пептидные последовательности. Программное обеспечение сопоставляет идентификаторы присоединения с фоновым протеомом, а список переходов создается на основе настроек пептида и перехода.
5. Экспортируйте список переходов. Убедитесь, что в раскрывающемся списка Тип инструментавыбран правильный инструмент. Для экспериментов по оптимизации можно разделить списки переходов на более мелкие числа, установив желаемое количество переходов на файл в Skyline. Это гарантирует, что инструмент не будет перегружен для экранировать слишком много переходов за один прогон. Количество переходов необходимо дополнительно оптимизировать, чтобы получить один метод - об этом мы упоминаем далее в разделе уточнения метода.

6 LC параметров

1. Используйте бинарную систему растворителей с водным растворителем, содержащим 0,1% FA (растворитель A), и органическим растворителем, содержащим 80% ACN (растворитель B).
2. Установите температуру колонки на 45 °C.
3. Установите градиент LC 10 мин с расходом 450 мкл/мин (как показано в таблице S1).

7 параметров MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Объясненный анализ был разработан и оптимизирован для тройного квадрупольного масс-спектрометра TSQ Altis.

1. Оптимизируйте параметры выполнения, такие как разрешение Q1 и Q3, время ожидания и время цикла - по одному параметру за раз. Мы считаем, что разрешение 0,7 для Q1 и Q3 работает лучше всего. Время цикла или время выдержки, возможно, потребуется настроить в соответствии с количеством переходов и средней пиковой шириной контролируемых пептидов.
2. Используйте параметры MS в таблице S2 и таблице S3. Общая продолжительность метода составляет 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры остаются неизменными для всех запусков во время и после уточнения метода, если не указано иное. Для нового эксперимента может возникнуть необходимость в изменении определенных параметров в зависимости от типа образца и этапов обработки образца.

8 Последовательность выполнения и контроля качества инструмента

1. Готовят смесь из воды: метанол: изопропанол: ацетонитрил в соотношении 1:1:1:1. Используйте эту смесь в качестве заготовки.
2. Подготовьте пептиды для любого стандартного образца, который может быть использован для последовательного мониторинга производительности инструмента. Это будет использоваться в качестве стандарта контроля качества. Мы обнаруживаем пептиды из дигестов BSA, которые были оптимизированы и дают хороший и последовательный ответ в течение несколькихдней (рисунок 2).
3. Для запуска образцов последовательность должна начинаться с пары пробелов, за которыми следуют стандартные образцы QC и клинические образцы. Всегда следите за тем, чтобы между двумя последовательными образцами была одна заготовка.
4. Для удобства сравнения убедитесь, что каждый раз вводятся равные количества и объемы каждого образца.

9 Уточнение метода

1. Проанализируйте предварительные данные, полученные из объединенных образцов с помощью Skyline. Ищите правильный пик, переходы и параметры, такие как форма пика и интенсивность, чтобы выбрать наилучшие результаты. Сохраните файл как новый проект Skyline.
2. Используйте библиотеку, чтобы найти наиболее подходящий пик и, следовательно, наилучший возможный список переходов. Библиотека представляет собой набор пиков MS / MS, доступных из литературы или домашних экспериментов.
3. Экспортируйте новый список переходов из недавно сохраненного проекта Skyline и используйте этот список переходов, чтобы создать новый метод. Получите данные из нового созданного метода и повторите процесс уточнения переходов с помощью Skyline.
4. После того, как список пептидов и переходов будет завершен после анализа данных с использованием Skyline, настройте метод, опробовав различные перестановки времени цикла и времени ожидания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тяжелых меченых синтетических пептидов и пептидов с индексируемым временем удержания (iRT) облегчает уточнение метода^8,9. Поэтому желательно, чтобы тонкая настройка метода была выполнена с использованием этих пептидов.
5. Используя сведения о времени хранения из экспериментов по уточнению, создайте запланированный окончательный метод (имеющий определенное окно сбора).
6. Подготовьте образцы для отдельных субъектов. Данные будут получены для этих образцов с использованием окончательного запланированного метода.
7. После получения данных можно выполнить дальнейший анализ и групповое сравнение путем импорта необработанных файлов в Skyline.

Мы провели относительную количественную оценку 3 белков из 10 образцов, по 5 образцов из каждой группы пациентов с аномалиями в головном мозге. Эти белки включали аполипопротеин A-I (APOA-I), виментин (VIM) и никотинамидфосфорибозилтрансферазу (NAMPT), которые, как известно, выполняют различные роли в клетках мозга. Послепрогонный анализ данных проводился с помощью Skyline-daily (Ver 20.2.1.286). В общей сложности контролировалось 10 пептидов, соответствующих 3 белкам. К ним относятся 3 пептида для APOA-I, 4 пептида для VIM и 3 пептида для NAMPT. Общее количество переходов из этих 10 пептидов составило 57. Образцы были сгруппированы в одну из двух групп в зависимости от состояния, к которому они принадлежали. Используя функцию групповых сравнений горизонта, сравнивали пиковые обилия этих пептидов и рассчитывали относительные количественные значения(рисунок 3).

Рисунок 1:Обзор шагов, участвующих в эксперименте по мониторингу множественных реакций. А. Пробоподготовка для типичного протеомного эксперимента включает экстракцию белков (для иллюстрации мы показали образец ткани) с последующим перевариванием с использованием трипсина. Переваренные пептиды в конечном итоге обессоливаются и делают LC-MS готовыми. В. Этапы, участвующие в эксперименте MRM, включают выбор прекурсора и ионов продукта на основе их значений m/z. Для анализа рассматриваются только переходы, показывающие хорошую реакцию. С. Анализ данных в эксперименте MRM включает в себя подробное изучение пиковых форм и пиковых областей. За этим в конечном итоге следует статистический анализ результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Согласованность в ответе для BSA с использованием оптимизированного метода управления записями сообщений. А. Хроматограмма для репрезентативного пептида BSA показывает последовательную пиковую форму и интенсивность в течение пяти дней эксперимента. В. Постоянство времени удержания наблюдалось для пептида на протяжении всех пяти дней эксперимента C. Пиковые области для пептида наблюдались в течение пяти дней в неделю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Дифференциальная регуляция трех белков в двух группах образцов опухолей GBM. А. Репрезентативные хроматограммы для аполипопротеина А-I и кумулятивной области пика, как показано после межгруппового сравнения. В. Репрезентативные хроматограммы для виментина и кумулятивной пиковой области, как показано после межгруппового сравнения. С. Репрезентативные хроматограммы для никотинамидфосфорибозилтрансферазы и кумулятивной пиковой области, как показано после межгруппового сравнения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица S1: Подробная информация о 10-минутном градиенте LC, который будет использоваться для всех образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица S2: Параметры для источника ионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица S3: Параметры для метода управления записями сообщений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Авторы получили поддержку от Thermofisher за публикацию.