Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение стойлового кровотока у улитки мыши с использованием открытого сосудистого окна и прижизненной флуоресцентной микроскопии

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61857

⸱

21 сентября 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Department of Otolaryngology/Head & Neck Surgery, Oregon Health & Science University

В этой статье

Краткое содержание

Подход с открытым окном сосудов с использованием флуоресцентных индикаторов обеспечивает достаточное разрешение для измерения кохлеарного кровотока (CoBF). Метод облегчает изучение структурно-функциональных изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях.

Аннотация

Трансдукция звука метаболически требовательна, и нормальная функция микроциркуляторного русла в боковой стенке имеет решающее значение для поддержания эндокохлеарного потенциала, транспорта ионов и баланса жидкости. Сообщается, что различные формы нарушений слуха связаны с аномальной микроциркуляцией в улитке. Исследование того, как патология кохлеарного кровотока (CoBF) влияет на функцию слуха, является сложной задачей из-за отсутствия осуществимых методов опроса и трудностей с доступом к внутреннему уху. Открытое сосудистое окно в боковой кохлеарной стенке в сочетании с флуоресцентной прижизненной микроскопией использовалось для изучения изменений CoBF in vivo, но в основном у морских свинок и только недавно у мыши. В этой статье и связанном с ней видео описывается метод визуализации кровотока в улитке мыши. Детали включают 1) приготовление флуоресцентно меченой суспензии клеток крови от мышей; 2) строительство открытого сосуда-окна для прижизненной микроскопии у анестезируемой мыши и 3) измерение скорости и объема кровотока с помощью автономной записи изображения. Метод представлен в видеоформате, чтобы показать, как использовать подход с открытым окном у мышей для исследования структурных и функциональных изменений в кохлеарной микроциркуляции в нормальных и патологических условиях.

Введение

Нормальная функция микроциркуляции в боковой кохлеарной стенке (включающей большинство капилляров в спиральной связке и stria vascularis) критически важна для поддержания слуховой функции1. Аномальный CoBF участвует в патофизиологии многих заболеваний внутреннего уха, включая потерю слуха, вызванную шумом, ушную водянку и пресбикусис 2,3,4,5,6,7,8,9. Визуализация прижизненного CoBF позволит лучше понять связи между функцией слуха и кохлеарной сосудистой патологией.

Хотя сложность и расположение улитки в височной кости исключает прямую визуализацию и измерение CoBF, для оценки CoBF были разработаны различные методы, включая лазерно-допплеровскую флоуметрию (LDF)10,11,12, магнитно-резонансную томографию (МРТ)13, флуоресцентную прижизненную микроскопию (FIVM)14, флуоресцентную микроэндоскопию (FME)15, эндоскопическую лазерную спекл-контрастную визуализацию (LSCI)16 , и подходы, основанные на введении меченых маркеров и радиоактивно меченых микросфер в кровоток (оптическая микроангиография, OMAG)17,18,19,20. Однако ни один из этих методов не позволяет в режиме реального времени отслеживать изменения в CoBF in vivo, за исключением FIVM. FIVM, в сочетании с сосудом-окном в боковой кохлеарной стенке, является подходом, который был использован и проверен на морской свинке в различных экспериментальных условиях различными лабораториями 14,21,22.

Был успешно разработан метод FIVM для изучения структурно-функциональных изменений кохлеарной микроциркуляции у мышей с использованием флуоресцеина изотиоцианата (FITC)-декстрана в качестве контрастного вещества и флуоресцентного красителя - либо DiO (3, 3'-диоктацилоксакарбоцианин перхлорат, зеленый) или Dil (1,1-диоктадецил-3,3,3,3-тетраметилиндокарбоциан перхлорат, красный) - для предварительной маркировки клеток крови, визуализации сосудов и отслеживания скорости кровотока. В настоящем исследовании протокол этого метода был описан для визуализации и количественной оценки изменений CoBF у мышей при нормальных и патологических состояниях (например, после воздействия шума). Этот метод дает исследователю инструменты, необходимые для изучения основных механизмов CoBF, связанных с дисфункцией слуха и патологией в стриях васкулярных мышц, особенно при применении в сочетании с легкодоступными трансгенными моделями мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Это операция, не связанная с выживанием. Все процедуры, связанные с использованием животных, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Орегонском университете здравоохранения и науки (номер одобрения IACUC: TR01_IP00000968).

