Методическая статья

ПЦР-мутагенез, клонирование, экспрессия, протоколы быстрой очистки белка и кристаллизация дикого типа и мутантных форм триптофанссинтазы

DOI:

10.3791/61839

⸱

26 сентября 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California-Riverside, 2Department of Biochemistry, University of California-Riverside

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье представлен ряд последовательных методов экспрессии и очистки сальмонеллы типимуриум триптофансинтазы, составляющих этот протокол быстрой системой для очистки белкового комплекса за сутки. Охватываемыми методами являются сайт-направленный мутагенез, экспрессия белка в кишечной палочке,аффинная хроматография, гель-фильтрационная хроматография и кристаллизация.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Структурные исследования с комплексом бифермента триптофансинтазы (TS) (α2β2 TS) из Salmonella typhimurium были выполнены для лучшего понимания его каталитического механизма, аллостерического поведения и деталей ферментативной трансформации субстрата в продукт в PLP-зависимых ферментах. В этой работе новая система экспрессии для получения изолированного α- и изолированного β-субъединицы позволила очистить большое количество чистых субъединиц и α2β2комплекса StTS от изолированных субъединиц в течение 2 дней. Очистку проводили с помощью аффинной хроматографии с последующим расщеплением метки сродства, осаждением сульфата аммония и хроматографией с исключением размера (SEC). Чтобы лучше понять роль ключевых остатков в ферменте β-сайте, в предыдущих структурных исследованиях был выполнен прямой мутагенез. Другой протокол был создан для очистки дикого типа и мутантного α2β2комплексовStTS. Простой, быстрый и эффективный протокол с использованием фракционирования сульфата аммония и SEC позволил очистить α2βкомплекс 2StTS за один день. Оба протокола очистки, описанные в этой работе, имеют значительные преимущества по сравнению с предыдущими протоколами очистки одного и того же комплекса с использованием ПЭГ 8000 и спермина для кристаллизации комплекса α2β2StTS по протоколу очистки. Кристаллизация дикого типа и некоторых мутантных форм происходит в несколько иных условиях, ухудшая очистку некоторых мутантов с помощью ПЭГ 8000 и спермина. Для подготовки кристаллов, пригодных для рентгеновских кристаллографических исследований, были предприняты некоторые усилия по оптимизации кристаллизации, качества кристаллов и криозащиты. Представленные здесь способы должны быть общеприменимы для очистки субъединиц триптофансинтозной и мутантной α2β2комплексовStTS.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Комплекс бифермента триптофансинтаза (ТС) (α2β2)является аллостерическим ферментом, катализируя последние две ступени биосинтеза аминокислоты L-триптофана у бактерий, растений и грибов1,2,3. Бактерия Salmonella enterica serovar typhimurium (St)вызывает тяжелую желудочно-кишечную инфекцию у человека и других животных. Поскольку люди и высшие животные не имеют TS (EC 4.2.1.20), ингибирование S. typhimurium α2β 2 TS complex (α2 β2StTS) было изучено в качестве потенциальной лекарственной мишени для лечения криптоспоридиоза и туберкулеза4,генитальных и глазных инфекций5и для потенциального использования гербицидов в сельском хозяйстве6. Α-субъединица катализирует альдолитическое расщепление индол-3-глицерин-фосфата (IGP) на глицеральдегид-3-фосфат (GAP) и индол, путем образования промежуточного продукта индоленина таутомера и последующего расщепления углерод-углеродных связей с образованием GAP ииндола 3,6. Β-каталитический сайт содержит молекулу кофактора пиридоксаль-5'-фосфата (PLP), связанную с β-Lys87 через основание Шиффа, которое функционирует как поглотитель электронов в ходе реакций на ферменте β-субъединичи3,7. Β-сайт катализирует замену гидроксила L-сериновой боковой цепи индолом с целью получения L-триптофана и молекулы воды в PLP-зависимой реакции. Св TS служит давней моделью для исследования субстратного каналинга и аллостерической связи в мультиферментных комплексах2,3. Двунаправленная аллостерическая связь между α- и β-субъединицами TS необходима для синхронизации каталитических этапов и предотвращения высвобождения индола при синтезе L-триптофана3. Чтобы расширить эти усилия, мы подготовили несколько мутантов (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr и β-Ser377Ala) с помощью одноточечной мутации для использования в дальнейших исследованиях взаимосвязи между структурой фермента, механизмом и функцией в каталитическом месте stTS β-субъединой.

Детальное исследование каталитического механизма α2β2StTS было инициировано исследовательской группой Эдит У. Майлз. Ранние исследования с нативной кишечной палочкой α2β2 комплекса TS были сосредоточены на очистке и характеристике изолированного α-субъединицы8,9,изолированной β-субъединицы10,11 и воссоздании комплекса α2β2 TS из изолированных субъединиц12. Очистку проводили осаждением сульфата аммония, диализом проб, хроматографией DEAE-Sephadex, диализом и вторым хроматографическим раундом на колонке12DEAE-Sephadex. В другом протоколе очистка того же комплекса была улучшена путем загрузки осветленного клеточного лизата на колонку DEAE-Sephadex с последующим хроматографическим шагом на колонку Sepharose 4B, осаждением сульфата аммония и диализом13. Оба протокола очистки длятся 4-5 дней. Escherichia coli α2β2 TS комплекса кристаллизовалась, но кристаллы не были пригодны для дифракции рентгеновских лучей в то время.

