Оценка перепрограммирования сердца с помощью высокосодержательного визуализационного анализа

Summary

Мы представляем протокол для количественной оценки непосредственно перепрограммированных индуцированных кардиомиоцитоподобных клеток (iCMs) in vitro с использованием анализа изображений с высоким содержанием. Этот метод позволяет количественно оценить эффективность перепрограммирования сердца в автоматическом режиме и непосредственно визуализировать iCM.

Abstract

Целью данного протокола является описание метода количественного определения индуцированных кардиомиоцитарных подобных клеток (iCMs), которые напрямую перепрограммируются in vitro с помощью метода перепрограммирования. Перепрограммирование сердца обеспечивает стратегию для генерации новых кардиомиоцитов. Путем введения в фибробласты основных кардиогенных факторов транскрипции; Фибробласты могут быть преобразованы в iCM без перехода через состояние плюрипотентных стволовых клеток. Тем не менее, скорость преобразования фибробластов в iCM все еще остается низкой. Соответственно, существует множество дополнительных подходов к повышению эффективности перепрограммирования сердца. В большинстве этих исследований оценивалась эффективность перепрограммирования сердца с помощью проточной цитометрии, в то же время проводилась иммуноцитохимия для визуализации iCM. Таким образом, для демонстрации успешности перепрограммирования iCM требуется как минимум два отдельных набора экспериментов по перепрограммированию. В отличие от этого, автоматизированный анализ изображений с высоким содержанием обеспечит как количественную оценку, так и квалификацию перепрограммирования iCM с относительно небольшим числом ячеек. С помощью этого метода можно напрямую оценить количество и качество iCM с помощью одного эксперимента по перепрограммированию. Этот подход сможет облегчить будущие исследования по перепрограммированию сердца, которые требуют крупномасштабных экспериментов по перепрограммированию, таких как скрининг генетических или фармакологических факторов для повышения эффективности перепрограммирования. Кроме того, применение протокола визуализационного анализа с высоким содержанием не ограничивается перепрограммированием сердца. Он может быть применен для перепрограммирования других клеточных линий, а также для любых экспериментов по иммуноокрашиванию, которые требуют как количественной оценки, так и визуализации иммуноокрашенных клеток.

Introduction

Перепрограммирование сердца было разработано в качестве альтернативного подхода к опосредованным стволовыми клетками подходам к генерации новых кардиомиоцитов. Учитывая, что он не переходит из одного состояния в состояние стволовых клеток, он обладает высоким потенциалом для обхода некоторых наследственных ограничений в подходах, опосредованных стволовыми клетками. Показано, что вирусная инфекция по меньшей мере трех или четырех кардиогенных факторов транскрипции в фибробласты может преобразовывать фибробласты в сторону сердечной судьбы путем элиминации генных программ фибробластов и восстановления кардиогенных транскрипционных сетей ....

Protocol

Все процедуры на животных были проведены с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в Медицинском центре Университета Вандербильта.

1. Генерация ретровируса и перепрограммирование сердца in vitro

1. Культивирование клеток платины Е в DMEM с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина, 1 мкг/мл пуромицина и 10 мкг/мл бластицидина до тех пор, пока слияние платиновых клеток Е не достигнет 70%–80%.
2. В 1-й день высейте ~0,55 x 10⁶ клеток (первая лунка) и ~0,18 x 10⁶ клеток (вторая лунка) в две отдельные лунки 12-луночного планшета с 1 мл DMEM с доб....

Results

После экспериментов по перепрограммированию мы количественно определили iCM с помощью анализа изображений с высоким содержанием контента, как описано выше. Составные изображения 36 участков визуализации, которые были использованы для анализа изображений с высоким содержанием изображения, показаны на рисунке 1. В этих экспериментах iCM определяются как двойные положительные клетки (α-актинин ⁺ титин-eGFP⁺). Анализ изображений с высоким содержанием показывает, что ~26% кл.......

Discussion

В предыдущих исследованиях по перепрограммированию оценивалась эффективность перепрограммирования с помощью проточной цитометрии и было продемонстрировано структурное качество iCMs с использованием иммуноцитохимии в двух отдельных экспериментах. Анализ проточной цитометрии требует гораздо большего количества исходных клеток, что увеличивает масштаб экспериментов. В отличие от этого, анализ изображений с высоким содержанием может оценить как качество, так и количество перепрограммирования.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01	Tocris	2939
анти-курица Alexa 488	Thermofisher	A11039
анти-GFP антитело	Invitrogen	A10262
анти-мышь Alexa 555	Thermofisher	A21422
анти-&альфа;-актининовое антитело	Sigma	A7811
DAPI раствор	Vector labs	H1200
Fugene 6	Promega	E2691
Инсулин-трансферрин-селен G добавка	Invitrogen	41400-045
Medium 199	Invitrogen	11150059
MEM витаминный раствор	Invitrogen	11120-052
MetaXpress программное обеспечение	Молекулярное устройство
Micro XL автоматизированная система визуализации клеток	Молекулярный прибор
Минимальный раствор незаменимых аминокислот	Sigma	M7145
Opti-MEM	Gibco	31905-070
PES фильтр (0,45 &; m)	Thomas scientific	1159T84
Platninum E cells	Biolabs	RV-101
Полибрен	Sigma	H9268
SB431542	Sigma	S4317
Универсальный блокирующий буфер	BiogeneX	HK083-50K