1. Получение флуоресцентных меченых клеток крови

  1. Обезболить мышей-доноров (самцов мышей C57BL/6J в возрасте ~6 недель) внутрибрюшинной (т..) инъекцией раствора анестетика кетамина/ксилазина (5 мл/кг, см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол анестезии очень надежен и поддерживает системное кровяное давление.
  2. Уложите мышь на спину, откройте кожу и обнажите грудную полость с помощью пинцета и рассекающих ножниц. Разрежьте диафрагму, захватите у основания грудины ножницами-зажимами, прорежьте грудную клетку и поднимите, чтобы обнажить сердце. Собрать 1 мл крови в гепарине (15 МЕ/мл крови) путем пункции сердца и центрифугу при 3000 × г в течение 3 мин при 4 °C. Усыпить мышь при вывихе шейки матки после забора крови.
  3. Удалить плазму, промыть гранулу клеток крови 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и центрифугу 3x при 3000 × г в течение 3 мин при 4 °C.
  4. Маркируют клетки крови 1 мл 20 мМ DiO или Dil в PBS и инкубируют в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре23,24.
  5. Центрифугируют и промывают меченые клетки крови 1 мл PBS, центрифугу 3x при 3000 × г в течение 3 мин при 4 °C и повторно суспендируют клеточную гранулу в 30% гематокрите с ~0,9 мл PBS (конечный объем ~1,3 мл) перед инъекцией.

2. Операция по созданию открытого окна 25

  1. Подготовьте стерильные хирургические инструменты и платформу для визуализации и поместите грелку под драпировку (рисунок 1A). Обезболивают мышей (самцов мышей C57BL/6J в возрасте ~ 6 недель), как описано в шаге 1.1, и проверяют глубину анестезии, контролируя рефлекс лапы и общий мышечный тонус. Поместите животное на теплую грелку и поддерживайте ректальную температуру на уровне 37 °C.
  2. Поместите хвост животного в систему мониторинга CODATM для мониторинга артериального давления и сердцебиения (см. Таблицу материалов). Запишите систолическое артериальное давление животного, диастолическое артериальное давление и среднее кровяное давление (MBP) в анестезированном состоянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не наблюдается различий в MBP животных в обезболенном и неанестезированном состоянии (107 ± 11 мм рт.ст. против 97 ± 7 мм рт.ст.). Частота сердечных сокращений животных стабильна при анестезии, хотя и ниже (все еще в пределах нормального диапазона), чем в безанестезном состоянии (357 ± 12 бмп против 709 ± 3 бмп). Следует ожидать незначительного увеличения сердцебиения у животных, помещенных в удерживающее устройство26.
  3. Откройте левую барабанную перепонку с помощью бокового и вентрального подхода под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов), оставив барабанную перепонку и косточки нетронутыми21.
    1. Сделайте разрез вдоль средней линии шеи животного с обездвиженной головой и положением, чтобы свести к минимуму движение (рисунок 1B). Удаляют левую подчелюстную железу и задний живот дигастральной мышцы и прижигают.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подкожно вводят бупренорфин в дозе 0,05 мг/кг для уменьшения боли во время операции.
    2. Найдите и обнажите костную буллу, идентифицируя грудино-ключично-сосцевидную мышцу и лицевой нерв, простирающийся спереди к булле.
    3. Откройте костную буллу иглой 30 G и осторожно удалите окружающую кость хирургическим пинцетом, чтобы обеспечить четкое представление о улитке и стапедиальной артерии, с ее медиальным краем, лежащим над краем круглой оконной ниши, и курсирующим передним-верхним к овальному окну (рисунок 1C, D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трахеотомия выполняется, чтобы держать дыхательные пути беспрепятственными и должна выполняться только тогда, когда у животного есть проблемы с дыханием во время операции. В целом, большинство животных под наркозом имеют гладкое дыхание. Однако, если животные получили трахеотомию во время операции, зарегистрированный кровоток не следует использовать для какого-либо сравнения.
  4. Используйте небольшое лезвие ножа (специально фрезерованный скальпель No 16), чтобы соскоблить кость боковой стенки на вершинно-среднем повороте улитки мыши, примерно в 1,25 мм от вершины, пока не треснет тонкое пятно. Удалите костные стружки с помощью небольших проволочных крючков (рисунок 1E).
  5. Накройте сосуд-окно разрезанным чехлом для сохранения нормальных физиологических условий и обеспечения оптического обзора для записи изображений сосудов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться с осторожностью. В дополнение к мониторингу температуры тела, жизненно важные показатели животного, включая кровяное давление и сердцебиение, также должны контролироваться на протяжении всей операции.

