Методическая статья

Трехмерная культура адипоцитов в качестве модели для изучения ремоделирования белой жировой ткани, вызванного кахексией

DOI:

10.3791/61853

⸱

18 января 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrated Biotechnology, University of Mogi das Cruzes, 2Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine, 3Obesity Research Center, Department of Medicine, Boston University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает трехмерную (3D) систему магнитной печати, которая позволяет рассекать ремоделирование белой жировой ткани (WAT), вызванное кондиционированной средой из раковых клеток. Использование 3D-системы культивирования адипоцитов UCP1+, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), позволяет изучить бежевые адипоциты, способствующие ремоделированию жировой ткани.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Раковая кахексия (КК) проявляется в виде синдрома с множественными проявлениями, вызывающего выраженный полиорганный метаболический дисбаланс. В последнее время было высказано предположение, что кахектическое истощение стимулируется несколькими медиаторами воспаления, что может нарушить интегративную физиологию жировых тканей и других тканей, таких как мозг и мышцы. В этом сценарии опухоль может выжить за счет хозяина. В недавних клинических исследованиях интенсивность истощения различных жировых отложений отрицательно коррелировала с исходом выживаемости пациента. Исследования также показали, что различные метаболические нарушения могут изменить ремоделирование белой жировой ткани (WAT), особенно на ранних стадиях развития кахексии. Дисфункция ВАТ, возникающая в результате ремоделирования тканей, является фактором общей кахексии, при этом основные модификации ВАТ состоят из морфофункциональных изменений, увеличения липолиза адипоцитов, накопления иммунных клеток, снижения адипогенеза, изменений в популяции клеток-предшественников и увеличения «ниш», содержащих бежевые/бритовые клетки.

Для изучения различных аспектов ремоделирования ВАТ, вызванного кахексией, в частности, изменений клеток-предшественников и бежевого ремоделирования, двумерная (2D) культура была первым вариантом для исследований in vitro. Однако этот подход не позволяет адекватно обобщить сложность WAT. Усовершенствованные анализы для реконструкции функционального AT ex vivo помогают понять физиологические взаимодействия между различными клеточными популяциями. Этот протокол описывает эффективную трехмерную (3D) печатную систему культивирования тканей на основе магнитных наночастиц. Протокол оптимизирован для исследования ремоделирования WAT, вызванного факторами, индуцированными кахексией (CIF). Результаты показывают, что 3D-культура является подходящим инструментом для изучения моделирования WAT ex vivo и может быть полезна для функционального скрининга для идентификации биоактивных молекул для применения отдельных популяций жировых клеток и помочь в открытии антикахектической терапии клеток на основе WAT.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живые организмы состоят из клеток в трехмерном микроокружении с межклеточным и клеточным матриксным взаимодействием и сложной динамикой транспортировки питательных веществ и клеток 1,2. Тем не менее, большая часть фундаментальных знаний, полученных в области клеточной биологии, была получена с помощью монослойной клеточной культуры (2D). Несмотря на то, что двумерная культура может ответить на некоторые механистические вопросы, этот подход неадекватно отражает естественную среду, в которой находятся клетки, и может быть несовместим с прогнозированием сложной реакции на лекарство. Более того, клетки ощущают свое физическое окружение посредством механотрансдукции. Действительно, механические силы преобразуются в биохимические сигналы, которые в конечном итоге влияют на паттерны экспрессии генов и судьбу клетки. В последние несколько десятилетий 3D-культура тканей стала новым инструментом in vitro, который может имитировать микроокружение in vivo с большей точностью. Это позволяет избежать некоторых механистических ловушек, порожденных подходами in vitro 2D3.

Раковая кахексия (КК) определяется как синдром с множественными проявлениями, вызывающий выраженный полиорганный метаболический дисбаланс. Во время развития кахексии WAT претерпевает многочисленные морфологические изменения, приводящие к увеличению липолиза адипоцитов, накоплению иммунных клеток, снижению адипогенеза, изменению популяции клеток-предшественников и увеличению «ниш», содержащих бежевые/бритовые клетки (бежевое ремоделирование)4. Тем не менее, повторение механизма, с помощью которого кахексия влияет на ремоделирование WAT с использованием моделей in vitro, представляет собой значительную техническую проблему. Действительно, в нескольких исследованиях, в которых предпринимались попытки изучить коммуникацию между опухолью и тканью, использовался монослой клеточной культуры in vitro (2D), обходя сложность трехмерного микроокружения WAT.

