Этот протокол направлен на децеллюляризацию сердца и легких мышей. Полученные каркасы внеклеточного матрикса (ECM) могут быть иммуноокрашены и визуализированы для отображения местоположения и топологии их компонентов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Децеллюляризация мышиного сердечно-легочного комплекса
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы представляем здесь протокол децеллюляризации сердца и легких мыши. Он создает структурные каркасы ECM, которые можно использовать для анализа топологии и состава ECM. Он основан на микрохирургической процедуре, предназначенной для катетеризации трахеи и аорты усыпленной мыши для перфузии сердца и легких децеллюляризирующими агентами. Децеллюляризованный сердечно-легочный комплекс впоследствии может быть иммуноокрашен, чтобы выявить расположение структурных белков ECM. Вся процедура может быть завершена за 4 дня.
Каркасы ECM, полученные в результате этого протокола, свободны от размерных искажений. Отсутствие ячеек позволяет проводить структурное исследование структур ECM вплоть до субмикронного разрешения в 3D. Этот протокол может быть применен к здоровым и больным тканям мышей в возрасте от 4 недель, включая мышиные модели фиброза и рака, открывая путь к определению ремоделирования ECM, связанного с сердечно-легочным заболеванием.
Введение
ECM представляет собой трехмерную сеть, состоящую из белков и гликанов, которая вмещает все клетки в многоклеточном организме, придавая органам их форму и регулируя поведение клеток на протяжении всей жизни1. Начиная с оплодотворения яйцеклеток, клетки строят и реконструируют ECM и, в свою очередь, строго контролируются им. Целью этого протокола является открытие способа анализа и картирования ECM мыши, поскольку мыши являются наиболее используемым модельным организмом в патофизиологии млекопитающих.
Развитие этого метода было обусловлено необходимостью охарактеризовать и изолировать связанный с метастазами нативный ECM2. Поскольку опухоли не имеют надлежащей анатомической васкуляризации, а мыши являются относительно небольшими организмами, микрохирургические процедуры были разработаны для ретроградной катетеризации аорты, при этом изолируя кровообращение основного сосуда, ведущего к опухоли (например, легочных вен), тем самым фокусируя поток реагентов и позволяя децеллюляризацию опухоли. Этот метод создает каркасы ECM с сохраненной структурой2, которые могут быть иммуноокрашены и визуализированы, что позволяет отображать структуру ECM в субмикронных деталях. Для выполнения этого протокола необходимо приобрести хирургические и микрохирургические навыки (рассечение, микрозащищение и катетеризация), которые могут представлять собой потенциальное ограничение его использования. Насколько нам известно, этот метод представляет собой современное состояние для анализа нативной структуры ECM2,3.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры, включенные здесь, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом, регулирующим экспериментальную медицину в Копенгагенском университете, и согласуются с датским и европейским законодательством. Чтобы продемонстрировать этот протокол, мы использовали самок мышей BALB / cJ в возрасте 8-12 недель и самку мыши MMTV-PyMT в возрасте 11 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращение бактериального загрязнения децеллюляризированного каркаса ECM дает наилучший результат визуализации и позволяет длительное хранение образцов. Поэтому важно, чтобы все ступени были стерильными. Таким образом, все инструменты и хирургические материалы, включая шов, микрошов, растворы, трубки, соединители Luer и катетеры, должны быть стерильными. Поверхности, включая полистирольный лоток, должны быть продезинфицированы 70% этанолом, а перфузию предпочтительно проводить под ламинарной проточной вытяжкой. Все процедуры проходят при комнатной температуре, если не указано иное.
1. Посмертная микрохирургия
- Усыплите мышь с помощью камеры CO2 .
- Поместите мышь в камеру объемом 4 л и начните заполнять 100% CO2, начиная с 0,2 л/мин в течение 2 мин, увеличивая до достижения потока 0,8 л/мин через 3 мин. Мышь должна упасть без сознания в течение первых 2 мин, а затем дыхание должно прекратиться (обычно около 5 мин, но поток может поддерживаться по мере необходимости). Подтвердите смерть, прежде чем переходить к следующему шагу.
- Побрить грудную клетку, брюшко и спину мыши машинкой для стрижки волос и продезинфицировать 70% этанолом. Бритье значительно уменьшает количество артефактов за счет наличия волос либо на образцах для визуализации, либо на биохимическом анализе.
- Прикрепите мышь к полистирольному лотку, вытянув ее передние и задние конечности, а также голову и хвост. Поместите его под микроскоп микрохирургии.
- С помощью ножниц с прямым рисунком Майо устанавливают хирургический доступ с кожным разрезом, идущим от подчелюстной области к нижней части живота и рассекают подкожно, чтобы обнажить грудную стенку и брюшину.