3. Визуализация CoBF под FIVM

  1. Сделайте разрез ~1 см вдоль правой подкожной вены, чтобы обнажить сосуд (рисунок 1F).
  2. Вливать 100 мкл раствора FITC-декстрана (2000 кДа, 40 мг/мл в PBS) и 100 мкл суспензии клеток крови (30% гематокрит) последовательно в животное через подкожную вену (рисунок 1G), чтобы обеспечить визуализацию кровеносных сосудов и отслеживание скорости кровотока.
  3. Наблюдайте за кровотоком в режиме реального времени непосредственно на видеомониторе через 5 мин после инъекции. Изобразите кровеносные сосуды с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного объективом с большим рабочим расстоянием (W.D.) (W.D. 30,5 мм, 10x, числовая апертура 0,26) и корпусом лампы, содержащим многополосный фильтр возбуждения и совместимый эмиссионный фильтр (Таблица материалов). Записывайте видео с помощью цифровой черно-белой камеры с зарядовой связью высокого разрешения (Таблица материалов) со скоростью 2 кадра/с). Получайте более 350 изображений на видео, чтобы обеспечить успешный анализ скорости потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кровеносные сосуды как спиральной связки, так и сосудистой полосы могут быть визуализированы путем настройки оптического фокуса (Дополнительное видео 1).

4. Анализ видео

  1. Измерьте диаметр сосуда с помощью соответствующего программного обеспечения (Таблица материалов) и определите расстояние между двумя фиксированными точками по всему сосуду на полученных изображениях.
  2. Рассчитайте скорость кровотока из захваченных видеокадров, отслеживая движение меченых клеток крови на пространственном расстоянии между местами изображения27.
    1. Откройте видео кровотока в программном обеспечении (в этом протоколе использовался Fiji [ImageJ] и установите масштаб изображений.
    2. Отслеживайте выбранные DiO-окрашенные клетки крови с помощью функции отслеживания. Используйте расстояние, пройденное ячейками, и интервал времени между кадрами изображения в видео для автоматического расчета скорости потока.
  3. Рассчитайте объемный поток (F) по следующему уравнению: F = V × A. (V: скорость; A: площадь поперечного сечения судна).