Несмотря на то, что существует несколько экспериментальных подходов к созданию 3D-культуры, для получения одипосфероидов предпочтительны три различных метода сборки: магнитная левитация или печать5, подвесная капля6 и системы матригель-скаффолда7. Несмотря на то, что эти системы подходят для адипосфероидов, они имеют преимущества и недостатки и должны выбираться в соответствии с характеристиками каждого экспериментального проекта. Исходя из упомянутых выше ограничений, для создания 3D-клеточных культур был использован метод магнитной печати5. В этом методе используется сборка магнитных наночастиц, состоящая из наночастиц золота и оксида железа, что делает метод печати подходящим для большинства типов клеток. Здесь 3D-культуры клеток использовались для индуцирования адипогенеза, а CIF — для воспроизведения условий окружающей среды CC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Инкубация 2D клеток с магнитными наночастицами

  1. Выращивайте адгезивные 2D-культуры до ~ 70% конфлюенции, используя стандартные процедуры культивирования клеток.
  2. Подготовьте сборку магнитных наночастиц. Достаньте его из холодильника и дайте ему нагреться до комнатной температуры (20-25 °C) в течение примерно 15 минут1.
  3. Смешанная среда: Добавьте магнитные наночастицы непосредственно в 12 мл среды в 100 мм клеточных культуральных планшетах. Суспендируйте и повторно суспендируйте среду несколько раз, чтобы получить однородное распределение наночастиц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда будет казаться темной из-за коричневого цвета оксида железа. Рекомендуется концентрация 2,5 мкл/см2 площади культивирования.
  4. Промойте 100 мм 2D культуральную пластину три раза фосфатно-соевым буфером (PBS).
  5. Добавьте 12 мл смешанной среды с шага 1.3 в 100 мм клеточные культуральные планшеты. Инкубируйте планшеты в течение ночи в инкубаторе (37 °C, 5%CO2), чтобы магнитные наночастицы могли прикрепиться к клеткам

2. Создание 3D культур со сборкой сфероидов в 96-луночных планшетах

  1. После ночной инкубации промойте клетки, чтобы удалить остатки среды и неприкрепленные магнитные наночастицы, осторожно перемешав планшеты с 3 x 10 мл PBS.
  2. Отсадите PBS из чашки Петри и отделите клетки путем инкубации с 0,25% раствором трипсин-этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 2-5 минут при 37 °C.
  3. Пока вы ждете, пока элементы отсоединятся, продезинфицируйте магнитные накопители 70%этанолом1.
  4. После того, как клетки отделятся, добавьте сыворотку, содержащую среду, в 4 раза превышающую объем раствора трипсина-ЭДТА, чтобы нейтрализовать действие трипсина, а затем перенесите суспензию в коническую пробирку.
  5. Центрифугируйте суспензию при 500 × г в течение 10 мин. Отсасывайте надосадочную жидкость, стараясь не задевать гранулы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования клетки должны казаться коричневыми, а клеточные суспензии в среде должны казаться темнее, чем обычно. Клетки должны казаться приправленными наночастицами1.
  6. Посчитайте клетки в суспензии и рассчитайте объем среды, необходимый для создания 3D-культур. Для лечения жировых сфероидов используйте от 5000 до 10000 клеток в 150 мкл в 96-луночных планшетах.
  7. Используя набор для биопечати на 96 лунок, поместите 96-луночную пластину, отталкивающую клетки, в верхнюю часть сфероидального привода.
  8. Нанесите пипеткой 150 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета и закройте пластину, чтобы позволить ячейкам агрегироваться на дне в форме магнита.
  9. Оставьте пластину на приводе сфероида в инкубаторе на 1-2 ч для получения грамотного сфероида.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти культуры должны казаться плотными и коричневыми и должны быть напечатаны на пластине (Рисунок S1). На рисунке S2 представлен краткий рабочий процесс основных этапов 3D-магнитной печати сфероидной сборки в 96-луночных пластинах.