В новом исследовании рекомбинантные и дикие формы S. typhimurium α2β2 TS комплекса были очищены и кристаллизованы14,15. Рекомбинантный комплекс α2β2StTS был переэкспрессирован в штамме E. coli CB149, несущем вектор экспрессии pEBA-10. Сообщалось о сборе данных о первоначальной кристаллизации и рентгеновской дифракции и анализе α2β2комплексаStTS14. Однако длинные и тонкие иглы, такие как α2β2кристаллаStTS, нарушали структурные исследования. В попытке собрать лучшие данные рентгеновской дифракции был описан другой протокол очистки для очистки дикого типа и мутантных форм α2β2Комплекса StTS15. Очистку проводили с начальным осаждением с использованием спермина и ПЭГ 8000 в осветленный клеточный лисат и большой громоздкий осадок удаляли центрифугированием. Надпоменной фракции, содержащей большое количество α2βкомплексе StTS2,хранили в течение 16-48 ч при 4 °C до осаждения желтых кристаллов. Кристаллы промывали и широко диализовали против различных буферов. Белковый комплекс перекристаллизовали в буфер, содержащий сульфат аммония и диализовали15. Хотя кристаллизация белка зависит от концентраций белка и осадителя в растворе, трудно контролировать, прогнозировать и воспроизводить очистку для других мутантных форм α2βкомплексаStTS в растворе. Этот протокол имеет то преимущество, что он не использует никаких хроматографических методов; однако недостатками являются длительное время очистки, необходимое для кристаллизации, диализа и рекристаллизации, обычно требующее 5-7 дней. Для получения кристаллов, пригодных для сбора рентгеновских данных, оценивали более 600 условий кристаллизации с использованием комбинации и вариации концентрации белка, температуры, осадителей (ПЭГ 4000, 6000 и 8000) и добавок (CaCl2,MnCl2,ZnCl2,кадаверин, путресцин, спермин или спермидин)15. Кристаллы имели лучшую кристаллическую форму и росли быстрее в условиях, содержащих 12% ПЭГ 8000 и 2 мМ спермина. Кристаллизация была более благоприятной при 25 °C, а не при 4, 30 или 42 °C, и выросла до максимальных размеров в течение 3дней 15. Насегодняшнийдень было зарегистрировано несколько α 2 β2Кристаллическиеструктуры St TS (1996-1999)16,17,18, 19,20,21 и многие другие структуры.

Здесь основной целью является представление альтернативных протоколов для очистки триптофансинтазы и оптимизации кристаллизации белка. Настоящая работа показывает значительные улучшения для очистки дикого типа, изолированного α-субъединицы (αStTS), изолированной β-субъединицы (βStTS), воссозданной α2β2Комплекса StTS из изолированных субъединиц, а также дикого типа и мутантных форм комплекса α2β2StTS. Преимущества по сравнению с прошлыми протоколами значительны, поскольку время очистки было значительно сокращено, а кристаллизация и криозащита были оптимизированы. Мутантные формы α2β2St TSкомплекса,спроектированные в этой работе, кристаллизовались почти в том же состоянии, что и для формы дикого типа. Однако оптимизация тонкой кристаллизации была необходима для получения крупных монокристаллов достаточного качества для определения структуры при близком к атомному разрешению. На сегодняшний день в Банке данных белка (PDB) депонировано 134 кристаллические структуры триптофансинтаз, что составляет 101, 31 и 2 кристаллические структуры, соответственно, для бактерий, архей и эукариот. 73 структуры принадлежат к S. enterica serovar typhimurium и 5 кристаллических структур комплекса α2β2StTS имеют пределы разрешения выше 1,50 Ангстрема. Неудивительно, что 4 из 5 были подготовлены в нашей исследовательской группе (PDB IDs: 5CGQ при 1,18 Å, 4HT3 при 1,30 Å, 4HPJ при 1,45 Å, 6DZ4 при разрешении 1,45 Å). Ожидается, что уточненные кристаллические структуры мутантной формы комплекса α2β2StTS обеспечат новое понимание механизма и роли, которые играют эфирные аминокислотные остатки, участвующие в синтезе L-триптофана.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Быстрый протокол для очистки α- и β-субъединичных и рекомбинированных α2β комплексStTS2

  1. Субклонирование ДНК в вектор экспрессии pETSUMO
    1. Получить ген трансляционно-связывающей связи (trpA и trpB), кодирующий α-и β-субъединицы триптофансинтазы из бактерии Salmonella enterica serovar typhimurium, клонированной в векторе экспрессии pEBA-1022. Используйте вектор pEBA-10 в качестве шаблона ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, перечисленные ниже праймеры могут быть использованы для амплификации обоих генов из генома Salmonella enterica serovar typhimurium. Все шаги молекулярной биологии были выполнены, как описано в Molecular Cloning: A Laboratory Manual23.
    2. Используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации индивидуально полноразмерной полинуклеотидной последовательности α-субъединицы(αStTS) праймерами αStTS-FW-Bam и αStTS-Rev-Eco и полноразмерной последовательностью β-субъединицы(βStTS) с праймерами βStTS-FW-Bam и βStTS-Rev-Hind. Используйте температуру плавления приблизительно 55 °C и время растявания полимеразы 2 мин.
      1. Используйте высокоточную ДНК-полимеразу (например, Phusion) и протокол производителя для ампляции последовательностей ДНК. Для реакции ПЦР 50 мкл добавляют 34 мкл воды без нуклеазы, 10 мкл 5-кратного реакционного буфера, 1 мкл 10 мМ дНТП, 1 мкл прямого праймера 10 мкМ, 1 мкл обратного праймера 10 мкМ, 1 мкл шаблонной ДНК (200 нг), 1,5 мкл ДМСО, 0,5 мкл ДНК-полимеразы Phusion.
      2. Для программы ПЦР используйте горячий запуск (180 секунд при 98 °C), за которым следуют 30 циклов усиления (30 секунд при 98 °C, 30 секунд при 55 °C и 120 секунд при 72 °C) и окончательное расширение (300 секунд при 72 °C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Выделенные курсивом последовательности соответствуют участкам ограничения BamHI, EcoRI, BamHI и HindIII соответственно. Эффективность расщепления ферментов вблизи конечной области фрагментов ПЦР была повышена за счет добавления дополнительных оснований (последовательностей в нижнем регистре).
        αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
        αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
    3. Загрузите продукт ПЦР на 0,8% агарозный гель в 1x буфере TAE (40 мМ Tris, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА) при 6 В/см, гель экстрагирует интересующий диапазон ДНК и гель очищает фрагмент ПЦР с помощью набора из диоксид кремния в соответствии с инструкциями производителя.
      1. Переваривайте не менее 200 нг каждого фрагмента ДНК с соответствующими ферментами рестрикции и условиями, рекомендованными производителем, в течение 2 часов при 37 °C.
      2. Для создания реакции рестрикции пищеварения 50 мкл добавляют 34 мкл воды без нуклеазы, 10 мкл ДНК (200 нг), 5 мкл 10-кратного реакционного буфера, 0,5 мкл фермента рестрикции 1 и 0,5 мкл фермента рестрикции 2.
      3. Загрузите продукт пищеварения на 0,8% агарозный гель на 1x TAE при 6 В/см, гель-экстракт и гель очищают переваренный фрагмент с помощью коммерческого набора.
    4. Субклон по отдельности каждого фрагмента в экспрессию E. coli модифицирован вектором pET SUMO, предварительно переваренным соответствующими ферментами и очищенным гелем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вектор является модифицированной версией коммерческого pET SUMO. Этот вектор оптимизирован для клонирования ферментов рестрикции. Участок мультиклонирования (MCS) вектора pET28b(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI и XhoI) был вставлен в сайт клонирования pET SUMO. Этот вектор содержит N-концевую метку 6x-гистидина в рамке с малым убиквитин-подобным модификатором белка (SUMO) и несколькими сайтами клонирования.
    5. Лигат 100 нг модифицированного пЭТ СУМО и 50 нг фрагмента ПЦР с Т4 ДНК лигазой в течение 2 часов при 25 °C.
    6. Преобразование построенной плазмиды в компетентные клетки штамма E. coli DH10Bα клеток. Пластинчатые ячейки на агаровых пластинах LB, содержащие 35 мкг/мл канамицина. Инкубировать пластину, перевернутую в течение ночи при 37 °C.
    7. Выберите одну колонию из каждого преобразования, подготовьте сверхчистую плазмидную ДНК и выполните секвенирование ДНК, чтобы убедиться, что αStTS или βStTS были клонированы в рамке с N-концевой меткой His6-SUMO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте глицериновые запасы клеточной культуры (превратите клеточную суспензию в 16% конечной концентрации стерильного глицерина) и храните их длительно при -80 °C.
    8. Трансформируйте экспрессионную плазмиду SUMO-αStTS или SUMO-βStTS индивидуально в компетентные клетки экспрессии E. coli штамма Rosetta (DE3) pLysS с системой на основе промоторов T7. Накладывайте рекомбинантные клетки на агаровые пластины Luria Bertani (LB), содержащие 35 мкг/мл канамицина и хлорамфеникола. Инкубировать пластину, перевернутую в течение ночи при 37 °C.
    9. После успешного формирования колонии выберите одну единственную колонию (без каких-либо колоний-спутников) и рассейте ее в 5 мл среды LB с обоими антибиотиками. Культивнують клетки на ночь с встряхиванием при 200 об/мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте запасы глицерина в клеточной культуре, храните в течение длительного времени при -80 °C или немедленно используйте для экспрессии рекомбинантного белка.
  2. Выражение субъединиц SUMO-αStTS и SUMO-βStTS
    1. Инокулировать свежие клетки E. coli Rosetta (DE3) pLysS, содержащие SUMO-αStTS или SUMO-βStTS, конструируют или соскребают часть замороженного глицеринового запаса в 50 мл культуры LB, содержащей 35 мкг / мл канамицина и хлорамфеникола. Растите клетки в течение ночи с встряхиванием при 200 об/мин при 37 °C.
    2. На следующее утро привить 5 мл ночной клеточной культуры в свежую и стерильную 2x 1000 мл LB, содержащую 2% глицерина плюс канамицин и хлорамфеникол (2,8 л колбы Фернбаха). Выращивать клеточную культуру с встряхиванием при 200 об/мин при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессия SUMO-αStTS или SUMO-βStTS в бульоне LB дает 125-150 мг помеченного белка на литр. Рассмотрите возможность масштабирования протокола вверх или вниз для удовлетворения конкретных требований.
    3. Индуцируют экспрессию рекомбинантного белка, когда OD600 достигает 0,6-0,8 путем добавления изопропил β-D-1 тиогалактопиранозида (IPTG) в конечной концентрации 0,4 мМ с последующей инкубацией при 30 °C в течение ночи с встряхиванием при 200 об/мин.