5. Воздействие шума

  1. Поместите животных в клетки из проволочной сетки. Подвергайте их широкополосному шуму при уровне звукового давления 120 дБ в кабине звуковой экспозиции в течение 3 ч и еще 3 ч на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот режим воздействия шума, обычно используемый в этой лаборатории, приводит к постоянной потере кохлеарной чувствительности28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После хирургического воздействия кохлеарных капилляров в боковой стенке (рисунок 1) прижизненное флуоресцентное микроскопическое наблюдение за dil-мечеными клетками крови в меченых FITC-декстраном сосудах было возможно через открытое сосудистое окно. Рисунок 2А представляет собой репрезентативное изображение, сделанное под FIVM, на котором показаны капилляры кохлеарной вершинно-средней боковой стенки мыши. Светимость этих сосудов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе показано, как капилляры в кохлеарной боковой стенке (и в stria vascularis) мышиной модели могут быть визуализированы с помощью флуорофорной маркировки в препарате с открытым сосудом-окном в системе FIVM. Мышиная модель широко используется и предпочтительна в качестве модели млекопитающих для исследования здоровья и болезней человека. Протокол, описанный здесь, является осуществимым подходом для визуализации и исследования CoBF в боковой стенке мыши (особенно в stria vascularis) с использованием открытого ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано NIH / NIDCD R21 DC016157 (X.Shi), NIH / NIDCD R01 DC015781 (X.Shi), NIH / NIDCD R01-DC010844 (X.Shi) и Фондом медицинских исследований из Орегонского университета здоровья и науки (OHSU) (X.Shi).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% натрия хлоридаHospiraNDC 0409-1966-020,6 мл (на 1 мл)
1,1′-Диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианина перхлоратSigma Aldrich46849520&микро; M
3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateSigma AldrichD429220; M
CODA Monitor системаKent scientificCODA Monitor, для контроля артериального давления и сердцебиения
CoverslipFisher Scientific12-542A
Регулятор температуры постоянного токаFHC40-90-8D
Fiji/ImageJNIHИзмерение диаметра сосуда
FITC-декстран (2000 кДа)Sigma AldrichFD2000s40 мг/мл
Гепарин натрия для инъекций, USP MDVMylanNDC 67457-374-125000 USP единиц/мл
Кататезия (100 мг/мл)Henry Schein NDC11695-0702-10,2 мл (для 1 мл)
Микроскоп ОбъективMitutoyo378-823-5Модель: M Plan Apo NIR 10x
ORCA-ER КамераHamamatsuМодель: C4742-80-12AG
PBSGibco2085387
Ксизаин (100 мг/мл, в 5 раз разбавленный для использования)LloydLPFL048210,2 мл (для 1 мл)
Стереомикроскоп ZoomOlympusМодель: SZ61, флуоресцентный микроскоп

