Мы представляем модель in vitro для оценки обонятельной энглии (OEG) нейрорегенеративной способности, после нервной травмы. Он основан на кокультуре аксотомизированных взрослых нейронов ганглия сетчатки (RGN) на монослойных OEG и последующем изучении аксональной регенерации, путем анализа RGN аксональных и соматодендритических маркеров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Кокультура аксотомизированных Крысиных Нейронов Сетчатки Ganglion с обонятельной Энситинг Глиа, как в пробирке Модель регенерации взрослых аксональных
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Обонятельные клетки оболочки глии (OEG) локализованы на всем пути от обонятельной слизистой оболочки до обонятельного нервного слоя (ONL) обонятельной луковицы. На протяжении всей взрослой жизни, они являются ключевыми для аксонального выращивания вновь созданных обонятельных нейронов, от ламины проприии в ONL. Из-за их про-регенеративных свойств, эти клетки были использованы для содействия аксональной регенерации в спинном мозге или оптических моделей травмы нерва.
Мы представляем модель in vitro для анализа и измерения нейрорегенеративной способности OEG после повреждения нервной системы. В этой модели, обратимо увековечены человека OEG (ihOEG) культурируется как монослой, сетчатки извлекаются из взрослых крыс и сетчатки ганглия нейронов (RGN) являются совместной культурой на OEG монослой. После 96 ч, аксональные и соматодендритические маркеры в RGNs анализируются иммунофлюоресценции и количество RGNs с аксоном и средняя длина аксональной / нейрон количественно.
Этот протокол имеет преимущество перед другими анализами in vitro, которые полагаются на эмбриональные или постнатальные нейроны, что он оценивает нейрорегенеративные свойства OEG во взрослой ткани. Кроме того, он не только полезен для оценки нейрорегенеративного потенциала ihOEG, но может быть распространен на различные источники OEG или других глиальных клеток.
Введение
Взрослые нейроны центральной нервной системы (ЦНС) имеют ограниченную регенеративную способность после травмы или заболевания. Общей стратегией для содействия регенерации ЦНС является трансплантация, в месте травмы, типов клеток, которые вызывают аксональный рост,такиекак стволовые клетки, клетки Шванн, астроциты или обонятельные оболочки клеток глии (OEG) 1,2,3,4,5.
OEG происходит от нервного гребня6 и находится в обонятельной слизистой оболочке ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты на животных были одобрены национальными и институциональными комитетами по биоэтике.
1. ihOEG (Ts12 и Ts14) культура
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в стерильных условиях в шкафу биобезопасности культуры тканей.
- Подготовка 50 мл ME10 OEG культуры среды, как это предусмотрено в таблице 1.
- Приготовьте 5 мл DMEM/F12-FBS, как это предусмотрено в таблице 1,в конической трубке 15 мл.
- Разогреть оба средства при 37 градусов по Цельсию в чистой водяной бане, в течение 15 мин.
- Оттепель Ts12 и Ts14 клетки флаконы при 37 г....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе мы представляем модель in vitro для анализа нейрорегенеративной способности OEG после повреждения нейронов. Как показано на рисунке 1, источник OEG является обратимым увековечены человека OEG клональной клеточной линии -Ts14 и Ts12-, которая происходит от основных культур, подготовленных из обонятельных луковиц, полученных в вскрытие15,17,18. Ткань сетчатки извлекается из взрослых к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
OEG трансплантации в ЦНС травмы сайтов считается перспективным терапии травмы ЦНС из-за его составных про-нейрорегенеративныхсвойств 7,8,9. Однако, в зависимости от источника ткани – обонятельной слизистой оболочки (OM-OEG) по сравнению с обонятельной лампой (OB-OEG) – или возрастом донора, значительные различиясуществуют в такой емкости 26,31,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была финансово поддержана проектом SAF2017-82736-C2-1-R от Ministerio de Ciencia e Innovaci'n до MTM-F и Фондом Франсиско де Витория до JS.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| антитело 514 | Ссылка 34 | Кролик поликлональный антисыворотка, который распознает MAP2A и B. | |
| антитело SMI-31 | BioLegend | 801601 | Моноклональное антитело против белков MAP1B и NF-H |
| против мышей Alexa Fluor 488 антитело | ThermoFisher | A-21202 | |
| против кролика Alexa Fluor 594 антитело | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Добавка | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-амино-5-фосфоналеровая кислота | Sigma | 283967 | Ингибитор NMDA-рецептора |
| DAPI | Sigma | D9542 | Ядра флуоресцентного окрашивания |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Среда для культивирования клеток |
| FBS | Gibco | 11573397 | Фетальная бычья сыворотка |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Фетальная бычья сыворотка |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Монтажный материал |
| ImageJ | Национальный институт здравоохранения (NIH-США) | Программное обеспечение для обработки изображений | |
| L-глутамин | Lonza | BE17-605F | |
| Нейробазальная среда | Gibco | 21103049 | Питательная среда для нейрональных клеток |
| Система диссоциации папаина | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Для использования в изоляции нейронных клеток |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Пенициллин/стрептомицин/амфотерицин B | Lonza | 17-745E | Бактериостатический и бактерицидный |
| экстракт гипофиза | Gibco | 13028014 | экстракт гипофиза крупного рогатого скота |
| Poly-L-лизин (PLL) | Sigma | A-003-M |
Ссылки
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