3. Индукция адипогенеза по Уайту

  1. Подготовка обслуживающих и индукционных сред8; Подготавливайте индукционную среду перед каждым использованием.
    1. Готовят поддерживающую среду, содержащую 5 мкг/мл инсулина (запас 10 мг/мл при температуре 4 °С в течение одной недели) и 0,5 мкМ росиглитазона (запас 10 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО)).
    2. Готовят индукционную среду, содержащую 125 мкМ индометацин из 0,125 М в этаноле, 2 мкг/мл дексаметазона из 2 мг/мл в этаноле, 0,5 мМ изобутил-1-метилксантина (IBMX) из 0,25 М в ДМСО и 0,5 мкМ росиглитазона из 10 мМ в ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрейте индометацин до 60 °C для растворения.
  2. Через 24-48 часов после печати сфероидов замените обычный готовый носитель на индукционный носитель (день 0).
  3. Через 48 ч (день 2) замените индукционную среду на поддерживающую.
  4. Меняйте среду каждые 3-5 дней до полной дифференцировки клеток.
    Примечание: Как правило, после 7-8 дней стимуляции индукционной средой клетки дифференцируются в зрелые жировые клетки и заполняются масляными каплями, которые можно увидеть по краям жировых слоев.

4. Производство кондиционированной среды для лечения карциномы легкого Льюиса (LLC-CM)

  1. Семена клеток карциномы легкого Льюиса (LL/2) в 100 мм клеточных культуральных планшетах в питательной среде с плотностью 6000 клеток/см2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Питательная среда содержит модифицированную среду Дульбекко Eagle's Medium (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 100 ЕД/мл пенициллин-стрептомицина.
  2. Через 2 дня замените среду в каждой тарелке свежей средой для роста.
    Примечание: Клетки LL/2 содержат гетерогенную смесь адгезивных (большее число) и плавающих клеток.
  3. Через 2 дня (день 4) соберите кондиционированную среду и очистите ее от клеток и мусора центрифугированием (500 × г, 10 мин).
  4. Заморозьте аликвоты кондиционированной среды в жидком азоте для последующего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для лечения сфероидов кондиционированной средой используйте комбинацию 75% свежей питательной среды и 25% кондиционированной LLC-среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ожиросфероиды из 3D-культуры клеток стромально-васкулярной фракции (SVF)
Как 3D, так и конфлюентные 2D культуры были созданы с одинаковым количеством клеток SVF из одного и того же пахового препарата WAT мыши (рис. 1A, рис. 1B) и подвергнуты воздействию одного и того же экспериментального протокола для сравнения маркеров экспрессии генов. Сфероиды, стимулированные индукционной средой, со временем расширялись. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол создает 3D-систему клеточных культур для изучения дифференцировки адипоцитов у адипосфероидов, полученных из первичных клеток SVF из WAT. По сравнению с обычной 2D-акгезивной культурой, эта 3D-система облегчает ремоделирование AT, которое очень похоже на условия in vivo. В последние несколько лет исследования показали, что культивирование клеток в 3D дает отчетливую клеточную морфологию и передачу сигналов по сравнениюс системой 2D культивирования. М...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от NIH DK117161, DK117163 SRF и P30-DK-046200 для Жировой биологии и метаболизма питательных веществ Бостонского исследовательского центра питания и ожирения, а также грантами Исследовательского фонда Сан-Паулу (FAPESP): 2018/20905-1 и CNPq 311319/2018-1 MLBJr.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-изобутил-1-метилксантинSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)I-5879Набор для
биопечати 96-луночнойГрайнер (Монро, Северная Каролина, США)655841Клеточная культура
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-606-152Иммунофлуоресцентное окрашивание, вторичное, 1:400 при TBS с 0,1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 ЛУНКА, PS, F-BOTTOM µ ПРОЗРАЧНЫЙ, ЧЕРНЫЙ, CELLTAR, КЛЕТОЧНО-РЕПЕЛЛЕНТНАЯ ПОВЕРХНОСТЬ, КРЫШКА, СТЕРИЛЬНАЯ, 8 ШТ./BAGGreiner (Monroe, NC, США)655976Клеточная культура
DexamethasoneSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)D-1756Клеточная культура
DMEMCorning (Манассас, Вирджиния, США)10-017-CVКлеточная культура
Фетальная сыворотка бычьего скота (Tova)Gemini Bio (Западный Сакраменто, Калифорния)100-500Клеточная культура
ИндометацинSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)I-7378Клеточная культура
инсулинаSigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США)I0516Клеточная культура
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)Американская коллекция типовых культур (Манассас, Вирджиния, США)CRL-1642Клеточная линия Льюиса Карциномы
легких NanoShuttle-PLGreiner (Монро, Северная Каролина, США)657843Клеточная культура
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)ThermoFisher (Waltham, MA, США)R37606Иммунофлуоресцентное окрашивание в соответствии с инструкциями производителя
Pen strepCorning (Манассас, Вирджиния, США)30-002-CIКлеточная культура
Perilipin-1 (D1D8) XP  Технология передачи сигналов клеток mAb кролика(Данверс, Массачусетс, США)9349Иммунофлуоресцентное окрашивание, первичное, 1:1000 при TBS с 0,1% Tween-20
РосиглитазонСигма-Олдрич (Сент-Луис, Миссури, США)R-2408Культура клеток
Trypsin-EDTA, 0,05%Corning (Манассас, Вирджиния, США)25-052-CIКлеточная культура
Reverse-transcription PCR праймеры
PrimerForwardReverse
AdipoqGTTCCCAATGTACCCATTCGCTGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
em>Col4a1TCCAAGGGCGAAGTGGGTTTACCCTTGCTCGCCTTTGACT
em>Cyclophilin aATGGCACTGGCGGCAGGTCCTTGCCATTCCTGGACCCAAA<
em>Fabp4TGGTGACAAGCTGGTGGAATGTCCAGGCCTCTTTTGGCTCA
em>Fn1GCTTCCCCAACTGGTTACCCTGGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1aGAAAACAGGAACAGCAGCAGAGGGGGTCAGAGGAAGAGATAA<
em>Ucp1TCCTAGGGACCATCACCACCCAGCCGGGGCTGAGATTTTCC
strong>Mouse genotyping
Primer name<strong>DescriptionSequence
Cre FGeneric Cre forwardGCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre RGeneric Cre reverseGTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318mT/mG forwardCTC TGC TGC CTC CTG TCT TCT
oIMR7319mT/mG wild type reverseCGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320mT/mG мутантный обратныйTCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336UCP1 мутантный прямойCAA TCT GGG CTT AAC GGG TC
WH337UCP1 мутантный обратныйGTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338UCP1 дикий тип прямойGGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339UCP1 дикий тип обратныйGAT CTC CAG CTC CTC
клеточной культуры, черный <<<< C C