Ссылки

  1. Shi, X. Physiopathology of the cochlear microcirculation. Hearing Research. 282 (1), 10-24 (2011).
  2. Brown, J. N., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Age-related changes in cochlear vascular conductance in mice. Hearing Research. 86 (1), 189-194 (1995).
  3. Gratton, M. A., Schmiedt, R. A., Schulte, B. A. Age-related decreases in endocochlear potential are associated with vascular abnormalities in the stria vascularis [corrected and republished article originallly printed in Hearing Research. Hearing Research. 94 (1-2), 181-190 (1996).
  4. Le Prell, C. G., Yamashita, D., Minami, S. B., Yamasoba, T., Miller, J. M. Mechanisms of noise-induced hearing loss indicate multiple methods of prevention. Hearing Research. 226 (1-2), 22-43 (2007).
  5. Miller, J., Ren, T. -Y., Laurikainen, E., Golding-Wood, D., Nuttall, A. Hydrops-induced changes in cochlear blood flow. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 104 (6), 476-483 (1995).
  6. Miller, J. M., Ren, T. -Y., Nuttall, A. L. Studies of inner ear blood flow in animals and human beings. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 112 (1), 101-113 (1995).
  7. Nakashima, T., et al. Disorders of cochlear blood flow. Brain Research Reviews. 43 (1), 17-28 (2003).
  8. Nuttall, A. L. Sound-induced cochlear ischemia/hypoxia as a mechanism of hearing loss. Noise and Health. 2 (5), 17(1999).
  9. Trune, D. R., Nguyen-Huynh, A. Vascular pathophysiology in hearing disorders. Seminars in Hearing. , Thieme Medical Publishers. 242-250 (2012).
  10. Nakashima, T., Hattori, T., Sone, M., Sato, E., Tominaga, M. Blood flow measurements in the ears of patients receiving cochlear implants. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 111 (11), 998-1001 (2002).
  11. Ren, T., Brechtelsbauer, P. B., Miller, J. M., Nuttall, A. L. Cochlear blood flow measured by averaged laser Doppler flowmetry (ALDF). Hearing Research. 77 (1-2), 200-206 (1994).
  12. Goodwin, P. C., Miller, J. M., Dengerink, H. A., Wright, J. W., Axelsson, A. The laser Doppler: a non-invasive measure of cochlear blood flow. Acta Otolaryngologica. 98 (5-6), 403-412 (1984).
  13. Le Floc'h, J., et al. Markers of cochlear inflammation using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 39 (1), 150-161 (2014).
  14. Axelsson, A., Nuttall, A. L., Miller, J. M. Observations of cochlear microcirculation using intravital microscopy. Acta Otolaryngologica. 109 (3-4), 263-270 (1990).
  15. Monfared, A., et al. In vivo imaging of mammalian cochlear blood flow using fluorescence microendoscopy. Otology & Neurotology. 27 (2), 144(2006).
  16. Kong, T. H., Yu, S., Jung, B., Choi, J. S., Seo, Y. J. Monitoring blood-flow in the mouse cochlea using an endoscopic laser speckle contrast imaging system. PLoS One. 13 (2), 0191978(2018).
  17. Angelborg, C., Hillerdal, M., Hultcrantz, E., Larsen, H. The microsphere method for studies of inner ear blood flow. ORL. 50 (6), 355-362 (1988).
  18. Choudhury, N., Chen, F., Shi, X., Nuttall, A. L., Wang, R. K. Volumetric imaging of blood flow within cochlea in gerbil in vivo. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 524-529 (2010).
  19. Subhash, H. M., et al. Volumetric in vivo imaging of microvascular perfusion within the intact cochlea in mice using ultra-high sensitive optical microangiography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (2), 224-230 (2011).
  20. Reif, R., et al. Monitoring hypoxia induced changes in cochlear blood flow and hemoglobin concentration using a combined dual-wavelength laser speckle contrast imaging and Doppler optical microangiography system. PLoS One. 7 (12), 52041(2012).
  21. Nuttall, A. L. Techniques for the observation and measurement of red blood cell velocity in vessels of the guinea pig cochlea. Hearing Research. 27 (2), 111-119 (1987).
  22. Nuttall, A. L. Cochlear blood flow: measurement techniques. American Journal of Otolaryngology. 9 (6), 291-301 (1988).
  23. Hanna, G., et al. Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American Journal of Physiology. Lung Cellular Molecular Physiology. 304 (2), 86-91 (2013).
  24. Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. Journal of Visualized Experiments. (147), e59803(2019).
  25. Shi, X., et al. Thin and open vessel windows for intra-vital fluorescence imaging of murine cochlear blood flow. Hearing Research. 313, 38-46 (2014).
  26. Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 282 (6), 1565-1582 (2002).
  27. Dai, M., Shi, X. Fibro-vascular coupling in the control of cochlear blood flow. PloS One. 6 (6), 20652(2011).
  28. Shi, X. Cochlear pericyte responses to acoustic trauma and the involvement of hypoxia-inducible factor-1alpha and vascular endothelial growth factor. American Journal of Pathology. 174 (5), 1692-1704 (2009).
  29. Hou, Z., et al. Platelet-derived growth factor subunit B signaling promotes pericyte migration in response to loud sound in the cochlear stria vascularis. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 19 (4), 363-379 (2018).
  30. Hultcrantz, E., Nuttall, A. L. Effect of hemodilution on cochlear blood flow measured by laser-Doppler flowmetry. American Journal of Otolaryngology. 8 (1), 16-22 (1987).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FITCDiO DiL
Измерение стойлового кровотока у улитки мыши с использованием открытого сосудистого окна и прижизненной флуоресцентной микроскопии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.