- С помощью микрохирургических ножниц разрезают большую грудную клетку и малую грудную мышцы вдоль шестого межреберного пространства по обеим сторонам грудной стенки.
- Используя ножницы с прямым рисунком, разрезайте грудину вдоль предыдущих разрезов, а затем завершите стернотомию, разрезав грудину вдоль ее длинной оси, затем поднимите и закрепите обе стороны грудной стенки, чтобы обнажить сердечно-легочный комплекс.
- Используя микрощипцы с круглым наконечником (или микрощипцы Дюмона), иссечь тимус и окружающую жировую ткань, деликатно стягивая их с прикреплений. Это позволит выявить основные суда.
- С помощью прижигания прижигают нисходящую полую вену и, используя ножницы с прямым рисунком, разрезают пищевод.
- Используя острые микрощипцы, отделяют брахиоцефальные вены от брахиоцефальных и брахиоцефальных, оставляют общие сонные и левые подключичные артерии от подлежащей ткани, чтобы облегчить перевязку и прижигание.
- Используя микроигольчатый держатель, острые микрощипцы и 9-0 швов, накладывающих швы над появлением брахиоцефальной, левой общей сонной и левой подключичной артерий.
- Прижигают брахиоцефальные вены.
- Отделите подчелюстные слюнные железы вдоль средней линии, чтобы обнажить мышцы шеи и трахею. Отделите мышцы, чтобы обнажить крикотиреоидную связку. С помощью микроножек откройте вход, разрезав связку.
- Введите катетер 27 г в трахею и деликатно надавите до тех пор, пока трахея не разветвится в бронхи (т. е. до тех пор, пока не будет достигнуто сопротивление катетеру, затем отступите на 3 мм). Будьте осторожны, чтобы не нарушить работу бронхов. Используя шов 6-0, наложите 3 шва вокруг трахеи, чтобы закрепить катетер.
- Сечение мыши на высоте 12-го грудного позвонка. Нисходящая аорта проходит спереди к позвоночнику и должна быть разделена здесь вместе с позвоночником. Раздвиньте нижнюю половину.
- Ретроградно катетеризирует аорту и толкает катетер до тех пор, пока он не достигнет дуги аорты. Используя 9-0 швов, наложите 4 шва вокруг аорты, начиная с 5 мм ниже кончика катетера.
2. Децеллюляризация
- Подключите мышь к насосной системе с помощью силиконовых трубок и разъемов Luer. Перфузируйте с деионизированной водой при 200 мкл/мин в течение 15 мин. Поддерживайте эту скорость потока во время децеллюляризации.
- Замените перфузионный агент на 0,5% дезоксихолат натрия (DOC), разведенный в деионизированной воде и перфьюированный на ночь.
- Изменить перфузионный агент на 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), разбавленного в деионизированной воде и перфузионировать в течение 8 часов.
- Настаивайте на деионизированной воде в течение ночи, чтобы смыть SDS и DOC в течение 24 ч.
- Резецировать децеллюляризированное сердце и легкие путем разрезания его прикреплений к грудной клетке с помощью изогнутых ножниц и хранить в стерильной криотрубке с деионизированной водой с 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином и 0,3 мкМ азида натрия при 4 °C. Каркасы ECM могут храниться не менее 12 недель1. Если каркас будет использоваться для биохимического анализа (например, масс-спектрометрии), заморозьте в жидком азоте.
3. Иммуноокрашивание
- Планируйте визуализацию: определите первичное антитело (или антитела) и комбинацию флуоресцентно конъюгированных вторичных антител, чтобы соответствовать друг другу и соответствовать лазерным линиям флуоресцентного микроскопа.
- Заблокируйте образец, погрузив его в криотрубу, содержащую 6% (v/v) ослиной сыворотки - 3% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA) на ночь.
- Инкубировать с первичными антителами (или антителами) в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 ч.
- Промывайте 5 раз в течение 1 ч каждый раз в 0,05% анимации 20 в PBS (PBST).
- Инкубируйте образец с флуоресцентно конъюгированным вторичным антителом (или антителами) в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 ч.
- Стирать 5 раз в течение 1 часа по 0,05% (PBST). Подождите 1 ч между каждой стиркой.
- Добавьте деионизированную воду и храните при температуре 4 °C вдали от прямого света. На этом этапе каркас готов к созданию изображения.
4. Визуализация
- Поместите образец в стеклянную посуду и увлажните его двумя каплями раствора для хранения (PBS или деионизированной водой).
- Подготовьте цель. Мы рекомендуем использовать объектив погружения в воду.
- Осмотрите образец с помощью флуоресцентного света.
- Переключитесь на управление компьютером. Включите лазеры и отрегулируйте интенсивность лазера, диафрагму точечных отверстий, длины волн детекторов, коэффициент усиления, разрешение и масштабирование. Задайте число и размер шага для z-стека и начните сбор. Мы рекомендуем использовать многофотонное лазерное возбуждение для увеличения проникновения в ткани и минимизации рассеяния света, отбеливания и повреждения тканей.
5. Окрашивание гематоксилин-эозином
- Иссечение 1 доли легкого у усыпленной мыши.
- Поместите в криомольд размером 10 мм x 10 мм x 5 мм и накройте его приблизительно 500 мкл соединения OCT.
- Заморозить на сухом льду (-70 °C) и поддерживать образец при этой температуре.
- Иссечение одной децеллюляризированной доли легкого из обработанной мыши в соответствии с шагом 2.5.
- Поместите в криомольд с наибольшей площадью поверхности вниз и покройте его соединением OCT, как указано на этапе 5.2.
- Заморозить на сухом льду (-70°C) и поддерживать образец при этой температуре до тех пор, пока не потребуется иное. Образец может храниться не менее 12 недель.
- Сечение замороженных тканевых блоков при -20 °C в криостате толщиной 5 мкм и размещение срезов на клейких стеклянных слайдах и хранение при -80 °C.
- Доведите горки до комнатной температуры до высыхания на воздухе (примерно 20 мин).
- Коротко погрузитесь в PBS и исправьте, погрузив слайды в 4% параформальдегид в PBS на 15 минут. Промыть один раз в PBS в течение 5 мин, затем дважды в дистиллированной воде в течение 5 мин.
- Погрузить в раствор гематоксилина Майера на 10 мин. Это время может быть оптимизировано в соответствии с источником ткани и подготовкой пятна.
- Промыть в банке Коплина под проточной дистиллированной водой в течение 10 мин.
- Погрузить в раствор эозина на 7 мин. Это время может быть оптимизировано в соответствии с источником ткани и подготовкой пятна.
- Окуните в 50% этанол, чтобы удалить избыток эозина и обезвоживаться путем кратковременного погружения в 70% этанола, а также в 96% и 100% этанола в течение 30 секунд. Обмакните в ксилол несколько раз.
- Нанесите несколько капель монтажного носителя DPX и поместите стеклянную крышку.
- Оставьте горки сушиться на ночь под химическим капотом.
- Сканирование слайдов в сканере слайдов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сердечно-легочная децеллюляризация
После успешного завершения протокола сердце и легкие, а также аннексированная ткань, такая как дуга аорты, будут свободны от клеток. Децеллюляризация может быть подтверждена окрашиванием гематоксилин-эозином (рисунок 1) каркасов ECM, показывающих удаление ядер по сравнению с нативной тканью. Эти каркасы сохраняют размеры свежих органов, а их нерастворимая структура ECM неповреждена2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методы децеллюляризации, основанные на тканевом перемешивании, изменяют структуру ECM, что делает их непригодными для анализа структуры ECM4. Перфузионная децеллюляризация с использованием анатомического пути, такого как аорта трахеи, позволяет достичь капиллярного русла или терминальных альвеол и облегчает доставку децеллюляризирующих агентов по всему органу. Сообщается об использовании цвиттерионических, анионных и неионных детергентов для децеллюляризации тканей4,5,6
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим профессора Ивану Новак и доктора Нинн Майн Кристенсен (Центр усовершенствованной биовизуализации (CAB), Копенгагенский университет) за предоставление доступа к микроскопу. Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN; AEM-G, OW, RR и JTE); стипендия PhD от Фонда Лундбека (R286-2018-621; МР); Шведский исследовательский совет (2017-03389; МЧР); Шведское онкологическое общество, Cancerfonden (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, и 190007; МЧР); Немецкая онкологическая помощь (Deutsche Krebshilfe; РР); и Датское онкологическое общество (R204-A12454; РР).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MICROSURGERY | |||
| 6-0 шовный материал, игла треугольного сечения (Vicryl) | Ethicon | 6301124 | |
| 9-0 микрошовный материал (Safil) | B щипцы Braun | G1048611 | |
| Adson | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Щипцы Адсона с зубцами | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Держатель микроигл Castroviejo | Fine Science Tools | No 12061-01 | |
| CO2 вентиляционная камера для эвтаназии мышей | |||
| Деионизированная вода (Milli-Q IQ 7000, система сверхчистой лабораторной воды) | Merck | ZIQ7000T0 | |
| Одноразовый лоток из полистирола (~30 & раз; 50 см) | |||
| Диссекционный микроскоп (Greenough, с двусторонней гусиной шеей) | Leica | S6 D | |
| Двусторонний микрошпатель | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Микрощипцы Dumont (два) | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Микрощипцы Dumont с 45° наконечники (два) | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Машинки для стрижки волос | Oster | 76998-320-051 | |
| Иглодержатель Halsey (с губками из карбида вольфрама) | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Катетер для внутривенного введения 24 калибра (Insyte) | BD | 381512 | |
| Катетер для внутривенного введения 26 калибра (Terumo) | Surflo-W | SR+DM2619WX | |
| Ножницы Майо (жесткий, прямой) | Инструменты Fine Science | 14110-15 | |
| Микрощипцы с кольцевыми кончиками (два) | Ножницы с микропружинами Aesculap | FM571R | |
| (ванны, изогнутые) | Инструменты для Fine Science | 15001-08 | |
| Миникуттер | KLS Martin | 80-008-03-04 | |
| Перистый периостом на линьке | Aesculap | D0543R | |
| Иглы (27 калибр; Microlance) | BD | 21018 | |
| Бумажное полотенце (стерильное) или хирургическая салфетка | |||
| Зубчатые ножницы (CeramaCut, прямые) | Шпатель Fine Science Tools | 14958-09 | |
| (Freer-Yasargil) | Шприцы Aesculap | OL166R | |
| (1 мл; Plastipak) | BD | 3021001 | |
| шприцы (10 мл; Plastipak) | BD | 3021110 | |
| сухожильные ножницы (Walton) | Fine Science Tools | 14077-09 | |
| IMMUNOSTAINING | |||
| Alexa Fluor 488 ослик против морской свинки IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Alexa Fluor 594 осел против кролика IgG | Life Technologies | A11037 | |
| БСА(альбумин бычьей фракции V, стандартного сорта, лиофилизированный) | Serva | 11930.03 | |
| Коллаген IV поликлональное антитело (RRID: AB_2276457) | Millipore | AB756P | Хозяин: кролик |
| PBS (pH 7,4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | Хозяин: |
| поликлональное антитело козы Periostin (добрый подарок от Мануэля Коха. RRID:AB2801621) | Хозяин: морская свинка | ||
| Скальпель одноразовый с лезвием No11 (шт. 10) | VWR | 233-5364) | |
| Сыворотка (обычная ослиная сыворотка) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| strong>IMAGING | |||
| Детекторы (гибридные детекторы (модели Leica, HyD S) и фотоумножители (ФЭУ); | Leica | ||
| Флуоресцентный источник света | Leica | EL6000 | |
| Микроскоп (инвертированный многофотонный микроскоп) | Leica | SP5-X MP | |
| Объектив (лямбда-синий, 20×, числовая апертура 0,70 (NA) IMM UV) | Leica | HCX PL APO | |
| Двухфотонный Ti– сапфировый лазер (Spectra-physics, модель Mai Tai DeepSee) | |||
| Лазер белого света (WLL) | Leica | ||
| DECELLULARIZATION | |||
| 70% этанола (абсолютный спирт 99,9%); абсолютный спирт должен быть доведен до 70% (об/об.) с помощью деионизированной воды. | Слива | 1680766 | |
| деионизированная вода (Milli-Q IQ 7000, система сверхчистой лабораторной воды) | Фитинги Merck | ZIQ7000T0 | |
| с наружной резьбой Люэра (1/8 дюйма) | World Precision Instruments | 13158-100 | |
| PBS (pH 7,4, 10×, Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140122 | |
| Перистальтический насос (с 12 каналами) | Ole Dich | 110AC(R)20G75 | |
| Силиконовая трубка (с внутренним диаметром 2 мм и наружным диаметром 4 мм) | Ole Dich | 31399 | |
| Азид натрия | Sigma-Aldrich | 08591-1ML-F | |
| Дезоксихолат натрия (DOC) | Sigma-Aldrich | D6750-100G | |
| Додецилсульфат натрия | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| H& E ОКРАШИВАНИЕ | |||
| 4% PFA | Fisher Scientific | 15434389 | |
| 96% этанол | Слива | 201446-5L | |
| Абсолютный этанол | Слива | 201152-1L | |
| Покровные стекла (24x50мм; 1000 шт) | Hounisen | 422.245 | |
| Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 мм; 100 шт) | Tissue-Tek | 4566 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| DPX монтажный материал | Hounisen | 1001.0025 | |
| Eosin Y раствор спиртовой 0,5% | Sigma | 1024390500 | |
| Feather микротомное лезвие нержавеющая сталь, C35 (50 шт) | Pfm медицинский | 207500003 | |
Fisherbrand Superfrost Plus слайды (25 x 75 мм; 144 шт) | Thermofisher | ||
| Mayers гематоксилин | Sigma | MHS32-1L | |
| OCT compound | VWR | 361603E | |
| Сканер слайдов (Nanozoomer) | Hamamatsu Photonics | ||
| Xylene | Sigma | 534056-4L |
Ссылки
- Hynes, R. O. Extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix. Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).
- White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., et al. Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
- Wershof, E., et al. A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix. BioRxiv. , (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
