Методическая статья

Процедуры трансплантации костного мозга у мышей для изучения клонального кроветворения

DOI:

10.3791/61875

⸱

26 мая 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описаны три метода трансплантации костного мозга (ТКМ): ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с экранированной облучающей и метод ТКМ без предварительного кондиционирования (адютивная ТКМ) для изучения клонального кроветворения на мышиных моделях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клональный кроветворение является распространенным возрастным состоянием, которое является результатом накопления соматических мутаций в гемопоэтических стволовых и прогениторных клетках (HSPC). Мутации в генах-драйверах, которые придают клеточную пригодность, могут привести к развитию расширяющихся клонов HSPC, которые все чаще приводят к появлению лейкоцитов потомства, скрывающих соматическую мутацию. Поскольку клональное кроветворение было связано с сердечными заболеваниями, инсультом и смертностью, разработка экспериментальных систем, моделируемых эти процессы, является ключом к пониманию механизмов, лежащих в основе этого нового фактора риска. Процедуры трансплантации костного мозга, включающие миелоаблативное кондиционирование у мышей, такие как облучение всего тела (ЧМТ), обычно используются для изучения роли иммунных клеток в сердечно-сосудистых заболеваниях. Тем не менее, одновременное повреждение ниши костного мозга и других интересных мест, таких как сердце и мозг, неизбежно при этих процедурах. Таким образом, наша лаборатория разработала два альтернативных метода, чтобы свести к минимуму или избежать возможных побочных эффектов, вызванных ЧМТ: 1) трансплантация костного мозга с экранированием облучения и 2) приемная ТКМ неусловным мышам. В экранированных органах сохраняется местная среда, позволяющая проводить анализ клонального кроветворения, в то время как функция резидентных иммунных клеток невозмутима. Напротив, приемная ТКМ для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, за которое сохраняются как местные среды органов, так и кроветворная ниша. Здесь мы сравним три различных подхода к восстановлению кроветворных клеток и обсудим их сильные и слабые стороны для исследований клонального кроветворения при сердечно-сосудистых заболеваниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клональное кроветворение (CH) - это состояние, которое часто наблюдается у пожилых людей и возникает в результате расширенного клона гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC), несущего генетическую мутацию1. Было высказано предположение, что к 50 годам большинство людей приобретут в среднем пять экзонических мутаций в каждом HSPC2,но большинство из этих мутаций приведут к небольшим фенотипическим последствиям для человека или вообще не приведут к ним. Однако, если случайно одна из этих мутаций дает конкурентное преимущество HSPC, например, способствуя его распространению, самообновлению, выживанию или некоторой комбинации из них, это может привести к предпочтительному расширению мутантного клона по сравнению с другими HSPC. В результате мутация будет все больше распространяться через кроветворную систему, поскольку мутированный HSPC дает начало зрелым клеткам крови, что приводит к отчетливой популяции мутировавших клеток в периферической крови. В то время как мутации в десятках различных генов-драйверов-кандидатов были связаны с клональными событиями в кроветворной системе, среди них мутации в ДНК-метилтрансферазе 3 альфа(DNMT3A)и десяти одиннадцати транслокации 2(TET2)являются наиболее распространенными3. Несколько эпидемиологических исследований показали, что лица, которые несут эти генетические мутации, имеют значительно более высокий риск сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), инсульта и всей причинной смертности3,4,5,6,7. Хотя эти исследования выявили, что существует связь между СН и повышенной частотой сердечно-сосудистых заболеваний и инсульта, мы не знаем, является ли эта связь причинно-следственной или общей эпифеноменом с процессом старения. Чтобы лучше понять эту ассоциацию, требуются надлежащие животные модели, которые правильно резюмируют состояние СН человека.

Несколько моделей животных CH были установлены нашей группой и другими с использованием рыбок данио, мышей и нечеловеческих приматов8,9,10, 11,12,13,14. Эти модели часто используют методы восстановления кроветворения путем трансплантации генетически модифицированных клеток, иногда с использованием рекомбинации Cre-lox или системы CRISPR. Этот подход позволяет проанализировать специфическую мутацию гена в кроветворных клетках, чтобы оценить, как она способствует развитию заболевания. Кроме того, эти модели часто используют конгенные или репортерные клетки, чтобы отличить эффекты мутантных клеток от нормальных или диких клеток. Во многих случаях требуется режим предварительного кондиционирования для успешного приживирования донорских гемопоэтических стволовых клеток.

В настоящее время трансплантацию костного мозга мышам-реципиенцистам можно разделить на две основные категории: 1) миелоаблативное кондиционирование и 2) неусловная трансплантация. Миелоаблативное кондиционирование может быть достигнуто одним из двух методов, а именно, общим облучением тела (ЧМТ) или химиотерапией15. ЧМТ проводят путем подвергания реципиента смертельной дозе гамма- или рентгеновского облучения, генерирующего разрывы ДНК или поперечные связи внутри быстро делящихся клеток, делая их непоправимыми16. Бусульфан и циклофосфамид являются двумя широко используемыми химиотерапевтическими препаратами, которые нарушают кроветворную нишу и аналогичным образом вызывают повреждение ДНК быстро делящихся клеток. Конечным результатом миелоаблативного прекондиционирования является апоптоз кроветворных клеток, который разрушает кроветворную систему реципиента. Эта стратегия не только позволяет успешно приживить донорские HSPC, но также может предотвратить отторжение трансплантата путем подавления иммунной системы реципиента. Тем не менее, миелоаблативная прекондиционирование имеет серьезные побочные эффекты, такие как повреждение тканей и органов и их резидентных иммунных клеток, а также разрушение родной ниши костного мозга17. Поэтому были предложены альтернативные методы преодоления этих нежелательных побочных эффектов, особенно в отношении повреждения органов, представляющих интерес. Эти методы включают экранированное облучение мышей-реципиентов и приемную ТКМ для неусловленных мышей9,17. Защита грудной клетки, брюшной полости, головы или других областей от облучения путем размещения свинцовых барьеров защищает интересующие ткани от повреждающего воздействия облучения и поддерживает их резидентную популяцию иммунных клеток. С другой стороны, приемная ТКМ HSPC для неусловленных мышей имеет дополнительное преимущество, поскольку она сохраняет нативную кроветворную нишу. В этой рукописи мы описываем протоколы и результаты приживления HSPC после нескольких схем трансплантации у мышей, в частности доставки HSPC мышам ЧМТ, мышам, частично защищенным от облучения, и неусловным мышам. Общая цель состоит в том, чтобы помочь исследователям понять различные физиологические эффекты каждого метода, а также то, как они влияют на экспериментальные результаты в условиях СН и сердечно-сосудистых заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Вирджинии.

1. Перед предварительным кондиционированием

  1. Поместите мышей-реципиентов на воду, дополненную антибиотиками (5 мМ сульфаметоксазола, 0,86 мМ триметоприма) ~ 24 ч до облучения. Это необходимо для предотвращения инфекции, так как иммунная система будет подавлена после облучения и поддерживаться в течение 2 недель после облучения. На этом этапе дополняйте мышей питательным / гидратационным гелем, чтобы стимулировать кормление и предотвратить потерю веса и обезвоживание после облучения.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Изображения, показывающие различные настройки предварительной подготовки. (A)Установка облучения всего тела с использованием гамма-излучения (цезий-137): пучок излучения исходит от задней части облучателя в направлении оси Y (горизонтальное излучение). (B) Установка облучения всего тела в клетке мыши с помощью рентгеновского излучения: клетка мыши помещается в отражающую камеру. Пучок излучения исходит от верхней части облучателя в форме конуса (вертикальное излучение). Расстояние от источника излучения до клетки составляет 530 мм. (C) Регулируемый лоток в рентгеновском облучателье: Эта установка используется для частично экранированного облучения с использованием рентгеновского излучения. Пучок излучения исходит от верхней части облучателя в форме конуса (вертикальное излучение). Расстояние от источника излучения до лотка составляет 373 мм, а радиус 250 мм.(D)Защита грудной клетки: Обезболивающих мышей помещают на лоток. Мышей помещают перевернутыми друг к другу в лежачих положениях с полностью вытянутыми руками и ногами. Нижний конец свинцового щита выровнен с костью xiphisternum, а верхний конец с тимусом. (E) Абдоминальная защита: Анестезированные мыши помещаются как в защитную грудную клетку установку с нижним концом свинцового щита, выровненным с анусом, и верхним концом под диафрагмой. (F)Установка облучения головы с использованием гамма-излучения (цезий-137): носовые лапы анестезированной мыши заклеиваются, а мышь помещается в конический ограничитель. Черный свинцовый щит (обозначенный) закрывает голову и уши мыши. Пучок излучения исходит от задней части облучателя в направлении оси Y (горизонтальное излучение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Предварительная подготовка мышей-реципиентов (необязательно)

  1. Облучение всего тела
    1. Поместите мышей-реципиентов в равномерно нарезанную клетку или клетку для мыши в отражательную камеру в пределах расчетного радиуса для получения той же дозы облучения; однако для обеспечения равномерного облучения рекомендуется максимум 8 мышей на клетку и 5 мышей на клетку для мышей(рисунок 1A,B).
    2. Чтобы достичь полной миелоабляции, убедитесь, что мыши-реципиенты получают общую дозу облучения 11 Гр в двух фракциях по 5,5 Гр, разделенных интервалом 4–24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как оптимальное приживение может быть получено путем реализации 4-х ч интервала между фракциями, он может быть продлен до 24-х ч интервала, что может быть полезно, когда труд и / или облучатель недоступны.
  2. Частично экранированное облучение
    1. Обезболивание мышей-реципиентов путем внутрибрюшинной инъекции кетамина (80–100 мг/кг) и ксилазина (5–10 мг/кг). Ограничение движения мыши имеет решающее значение для обеспечения равномерного облучения и эффективной защиты органов-мишеней во время процесса экранирования.
    2. Для экранирования грудной клетки и брюшной полости ориентируйте пучок излучения рентгеновского облучателя вертикально на мышь(рисунок 1С).
      1. Поместите обезболенные мыши на плоскую пластину, центрируя источник излучения сверху. Поместите перевернутых друг к другу мышей в лежачем положении с полностью вытянутыми руками и ногами(рисунок 1D,E).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рентгеновский облучатель для этого эксперимента позволяет двум мышам одновременно расположиться в пределах эффективного радиуса, что обеспечивает равномерное облучение. В то время как эффективный радиус рассчитывается на основе расстояния между источником излучения и лотком, количество животных, которые могут быть одновременно облучены, будет зависеть от конкретного облучателя.
      2. Закрепите лапы мышей на пластине с помощью ленты, чтобы обеспечить иммобилизацию мышей во время процедуры облучения. Поместите свинцовое экранирование так, чтобы оно покрывала области, требующие защиты.
      3. Для экранирования грудной клетки подготовьте свинцовый щит, измерив длину от кифистерновой кости мыши до тимуса и рассчитав толщину, которая обеспечит достаточную защиту от источника облучения. Поместите свинцовое экранирование так, чтобы нижний конец выровнявался с костью xiphisternum. Верхний конец свинцового барьера будет помещаться рядом с тимусом(рисунок 1D).
      4. Для экранирования брюшной полости подготовьте свинцовый щит, измерив длину от ануса мыши до диафрагмы и рассчитав толщину, которая обеспечит достаточную защиту от источника облучения. Поместите свинцовое экранирование так, чтобы нижний конец выровнял с анусом. Верхний конец свинцового щита будет помещаться ниже диафрагмы(рисунок 1E).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Локализация свинцового щита для согласованности между когортами может уменьшить некоторые различия в отношении размера мышей.
    3. Для экранирования головы ориентируйте пучок излучения облучателя цезия горизонтально на мышь.
      1. Осторожно приклейте цевья обезболенной мыши к брюшку. Это гарантирует, что руки получают полную дозу облучения и не покрываются щитом.
      2. Для защиты головы поместите мышь в конический ограничителю, который помещается внутри свинцового щита. Как только мышь находится внутри конического ограничителя, вставьте ограничителя в слот внутри свинцового щита(рисунок 1F). Свинцовый щит должен полностью закрывать голову и уши мыши (~ 3,2 см), оставляя остальную часть тела мыши открытой для облучения. Положение ограничителя внутри щита можно отрегулировать, чтобы он соответствовал животным разных размеров, сдвинув его дальше внутри или снаружи щита.
      3. Поместите мышей внутрь облучателя, перпендикулярно источнику облучения.
    4. Подвергайте мышей воздействию двух фракций облучения по 5,5 Гр (общая доза 11 Гр), разделенных интервалом 4–24 ч.
    5. После каждой фракции облучения поместите клетки с анестезированными мышами на нагретые маты или под красные тепловые лампы, чтобы предотвратить переохлаждение и помочь в восстановлении после анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы не перегревать обезболенную мышь при использовании лампы, так как они не могут избежать нагрева. Как описано выше, позиционирование животных и толщина свинцового щита могут различаться между исследованиями, основанными на специфических особенностях облучателя (тип излучения/направление пучка и т.д.). Исследователям необходимо будет соответствующим образом скорректировать свои эксперименты.

3. Изоляция костей

ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале мыши-доноры и мыши-реципиенты должны быть похожи по возрасту и в возрасте от 8 до 12 недель. Использование по меньшей мере 3 мышей в качестве доноров (а не одного донора) предпочтительно для минимизации гетерогенности (даже при использовании мышей с одинаковым генотипом). Приблизительно 40 миллионов нефракционированных клеток костного мозга можно получить из шести костей (двух бедренных костей, двух большеберцовой костей и двух плечевых костей) одной мыши. Трансплантация 5 миллионов клеток костного мозга каждой мыши-реципиенту обычно обеспечивает приживление.

  1. Усыплите мышей-доноров путем вывиха шейки матки без анестезии (предпочтительный метод, чтобы избежать химического загрязнения клеток) и поместите каждую мышь на абсорбивную прокладку.
  2. Дезинфицируйте кожу с помощью 70% этанолового спрея.
  3. Сделайте небольшой поперечный разрез в коже ниже грудной клетки и крепко держите кожу по обе стороны разреза, разрывая в противоположных направлениях к голове и ногам. Отклеивание кожи со всех конечностей.
  4. Разрезайте плечи и локтевые суставы и удалите прикрепленные мышцы и соединительные ткани с помощью Кимвипа, чтобы получить плечевую кость.
  5. Осторожно вывихивают тазобедренные суставы между бедренной и тазобедренной костями. Используйте тупые ножницы, чтобы разрезать вдоль головки бедренной кости и отсоедать ноги. Разрезайте коленный сустав, чтобы отделить бедренную и большеберцовую кости, и осторожно удалите прикрепленные мышцы и соединительные ткани с помощью Kimwipe, чтобы собрать бедренную и большеберцовую кости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите особое внимание на то, чтобы сохранить эпифиз кости нетронутым во время этого этапа. Отбросьте все сломанные кости из-за потери стерильности. Тазобедренные кости и кости позвоночника могут быть собраны в дополнение к бедренной кости, голени и плечевой кости. Для сбора костей позвоночника можно использовать ступку и пестик, чтобы раздавить кости на куски и собрать клетки костного мозга.
  6. Поместите выделенные кости мышей того же генотипа в коническую трубку размером 50 мл, содержащую 20 мл ледяного стерильного PBS, и держите его на льду до дальнейшего использования. Обратите особое внимание, чтобы правильно поместить кости в трубки с соответствующими генотипами.
  7. Повторите описанные выше шаги для каждого животного-донора, меняющего перчатки между каждой мышью. Кроме того, очистите ножницы и другие инструменты с 70% этанолом между каждой мышью.

4. Выделение клеток костного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в шкафу класса биобезопасности II.

  1. Подготовка наборов трубок: Сделайте небольшое отверстие в нижней части стерильной микроцентрифужной трубки 0,5 мл с помощью иглы 18 Г и поместите ее в стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 мл, которая содержит 100 мкл ледяного стерильного PBS на дне.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку только шесть костей могут поместиться в трубку микроцентрифуги объемом 0,5 мл, рекомендуется подготовить достаточное количество наборов трубок для обработки всех костей одновременно.
  2. Аспирируйте PBS и перенесите изолированные кости на стерильную чашку для культивации клеток 100 мм. Удерживая каждую кость с помощью тонких щипцов, аккуратно отрежьте эпифизы с каждого конца с помощью небольших ножниц, которые были стерилизованы в автоклаве. Поместите разрезанные кости в подготовленные наборы трубок.
  3. Центрифугировать трубки при 10 000 х г в течение 35 с при 4 °C.
  4. После центрифугирования подтвердите, что костный мозг был успешно удален из костей. Кости должны казаться белыми и полупрозрачными с относительно большой красной гранулой на дне трубки микроцентрифуги 1,5 мл. Отбросьте микроцентрифужную трубку 0,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если визуальный осмотр не позволяет обнаружить костный мозг в нижней части трубки 1,5 мл, снова отрежьте кость и повторите шаг 4.3.
  5. Повторно суспендировать костный мозг в 1 мл ледяного PBS, затем перенести клеточную суспензию из того же генотипа в соответствующую коническую трубку 50 мл.
  6. Диссоциируют клетки, пропуская их через иглу 18 Г со шприцем 10 мл 10 раз.
  7. Фильтруйте одноклеточные суспензии через сетчатый фильтр 70 мкм. Добавьте дополнительный ледяной PBS к конечному объему 10 мл и повторно суспендировать клетки с помощью мягкого использования пипетки.
  8. Центрифуга при 310 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  9. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу 10 мл безсыворочной rpmI среды. Запасной 30 мкл этого материала для подсчета клеток.
  10. Определите концентрацию клеток с помощью счетчика клеток и рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для трансплантации. Для примера 100% ТКМ для каждой мыши-реципиента требуется5 x 10 6 клеток костного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для конкурентоспособной ТКМ подготовьте в общей сложности5 х 10 6 клеток костного мозга, включающих смесь донорских клеток (например, CD45.2+) и клеток конкурентов (например, CD45.1+). Настоятельно рекомендуется подготовка дополнительных клеток костного мозга. Например, если в экспериментальной группе 10 мышей-реципиентов, мы обычно готовим достаточное количество клеток для 12 мышей-реципиентов.
  11. Перенесите расчетный объем клеточной суспензии в новую коническую трубку объемом 50 мл. Центрифуга при 310 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  12. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки, используя рассчитанное количество безсыворочной rpmI среды для достижения соответствующей плотности и объема клеток. Как правило, 200 мкл является оптимальным объемом для ретроорбитальной инъекции.

5. Трансплантация клеток костного мозга облученным мышам

  1. Обезболить мышей-реципиентов 5% изофлураном.
  2. Пока мышей анестезируют, медленно вводят 200 мкл клеток костного мозга в ретроорбитальную вену, используя иглу 28-30 Г с инсулиновым шприцем.
    1. Альтернативно, выполняют доставку донорских клеток путем внутривенной инъекции в хвостовую вену и интрамедуллярной инъекции бедренной кости с максимальным объемом 0,2 мл и 25 мкл соответственно.
  3. Как только клетки будут введены, поместите каплю глазных капель, содержащих пропаракаин, на поверхность глаза для облегчения боли. Затем животному можно позволить прийти в сознание.

6. Трансплантация клеток костного мозга неусловным мышам

  1. Обезболивают мышей-реципиентов путем вдыхания 5% изофлурана.
  2. Вводят 5 x 106 нефракционированных клеток костного мозга из ретро-орбитального генотипа необлученным мышам-реципиенциям с помощью инсулинового шприца 28-30 г.
  3. Повторите шаги 6.1 и 6.2 в течение 3 последовательных дней, так что мышам-реципиентам будет пересажено в общей сложности 1,5 х10 7 клеток костного мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку приемная ТКМ без процедуры предварительного кондиционирования требует трансплантации костного мозга в течение 3 дней подряд, следует попытаться чередовать глаза для каждой инъекции.
  4. После инъекции ввести каплю пропаракаин-содержащих глазных капель пораженный глаз.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы сравнить влияние трех методов ТКМ/предварительного кондиционирования на приживение донорских клеток, фракции донорских клеток в периферической крови и сердечной ткани были проанализированы методом проточной цитометрии через 1 месяц после ТКМ. Изолированные клетки окрашивали для специфических маркеров лейкоцитов для идентификации различных подмножеств лейкоцитов. В этих экспериментах донорские клетки костного мозга дикого типа(WT) C57BL/6 (CD45.2) доставлялись в WT B6. SJL-Ptprca<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для исследований клонального кроветворения мы описали три метода ТКМ: ТКМ с облучением всего тела, ТКМ с облучением с частичным экранированием и менее часто используемый метод ТКМ, который не включает предварительное кондиционирование (адмтивное ТКМ). Эти методы были использованы для оценки влияния клонального кроветворения на сердечно-сосудистые заболевания. Исследователи могут модифицировать эти методы соответствующим образом в соответствии с конкретной целью своего исследования.

Мод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США К. Уолшу (HL131006, HL138014 и HL132564), С. Сано (HL152174), грантом Американской кардиологической ассоциации М. А. Эвансу (20POST35210098) и грантом Японского фонда сердца Х. Огава.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифуга 0,5 млFisher Scientific05-408-121общая поставка
1,5 мл микроцентрифугаFisher Scientific05-408-129общая поставка
1/2 мл LO-DOSE ИНСУЛИН ШПРИЦEXELINT26028общая поставка
Абсолютный этанол (200 шт)Химическая 200559 Fisher Химическаяобщая поставка
BD 1 мл Туберкулин Шприцы 25G 5/8 дюймовая иглаBecton Dickinson309626общей поставки
BD PrecisionGlide Needle 18G (1,22 мм X 25 мм)Becton Dickinson395195общей поставки
Облучатель цезия-137J. L. Shepherd Mark IVоборудование
DietGel 76AClear H2O70-01-5022общая поставка
Falcon 100 мм TC-обработанная чашка для клеточных культур LifeSciences353003общая поставка
Falcon 50 мл конические центрифужные пробиркиFisher Scientific352098общая поставка
Fisherbrand стерильные клеточные фильтры, 70 μ mFisher Scientific22363548общий запас
Graefe ЩипцыFine Science Tools11051-10общий запас
Закаленные тонкие ножницыFine Science Tools14090-09общий запас
Изотезия (изофлуран) растворHenry Schein29404Раствор
кетаминаZoetis043-304инъекция
Салфетки Kimwipes Delicate Task WipersKimtech ScienceKCC34155общего назначения
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Solution
RadDisk – Облучатель грызунов ДискBraintree ScientificIRD-P Mобщий запас
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093Medium
Сульфаметоксазол и триметопримTEVA0703-9526-01инъекция
КсилазинAkorn139-236инъекция
рентгеновский облучательРад источникRS-2000оборудование

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tet2

Похожие статьи