    4. Собирайте клетки путем центрифугирования при 4000 х г при 4 °C в течение 20 мин. Удалить супернатант и повторно суспендировать гранулы клеток с буфером холодного лизиса 1 (50 мМ Tris-Cl, рН 8,0, содержащий 500 мМ NaCl, 5% глицерин, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 40 мМ имидазол-Cl) до конечного объема 60 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться длительно при -80 °C или использоваться немедленно для очистки белка. Для хранения клеток расщепляют клеточную суспензию на 2 х 50 мл одноразовых конических трубок центрифуги и держат гранулы клеток при -80 °C до этапа очистки белка.
  3. Очищение α- и β субъединицы триптофансинтазы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться при 4°C, если не указано иное. Чтобы сократить время очистки, уравновешивайте Ni-NTA агарозные никелевые сродственные колонны и колонку исключения размера в буфере до очистки белка или во время экспрессии рекомбинантного белка.
    1. Разрушайте гранулы клеток ультразвуком с помощью цифрового сонификатора с 1/2" роговым зондом (или аналогичного оборудования). Выполните 20 циклов при 80% амплитудном дежурстве на водяной бане с использованием импульса 10 с и 20 с покоя или до полного разрушения клеток.
    2. Центрифугируют клеточный лисат при 30 000 х г в течение 30 мин. Аспират супернатант, гарантирующий, что гранула не вытесняется из трубки. Фильтруйте супернатант с помощью фильтрующего блока 0,45 мкм на льду и пропускайте его через 15 мл Ni-NTA агарозную никелевую графу, предварительно уравновешиваемую в буфере лизиса 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая колонка Агарозы Ni-NTA будет использоваться для очистки либо SUMO-αStTS, либо SUMO-βStTS рекомбинантного белка. Очистка может быть выполнена в колонке Ni-NiTA объемом 2x 5 мл, прикрепленной к системе быстрой жидкостной хроматографии белка. Очищают по одному белку за раз.
    3. Промыть Ni-NTA агарозную колонну в 100 мл лизисного буфера 1.
    4. Приступают к одноступенчатой элюции 80 мл с буфером E1 (буфер Tris-Cl 25 мМ, рН 7,8, содержащий 200 мМ NaCl, 5% глицерина и 400 мМ имидазол-Cl).
      ПРИМЕЧАНИЕ: СУМО-протеаза переносит до 300 мМ имидазола, а мембрана центробежных фильтрующих устройств допускает до 100 мМ имидазола. Мы рекомендуем проводить осаждение сульфата аммония для удаления большого количества имидазола и уменьшения времени очистки, вместо этого разбавляйте образец белка и тратьте время на концентрацию белка.
    5. Оцените начальный объем фракции надмывателя. Медленно добавляйте небольшие количества сульфата аммония за раз, пока не будет достигнуто насыщение 60% (39,48 г / 100 мл) при 25 °C. Осторожно перемешайте раствор в течение 30 минут и избегайте пузырьков. Центрифуга при 10 000 х г в течение 15 мин.
    6. Аспирировать и аккуратно выбросить надмную фракцию. Повторное суспендирование фракции гранул в 20 мл буфера образца (20 мМ Tris-Cl, рН 8,0, 300 мМ NaCl и 5% глицерина).
    7. Для расщепления His-SUMO-tag с SUMO-протеазой добавляют рекомбинантный фрагмент Ubl-специфической протеазы 1 из Saccharomyces cerevisiae в соотношении 1:1000 и инкубируют смесь в течение 2 часов при 4 °C.
    8. Центрифугируют продукт пищеварения при 10 000 х г при 25 °C в течение 20 мин для удаления белковых агрегатов перед загрузкой образца через аффинную хроматографическую колонку.
    9. Удалите следы метки His6-SUMO, проходящей мимо 20 мл повторно суспендированного образца на 15 мл Ni-NTA агарозной колонке, ранее уравновешенной в буфере лизиса 1.
    10. Соберите сквозной образец, содержащий непомеченные αStTS или βStTS.
    11. Промыть колонку Ni-NTA в 20 мл буфера 1 для сбора остатков непомеченных αStTS или βStTS.
    12. Сконцентрируйте каждую субъединицу отдельно с помощью отсечки центробежного фильтра 15 мл 10 кДа путем вращения при 3000 х г при 4 °C. Переложите концентрированный белок в свежую пробирку объемом 2,0 мл и микроцентрифугу (10 000 х г, 10 мин, 4 °C) для удаления агрегатов. Определяют концентрацию белка24,готовят 1 мл аликвоты по 20-25 мг мл-1,маркируют, вспыхивают в жидком азоте и хранят их при -80 °С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно очищенные образцы белка могут храниться длительно при -80 °C или использоваться немедленно для очистки белка на хроматографической колонке исключения размера (SEC).
    13. Принимают белковую аликвоту (20 мг) и микроцентрифугу по 10 000 х г в течение 10 мин, чтобы удалить агрегаты до SEC.
    14. Образец нагрузки на колонку эксклюзионной хроматографии размеров (например, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR), прикрепленный к быстрой жидкостной хроматографии белка со скоростью потока 0,5 млмин-1, предварительноуравновешенный в буфере SEC (10 мМ Tris-Cl, рН 7,8, 100 мМ NaCl, 5% глицерин, 0,1 мМ пиридоксального фосфата).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки больших количеств изолированных αStTS или β субъединицыStTS и уменьшения количества раундов SEC загрузите образец объемом 5 мл при 20-25 мг мл-1 на размер изоляционного хроматографического столбца при расходе 1,5 млмин-1.
    15. Оценить качество αStTS или βStTS в пиковой фракции используют 12% или 15% додецилсульфат-гель электрофорез натрия (SDS-PAGE), соответственно, окрашенный блестящим синим пятном Coomassie25.
    16. Концентрат белка со свежим 15 мл 10 кДа отсечных центробежных фильтрующими установками, определяют концентрацию белка24,готовят 0,5 мл аликвот при 20-25 мгмл-1,этикетку, флэш-заморозивают в жидком азоте и хранят их при -80 °С.
  4. Очистка комплекса α2β 2СтТСот α и β
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уравновешить размер эксклюзионной хроматографической колонки (Sephadex S-200 HR или Superdex 200 pg) в буфере SEC (10 мМ Tris-Cl, рН 7,8, 100 мМ NaCl, 5% глицерин, 0,1 мМ пиридоксальфосфата).
    1. Для очистки α дикого типа2β комплексаStTS2от α и β субъединиц, оттаивания образцов концентрата αсубъединицStTS и βStTS при 4 °C.
    2. Объединяют аликвоты (1,2 αStTS: 1,0 β молярное отношениеStTS) и инкубируют при 4 °C в течение 1 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Превышение αStTS необходимо для обеспечения того, чтобы большая часть βStTS была включена в комплекс α2β2StTS.
    3. Удаляют белковые агрегаты путем микроцентрифугирования (10 000 х г, 10 мин, 4 °C).
    4. Загрузите уточненный супернатант в столбец исключения размера.
    5. Оценить качество αStTS или βStTS в пиковой фракции используют 12% или 15% додецилсульфат-гель электрофорез натрия (SDS-PAGE), соответственно, окрашенный блестящим синим пятном Coomassie25.
    6. Определяют концентрацию белка24,готовят 250-1000 мкл аликвот при 15-20 мгмл-1,вспыхивают в жидком азоте и хранят при -80 °С.

2. Очистка дикого типа или мутантной формы α2β2КомплексStTS

  1. Мутагенез, направленный на сайт, для подготовки мутантных βStTS
    1. Используйте конструкцию вектора экспрессии pEBA-1022 в качестве шаблона ДНК во время двухэтаго этапов полимеразной цепной реакции для введения специфических точечных мутаций в полинуклеотидную последовательность TS β-цепи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть использован для введения одноточечной мутации в α или β субъединице из Salmonella typhimurium триптофансинтазы. Для дополнительного, новые олигонуклеотидные праймеры, содержащие желаемую мутацию, должны быть соответствующим образом спроектированы. В этой работе перечислены мутации βQ114A, βK167T βS377A.
    2. Выполняйте ПЦР-реакции с использованием пар нуклеотидных праймеров TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev и TS-FW-NcoI/S377A-Rev для генерации фрагментов A1, B1 и C1 соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотид TS-NcoI-FW и TS-SacI-Rev, соответственно, отжигает вверх и вниз по течению полинуклеотидной последовательности αβ StTS, клонированной в векторе pEBA-10.
      1. Используйте высокоточную ДНК-полимеразу (например, Phusion) и протокол производителя для ампляции последовательностей ДНК. Для 50-мкл ПЦР-реакции добавляют 34 мкл воды без нуклеазы, 10 мкл 5-кратного реакционного буфера, 1 мкл 10 мМ дНТП, 1 мкл прямого праймера 10 мкМ, 1 мкл обратного праймера 10 мкМ, 1 мкл шаблонной ДНК (200 нг), 1,5 мкл ДМСО, 0,5 мкл ДНК-полимеразы.
      2. Для программы ПЦР используйте горячий старт (180 секунд при 98 °C), за которым следуют 30 циклов усиления (30 секунд при 98 °C, 30 секунд при 55 °C и 120 секунд при 72 °C) и окончательное расширение (300 секунд при 72 °C).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги молекулярной биологии были выполнены, как описано в Molecular Cloning: A Laboratory Manual23. В то время как последовательность в нижнем регистре соответствует сайту ограничения, полужирная и курсивная последовательность соответствует мутации.
        TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
        Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
        K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
        S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
    3. Выполняйте реакции ПЦР с использованием пар нуклеотидных праймеров TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF и TS-Rev-SacI/S377A-FF для генерации фрагментов A2, B2 и C2 соответственно.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
    4. Используют полимеразную цепную реакцию для индивидуального усиления частичных фрагментов. Используйте температуру плавления 55 °C и время растявания полимеразы 2 мин.
    5. Для выполнения второго раунда реакций ПЦР загрузите продукт ПЦР выше на 0,8% агарозный гель на 1x TAE при 6 В / см и гель экстракт и гель очищают интересующий фрагменты.
      1. Смешайте фрагменты A1/A2, B1/B2 и C1/C2 отдельно в эквимолярных количествах, термически денатюрите смесь в течение 10 мин при 96 °C и отжигайте при 25 °C. Удлиняйте рекомбинантные нити высокоточной полимеразой и дезоксирибонуклеотидами согласно протоколу производителя.
    6. Чтобы сгенерировать большое число копий полноразмерного мутантного фрагмента ДНК, добавьте олиго-праймеры TS-FW-NcoI и TS-Rev-SacI для выполнения второй ПЦР.
    7. Загрузите ПЦР-продукт на 0,8% агарозы в 1x буфере TAE при 6 В/см, гель экстрагирует интересующий его диапазон ДНК, гель очищает фрагмент ПЦР и продолжает соответствующее рестрикционным пищеварением в течение 2 часов при 37 °C в соответствии с соответствующим буфером и условиями, рекомендованными производителем.
      1. Переваривайте не менее 200 нг каждого фрагмента ДНК с соответствующими ферментами рестрикции и условиями, рекомендованными производителем, в течение 2 часов при 37 °C. Для создания реакции рестрикции пищеварения 50 мкл добавляют 34 мкл воды без нуклеазы, 10 мкл ДНК (200 нг), 5 мкл 10-кратного реакционного буфера, 0,5 мкл фермента рестрикции 1 и 0,5 мкл фермента рестрикции 2. Нагрузить продукт пищеварения на 0,8% агарозы в 1x БУФЕРЕ TAE при 6 В/см и очистить переваренный фрагмент ПЦР.
    8. Переваривайте 200 нг конструкции pEBA-10 с ферментами рестрикции NcoI и SacI в соответствии с рекомендацией производителя. Загрузите продукт пищеварения на 0,8% агарозный гель в 1x буфере TAE при 6 В/см, иссейте полосу, соответствующий вектору, и гель очистит переваренный вектор.
    9. Лигат 100 нг вектора с 50 нг фрагмента ПЦР, предварительно переваренный и очищенный, с Т4 ДНК лигазой в течение 2 часов при 25 °C. Преобразование построенной плазмиды в компетентные клетки E. coli штамма DH10B клеток. Пластинчатые ячейки на пластинах агара LB, содержащие 50 мкг/мл ампициллина. Инкубировать пластину, перевернутую в течение ночи при 37 °C.
    10. Выберите одну колонию (без каких-либо колоний-сателлитов) из каждой клеточной трансформации и рассейте ее в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин. Растите клетки в течение ночи с встряхиванием при 200 об/мин при 37 °C. Подготовьте 10 мкг сверхчистой плазмидной ДНК из каждой инженерной конструкции. Готовят глицериновые запасы клеточной культуры (превращают клеточную суспензию в 16% конечной концентрации стерильного глицерина) и хранят длительно при -80 °C.
    11. Выполните секвенирование ДНК для подтверждения полноразмерной последовательности, кодирующей α и β субъединицы триптофансинтазы. Подтвердите каждую отдельную мутацию и отбросьте любую плазмидную конструкцию, содержащую нежелательную случайную мутацию. Олигонуклеотидные праймеры, используемые в этом исследовании, перечислены ниже.
      TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
      TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
      TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
      TS-3F: 5'-ГАТГАТГЦКАААКАК-3'
      TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
      TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCATTG-3'
      ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотидные праймеры TS-1F, TS-1R, TS-2F и TS-3F отжигают полинуклеотидную последовательность β-субъединица (код присоединения GenBank: CP051286.1). Грунтовки TS-4F и TS-5F отжигают на полинуклеотидной последовательности α-субъединица (код присоединения GenBank: CP053865.1).
    12. Используйте 200 нг каждой плазмидной конструкции (pEBA-10-βQ114A, pEBA-10-βK167T и pEBA-10-βS377A) для преобразования компетентных клеток экспрессии E. coli штамма CB149, не имеющего trp оперона26. После успешного формирования колонии выберите одну единственную колонию и вырастите клетки в 5 мл среды LB, содержащей 50 мкг / мл ампициллина. Культивная культура в бактериальном инкубаторе при 37 °C в течение ночи. Приготовьте запасы глицерина в клеточной культуре, храните длительно при -80 °C или немедленно используйте для экспрессии рекомбинантного белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Одна одноточечная мутация в α или β субъединице из сальмонеллы типимуриум триптофансинтазы может ухудшить функцию фермента или снизить синтез L-триптофана в штамме E. coli CB149. Пожалуйста, рассмотрите возможность использования штамма E. coli BL21(DE)pLys-S или Rosetta (DE3)pLys-S, еслив геле SDS-PAGE обнаружена экспрессия или более низкое количество рекомбинантного комплекса α 2 β2StTS.
  2. Экспрессия дикого типа и мутантной формы α2β2КомплексаStTS в E. coli
    1. Вырастите экспрессивный штамм E. coli, содержащий желаемую конструкцию в свежем и стерильном 50 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Растите клетки в течение ночи с встряхиванием при 200 об/мин при 37 °C.
    2. Добавьте 5 мл ночной клеточной культуры в свежую и стерильную 2x 1000 мл LB, содержащую 2% глицерина плюс ампициллин (2,8 л колбы Фернбаха). Выращивать клеточную культуру с встряхиванием при 200 об/мин при 37 °C.
    3. Индуцируют экспрессию рекомбинантного белка, когда OD600 достигает 0,6-0,8 путем добавления IPTG в конечной концентрации 0,4 мМ с последующей инкубацией при 30 °C в течение ночи с встряхиванием при 200 об/мин.
    4. Собирайте клетки путем центрифугирования при 4000 х г при 4 °C в течение 20 мин. Удалите супернатант и повторно суспендировать гранулы клеток с буфером холодного лизиса 2 (50 мМ Tris-Cl, рН 7,80, содержащий 100 мМ NaCl, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ PMSF) до конечного объема буфера 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться длительно при -80 °C или использоваться немедленно для очистки белка. Для хранения клеток расщепляют клеточную суспензию на 2 х 50 мл одноразовых конических трубок центрифуги и держат гранулы клеток при -80 °C до этапа очистки белка. Экспрессия мутантной и дикой типовой формы α2β2комплекса StTS в бульоне LB дает 125-150 мг белка на литр. Рассмотрите возможность масштабирования протокола вверх или вниз для удовлетворения конкретных требований.
  3. Очистка дикого типа или мутантной формы α2βкомплекс 2StTS
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предназначен для очистки немаркированного рекомбинантного дикого типа или мутантной формы рекомбинантного α2β2StКомплекс ТС в течение 1 дня, в зависимости от набора навыков и усилий. Чтобы сократить время очистки, уравновешивают размер колонки исключения в буфере до очистки/экспрессии белка. Очистка диких или мутантных α2β2StКомплекс TS осуществляется двухступенчатой очисткой, включающей фракционирование сульфата аммония и размерно-исключающую хроматографию. Этот протокол дает 60-100 мг чистого комплекса из 1 л lb среды.
    1. Разрушайте гранулы клеток ультразвуком с помощью цифрового сонификатора с 1/2" роговым зондом (или аналогичного оборудования). Выполните 20 циклов при 80% амплитудном дежурстве на водяной бане с использованием импульса 10 с и 20 с покоя или до полного разрушения клеток.
    2. Центрифугируют клеточный лисат при 30 000 х г в течение 30 мин при 25 °C. Аспират супернатант, гарантирующий, что гранула не вытесняется из трубки. Фильтровать осветленную фракцию надменного утвержданта фильтром 0,45 мкм при комнатной температуре.
    3. Оценить начальный объем осветленной фракции надменного сона. Медленно добавляют небольшие количества сульфата аммония за раз, пока не будет достигнуто 20% насыщение (11,51 г / 100 мл). Проводят фракционирование сульфата аммония при 25 °C. Осторожно перемешайте раствор в течение 10 минут и избегайте пузырьков.
    4. Центрифуга при 30 000 х г в течение 10 мин при 25 °C. Переложите 20% фракции супернатанта в чистую колбу. Осторожно повторно суспендировать 20% фракцию гранул в 20 мл буфера образца 2 (50 мМ Tris-Cl, рН 7,80, содержащего 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотрейтола) и подготовить образец для запуска геля SDS-PAGE. Откажитесь от фракции гранул 20%.
    5. Оцените начальный объем 20% фракции надмывателя. Добавляют сульфат аммония до достижения 30% насыщения (5,94 г/100 мл), перемешивают раствор, избегают пузырьков и центрифугируют, как и раньше. Переложите 30% фракции супернатанта в чистую колбу. Осторожно повторно суспендируйте 30% фракцию гранул в 20 мл буфера образца 2 и подготовьте образец для запуска геля SDS-PAGE. Отбросьте 30% фракцию гранул.
    6. Оцените начальный объем 30% фракции надмывателя. Добавляют сульфат аммония при 40% насыщении (6,14 г/100 мл), перемешивают раствор, избегают пузырьков и центрифугируют, как и раньше. Переложите 40% фракции супернатанта в чистую колбу. Осторожно повторно суспендируйте 40% фракцию гранул в 10 мл буфера образца 2 и подготовьте образец для запуска геля SDS-PAGE. Отбросьте 40% фракцию супернатанта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените качество комплекса αβStTS с использованием образцов 30% и 40% фракций супернатанта и гранул в 12% геле SDS-PAGE25. Если вы убедитесь, что любой другой мутантный комплекс αβStTS находится в 40% надводной фракции, приступайте к 60% насыщению сульфата аммония (13,0 г / 100 мл). Предварительно очищенные белковые аликвоты предварительно очищенного α2β2 Комплекса StTS могут длительно храниться при -80 °C или использоваться непосредственно для очистки белка на хроматографической колонке (SEC).
    7. Микроцентрифугирование образца белка при 10 000 х г,20 мин, 4 °C и загрузка фракции супернатанта на колонку HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR, прикрепленную к быстрой жидкостной хроматографии белка со скоростью потока 0,5 млмин-1, предварительноуравновешенную в буфере SEC (10 мМ Tris-Cl, рН 7,8, 100 мМ NaCl, 5% глицерина, 0,1 мМ пиридоксальфосфата).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для очистки больших количеств комплекса загрузите образец 5 мл при 20-25 мг мл-1 на колонку HiLoad 26/600 Superdex 200 pg со скоростью потока 1,5 мл мин-1.
    8. Оценить образцы, собранные вдоль фракционирования сульфата аммония и пиковых фракций из колонны SEC на 12% геле SDS-PAGE, окрашенном блестящим синим пятном Coomassie25.
    9. Концентрировать дикий тип или мутантный α2βкомплексе 2StTS с отсечным центробежным фильтрующим блоком 15 мл 100 кДа путем вращения при 3000 х г при 4 °C. Переложите концентрированный белок в свежую пробирку объемом 2,0 мл и микроцентрифугу (10 000 х г, 10 мин, 4 °C) для удаления агрегатов.
    10. Определяют концентрацию белка24,готовят 0,5 мл аликвот по 20-25 мгмл-1,маркируют, вспыхивают в жидком азоте и хранят их при -80 °С.

3. Оптимизирована кристаллизация для дикого типа и мутантной формы комплекса α2β2StTS

ПРИМЕЧАНИЕ: Исходное условие кристаллизации комплекса α2β2StTS ранее сообщалось в условиях, содержащих 12% ПЭГ 8000 и 2 мМ спермина22.

  1. Подготовьте бульочные растворы перед анализами кристаллизации для достижения лучшей воспроизводимости кристаллизации. Для выполнения структурных исследований с TS кристаллизуют белок с иономNa+ илиCs+ в месте координации металла комплекса бифермента.
    1. Готовят 5 мл бульонного раствора 200 мМ спермина в воде и сохраняют 500 мкл аликвот при -20 °C.
    2. Приготовьте 50 мл бульонного раствора 30% (мас./об.) ПЭГ 8000 в воде и храните 25 мл аликвот в одноразовых конических колбах центрифуги 50 мл при 25 °C.
    3. Приготовьте 25 мл раствора 1 M CsCl в воде и держите при 25 °C.
    4. Приготовить 25 мл бульонного раствора 1 М NaCl в воде и выдержать при 25 °C.
    5. Готовят 3x 50 мл стоковой раствор 1 M bicine и титруют CsOH или NaOH для получения буферных растворов при рН 7,6, 7,8 и 8,0. Держите 25 мл аликвот при 4 °C.
  2. Разморозить образец α2βкомплексе 2StTS (20-25 мгмл-1)на ледяной ванне.
  3. Микроцентрифуга образца при 10 000 х г в течение 10 мин при 25 °C для удаления белковых агрегатов.
  4. Перенесите очищенную фракцию супернатанта в чистую микроцентрифужную трубку.
  5. Расчетная концентрация белка24 и разбавленные белковые аликвоты (150-200 мкл) при 15 мгмл-1 с 50 мМ бицин-CsOH или -NaOH, рН 7,8, содержащий 50 мМ CsCl или NaCl. Держите образец белка при 25 °C.
  6. Подготовьте резервуарные растворы объемом 500 мкл для 3 24-х сидячих капельных пластин в стерильных микроцентрифужных трубках с маркировкой 1,5 мл. Резервуарный раствор содержит 50 мМ бицин-CsOH или -NaOH, 50 мМ CsCl или NaCl и PEG 8000. Варьируют концентрацию ПЭГ 8000 (6-11%) на пластинчатых колонках и концентрацию спермина (2-8 мМ) на пластинчатых рядах. Изменяйте буферный pH (pH 7,6, 7,8 и 8,0) для каждого набора.
  7. Замыкайте трубки и энергично вихрь не менее 10 сек. Центрифужные трубки при 10 000 х г в течение 10 мин при 25 °C для удаленияпузырьков. Дозировать 500 мкл буферного раствора в каждый маркированный резервуар.
  8. Используйте микропипетку P-10 и дозируют 5 мкл белкового раствора по 15 мг мл-1 на каждую каплю сидения. Избегайте пузырьков. Добавьте 5 мкл каждого соответствующего резервуарного раствора к капле белка. Избегайте пузырьков во время смешивания и не пипеткой вверх и вниз для гомогенизации смеси.
  9. Обмазкайте пластину прозрачной клейкой лентой и храните пластину при 25 °C. Кристаллы появляются через 2-5 дней и вырастают до своих полных размеров в течение двух недель.

4. Сбор данных о дифракции рентгеновских лучей и α2β комплексного структурного решения2StTS

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сбором данных о дифракции рентгеновских лучей заранее подготовьте раствор криопротектора для каждого кристалла. Используют специфический резервуарный раствор для приготовления 3 аликвот, содержащих повышающие концентрации dиметилсульфоксида в растворе (10, 20 и 30% v/v) и специфических лигандах (ах). Было обнаружено, что диметилсульфоксид является лучшим криопротектором, чем глицерин, этиленгликоль и ПЭГ 200-300.

  1. Соберите большой монокристалл с помощью криолопа под стереоскопическим микроскопом.
  2. Пипетка 2 мкл каждого раствора криопротектора, содержащего раствор для осаждения плюс более высокие концентрации dиметилсульфоксида и лиганда (лиганда) на новом слайде обложки.
  3. Последовательно замочите cризталом в каждой капле и дайте кристаллу уравновеситься в течение 30 с в растворе криопротектора.
  4. Мгновенное охлаждение криозащитного кристалла с использованием потока газообразного азота при -173 °C (100 K) или погружение в жидкий азот для длительного хранения в шайбах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наполните пену Дьюара жидким азотом, предварительно охладите хрустальную шайбу, храните кристаллы в криогенном хранилище Дьюара и отправляйте кристаллы на синхротрон с помощью сухого грузоотправителя.
  5. Приступайте к сбору данных о дифракции рентгеновских лучей при -173°C. Записывайте данные о дифракции рентгеновских лучей, используя время экспозиции 0,5-4,0 с и колебания 0,5°. Поверните кристалл на 180-360°.
  6. Обработайте рентгеновские дифракционные изображения с помощью iMosflm27 для создания файла отражения в соответствующей пространственной группе. Как правило, кристаллы α2β2StTS принадлежат к космической группе C 121 (C2).
  7. Масштабирование нескольких наблюдений отражений с помощью Scala28,реализованного в пакете CCP429.
  8. Решить структуру комплекса α высокого разрешения2β2StTS путем молекулярной замены с помощью MolRep30 и соответствующей модели поиска. Проверьте модель и карту электронной плотности в Coot31 после успешного структурного решения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует много кристаллических структур TS, депонированных в банке данных белка с различными лигандами (лигандами). Для лучшего этапа молекулярной замены и сокращения времени подгонки более новой кристаллической структуры используйте лучшую модель поиска, содержащую интересующий лиганд (ы). Приступайте к уточнению кристаллической структуры в CCP429,30 или Phenix31.
  9. Внесите ручные корректировки в модель с помощью Coot32,с последующим автоматическим уточнением с помощью Refmac29,33 или phenix.уточните31,34. Постройте и уточните окончательную модель, выполнив итерационные раунды построения модели в Coot32 и автоматически уточнив.
  10. Продолжайте депонирование координатных и структурных факторов на веб-сайте Банка данных о белках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Очищение α- и β- субъединиц триптофансинтаз
Α-субъединица(αStTS) и β-субъединица (βStTS) сальмонеллы типимуриу триптофанасинтазы были субклонированы в модифицированном векторе pET SUMO. На рисунке 1A показаны репрезентативные результаты SDS-PAGE двух сильных полос, соответствующих белку слияния His6-SUMO-αStTS (полоса αON) и His6-SUMO-βSt...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы успешно разработали мутантную форму α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T и α2β2 βS377A StTS комплексы для корреляционных исследований структуры и функции. Первоначально мы пытались очистить мутантов, используя предыдущий протокол очистки22,который требует α2β2StTS комплексной кристаллизации с ПЭГ 8000 и спермином во время очистки. Хотя скорость кристаллизации зависит от мутантной формы и от концентраци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать и заявлять об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения США (GM097569).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
15 мл 10 кДа фильтрMilliporeSigmaUFC901024центробежный фильтрующий блок
15 мл 100 кДа фильтрMilliporeSigmaUFC910024центробежный фильтрующий блок
2 мл криогенные флаконыCorningCLS430489криогенные пробирки
мл микроцентрифужные пробиркиFisher Scientific05-408-141микроцентрифужные пробирки
24 лунки Cryschem PlateHamptonResearch HR3-15824-луночные сидячие капельные пластины
2-меркаптоэтанолFisherScientific O3446I-100Chemical
50 мл центрифуга конические пробиркиThermo Scientific12-565-270центрифуга конические пробирки
AB15 ACCUMET BasicFisher Scientific13-636-AB15pH-метр
AgaroseFisher ScientificBP1356-100Агарозный гель
сульфат аммонияFisher ScientificA702-500Химический
ампициллинFisher ScientificBP1760-5
Бактериальный инкубаторантибиотиков FisherScientific S35836.
BamHINew England BiolabsR0136SФермент рестрикции
бицинFisher ScientificBP2646100Chemical
Branson 450 Digital SonifyBrasonB450Клеточный разрушитель
хлорида цезияFisher ScientificBP210-100Chemical
Cesium hydroxideAcros OrganicsAC213601000Chemical
ХлорамфениколFisher ScientificBP904-100Антибиотик
диметилсульфоксидFisherScientific D1391
Дитиотреитолхимический Fisher ScientificBP172-5Химическая
ДНК-полимеразаThermo ScientificF530SHF полимераза
dNTP НаборInvitrogen10-297-018dNTPs набор
EcoRINew England BiolabsR0101SФермент рестрикции
Этилендиаминтетрауксусная кислотаFisher ScientificS311-100Chemical
Excella E25R Orbital ShakerEppendorf New BrunswickM1353-0004Орбитальный инкубатор
GE AKTA Prime PlusGE Healthcare8149-30-0004FPLC
Набор для экстракции геляInvitrogenK210012Набор для очистки ДНК
ГлицеринFisher ScientificG33-500Chemical
HindIIINew England BiolabsR0104SФермент рестрикции
His-Trap колонкиGE HealthcareGE17-5255-015 мл Histrap колонка
имидазолFisher ScientificO3196-500Chemical
IPTGThermo Fisher ScientificR0392Индуктор
KanamycinFisher ScientificBP906-5Антибиотик
Kelvinator Series-100Kelvinatorснят с производстваUltra low freezer
LB бульонFisher ScientificBP1426-500Жидкий бульон
Luria Bertani агарFisher ScientificBP1425-2Твердый бульон
NaClFisher Scientific S271-500Chemical
NcoINew England BiolabsR0193SФермент рестрикции
Ni-NTA аффинные гранулыThermo Fisher ScientificR90115Ni-NTA агарозные бусины
PEG 8000Fisher ScientificBP233-100Химический
фенилметилсульфонилфторидFisher Scientific44-865-0Chemical
пиридоксальфосфатAcros OrganicsAC228170010Chemical
S-200 HRCytiva45-000-196Колонка исключения размера
SacINew England BiolabsR0156SФермент рестрикции
Гидроксид натрияFisher ScientificS318-100Chemical
Sorvall RC-5B центрифугаSorvall8327-30-1004Напольный цетрифуг
СперминAcros OrganicsAC132750010Chemical
Superdex 200 prep gradeCytiva45-002-491Колонка исключения размера
T4 ДНК-лигазаNew England BiolabsM0202SДНК лиагса
TrisFisher ScientificBP152-500Химическая
Ubl-специфическая протеаза 1Thermo Scientific12588018SUMO Протеаза
2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miles, E. W. Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel. Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).
  2. Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. Tryptophan synthase: a mine for enzymologists. Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).
  3. Dunn, M. F. Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex. Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).
  4. Chaudhary, K., Roos, D. S. Protozoan genomics for drug discovery. Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).
  5. Caldwell, H. D., et al. Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates. Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).
  6. Kulik, V., et al. On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).
  7. Barends, T. R., et al. Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate. Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).
  8. Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).
  9. Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies. Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).
  10. Wilson, D. A., Crawford, I. P. Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase. Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).
  11. Adachi, O., Miles, E. W. A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield. Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).
  12. Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex. Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).
  13. Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments. Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).
  14. Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).
  15. Miles, E. W., et al. The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230. Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).
  16. Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex. Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).
  17. Rhee, S., et al. Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes. Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).
  18. Schneider, T. R., et al. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase. Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).
  19. Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49. Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).
  20. Weyand, M., Schlichting, I. Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate. Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).
  21. Sachpatzidis, A., et al. Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase. Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).
  22. Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382. Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).
  24. Lowry, O. H., et al. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent. Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits. Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).
  27. Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  28. Evans, P. Scaling and Assessment of Data Quality. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).
  29. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).
  30. Vagin, A., Teplyakov, A. Molecular replacement with MOLREP. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).
  31. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  32. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  33. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).
  34. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).
  35. Matthews, B. W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).
  36. Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals. Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

8000SDS PAGE

Похожие статьи