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haisler, W. L., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature Protocol. 8 (10), 1940-1949 (2013).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Eisenstein, M. Organoids: the body builders. Nature Methods. 15 (1), 19-22 (2018).
  4. Henriques, F., Júnior, M. L. B. Adipose tissue remodeling during cancer-associated cachexia: Translational features from adipose tissue dysfunction. Immunometabolism. 2 (4), 200032(2020).
  5. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Scientific Reports. 5 (1), 13987(2015).
  6. Akama, T., Leung, B. M., Labuz, J., Takayama, S., Chun, T. H. Designing 3-D adipospheres for quantitative metabolic study. Methods Molecular Biology. 1566, 177-183 (2017).
  7. Muller, S., et al. Human adipose stromal-vascular fraction self-organizes to form vascularized adipose tissue in 3D cultures. Scientific Reports. 9 (1), 7250(2019).
  8. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  9. Henriques, F., et al. Toll-like receptor-4 disruption suppresses adipose tissue remodeling and increases survival in cancer cachexia syndrome. Scientific Reports. 8 (1), 18024(2018).
  10. Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513 (7516), 100-104 (2014).
  11. Petruzzelli, M., et al. A switch from white to brown fat increases energy expenditure in cancer-associated cachexia. Cell Metabolism. 20 (3), 433-447 (2014).
  12. Lopes, M. A., Oliveira Franco, F., Henriques, F., Peres, S. B., Batista, M. L. LLC tumor cells-derivated factors reduces adipogenesis in co-culture system. Heliyon. 4 (7), 00708(2018).
  13. Wang, H., Liu, L., Lin, J. Z., Aprahamian, T. R., Farmer, S. R. Browning of white adipose tissue with roscovitine induces a distinct population of UCP1(+) adipocytes. Cell Metabolism. 24 (6), 835-847 (2016).
  14. Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biology. 13 (5), 264-269 (2003).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Fisher, M. F., Rao, S. S. Three-dimensional culture models to study drug resistance in breast cancer. Biotechnology Bioengineering. 117 (7), 2262-2278 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Brite
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи