Характеристика и функциональное прогнозирование бактерий в тканях яичников

Краткое содержание

Иммуногистохимическое окрашивание и секвенирование гена рибосомальной РНК 16S (ген 16S рРНК) были выполнены с целью обнаружения и различения бактерий в раковых и нераковых тканях яичников in situ. Композиционные и функциональные различия бактерий были предсказаны с помощью BugBase и филогенетического исследования сообществ путем реконструкции ненаблюдаемых состояний (PICRUSt).

Аннотация

Теория «стерильного» женского верхнего репродуктивного тракта сталкивается с растущей оппозицией из-за достижений в обнаружении бактерий. Однако, содержат ли яичники бактерии, пока не подтверждено. Здесь был проведен эксперимент по обнаружению бактерий в тканях яичников. Мы выбрали пациентов с раком яичников в группе рака и нераковых пациентов в контрольной группе. Секвенирование гена 16S рРНК использовалось для дифференциации бактерий в тканях яичников от онкологической и контрольной групп. Кроме того, мы предсказали функциональный состав идентифицированных бактерий с помощью BugBase и PICRUSt. Этот метод также может быть использован в других внутренних органах и тканях, поскольку в последние годы было доказано, что многие органы содержат бактерии. Присутствие бактерий во внутренних путях и тканях может помочь ученым оценить раковые и нормальные ткани и может помочь в лечении рака.

Введение

В последнее время публикуется все большее количество статей, доказывающих существование бактерий в брюшных твердых внутренних путях, таких как почки, селезенка, печень,^{яичник 1,2.} Geller et al. обнаружили бактерии в опухолях поджелудочной железы, и эти бактерии были устойчивы к гемцитабину, химиотерапевтическому препарату^2. S. Manfredo Vieira et al. пришли к выводу, что Enterococcus gallinarum переносится в лимфатические узлы, печень и селезенку, и он может управлять аутоиммунитетом^3.

Поскольку шейка матки играет роль защитника, бактерии в верхнем женском репродуктивном тракте, который содержит матку, фаллопиевы трубы и яичники, были минимально исследованы. Тем не менее, в последние годы были созданы некоторые новые теории. Бактерии могут иметь доступ к полости матки во время менструального цикла из-за изменений в муцинах^4,5. Кроме того, Zervomanolakis et al. подтвердили, что матка вместе с фаллопиевыми трубами представляет собой перистальтический насос, контролируемый эндокринной системой яичников, и это расположение позволяет бактериям проникать в эндометрий, фаллопиевы трубы и яичники^6.

Верхний репродуктивный тракт больше не является загадкой благодаря развитию методов обнаружения бактерий. Verstraelen et al. использовали метод штрих-кодированного парного секвенирования для обнаружения матчных бактерий путем нацеливания на гипервариабельную область V1-2 гена 16S РНК^7. Fang et al. использовали штрих-кодирование секвенирования у пациенток с полипами эндометрия и выявили наличие разнообразных внутриматочных бактерий^8. Кроме того, используя ген РНК 16S, Miles et al. и Chen et al. обнаружили бактерии в половой системе женщин, перенесших сальпингоофорэктомию и гистерэктомию соответственно^5,9.

Бактерии в опухолевых тканях получили все большее внимание в последние годы. Banerjee et al. обнаружили, что сигнатура микробиома различается между пациентами с раком яичников и контрольной^10. Noxynatronum sibiricum был связан со стадией опухоли, а Methanosarcina vacuolata может быть использована для диагностики рака яичников^11. В дополнение краку яичников, было доказано, что другие виды рака, такие как рак желудка, легких, предстательной железы, молочной железы, шейки матки и эндометрия, связаны с бактериями^{12,13,14, 15,16,17,18.} Poore et al. предложили новый класс онкологической диагностики на основе микробов, предвидя скрининг рака на ранней стадии^19. В этом протоколе мы исследовали различия между раковыми и нормальными тканями яичников, сравнивая состав и функцию бактерий в этих двух тканях.

Иммуногистохимическое окрашивание и секвенирование гена 16S рРНК были выполнены для подтверждения присутствия бактерий в яичниках. Изучены различия и прогнозируемые функции бактерий яичников в раковых и нераковых тканях яичников. Результаты показали существование бактерий в тканях яичников. Anoxynatronum sibiricum и Methanosarcina vacuolata были связаны со стадией и диагнозом рака яичников соответственно. Сравнивалось сорок шесть значительно отличавшихся путей KEGG, которые присутствовали в обеих группах.

Протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по медицинской институциональной этике Первой аффилированной больницы Сианьского университета Цзяотун (No. XJTUIAF2018LSK-139). Информированное согласие было получено от всех зарегистрированных пациентов.

1. Критерии вхождения в онкологические группы и контрольную группу

1. В группу рака входят пациенты, у которых в первую очередь диагностирован рак яичников, а после лапаротомии доказано, что у них серозный рак яичников патологическими находками.
2. Для контрольной группы впишите пациенток, у которых в первую очередь диагностирована миома матки или аденомиоз матки, без какого-либо состояния яичников, и которые перенесли гистерэктомию и сальпингоофорэктомию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий стандарт не является определенным. Также могут быть зачислены пациентки с заболеваниями, не затрагивающими яичники, которые подвергаются гистерэктомии и сальпингоофорэктомии.
3. Исключить пациентов с одним или несколькими из следующих критериев:
   Беременные или кормящей грудью женщины.
   Прием антибиотиков за 2 месяца до операции.
   Наличие лихорадки или повышенных воспалительных маркеров.
   Наличие воспаления любого рода.
   Пройдя неоадъювантную химиотерапию.

2. Соберите образцы

1. Во время операции поместите резецированные яичники в стерильную трубку и поместите трубку в жидкий азот для транспортировки. Избегайте прикосновений к чему-либо еще на протяжении всей процедуры.
2. Разделите яичники на образцы тканей толщиной около 1 см с помощью пары новых стерильных пинцетов под ламинарной проточной тумбами. После разделения сохраняют образцы при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры сбора образцов являются асептическими, включая отделение яичников.

3. Секвенирует ген 16S рРНК

1. Экстракт ДНК.
   1. Добавьте 1,2 мл ингибированного EX-буфера в 2 мл центрифужную трубку. Затем добавьте в пробирку 180-220 мг образцов. Дайте образцу полностью перемешаться (водяная баня 70 °C в течение 5 мин, а затем вихрь в течение 15 с).
   2. Центрифугировать трубку в течение 1 мин при 600 х г.
   3. Поместите 550 мкл супернатанта в новую трубку 1,5 мл и центрифугу на 1 мин при 600 х г.
   4. Перенесите 400 мкл супернатанта с 30 мкл протеиназы К в другую пробирку с 1,5 мл.
   5. Добавьте 400 мкл буферного AL и используйте вихревой смеситель в течение 15 с.
   6. Инкубировать при 70 °C в течение 10 мин.
   7. Добавьте 400 мкл 96-100% спирта. Используйте вихревой смеситель в течение 15 с.
   8. Переложить 600 мкл смеси в абсорбционную колонну и центрифугу в течение 1 мин при 13700 г. Поменять нижнюю трубку. Повторите этот шаг 11 раз.
   9. Добавьте 500 мкл буфера AW1, центрифугу в течение 1 мин при 13 700 х г и замените нижнюю трубку.
   10. Добавьте 500 мкл буфера AW2, центрифугу в течение 3 мин при 13 700 х г и замените нижнюю трубку.
   11. Центрифуга в течение 3 мин при 13 700 х г.
   12. Переложить смесь в новую пробирку 1,5 мл, добавить 200 мкл буферной АТЕ, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин и центрифугу в течение 1 мин при 13 700 х г.
2. Тестирование качества. Используйте 1% электрофорез сефарозного геля для проверки качества. Добавьте 400 нг образца, 120 В, 30 мин. Идеальный результат: концентрация ДНК: ≥ 10 нг/мкл, чистота ДНК: A260/A280 = 1,8-2,0, валовая ДНК: ≥ 300 нг.
3. Подготовьте библиотеки с помощью комплекта метагеномного секвенирования 16S в соответствии с протоколом производителя.
   1. Выполните ПЦР. Вкратце, каждая 25-мкл ПЦР-реакция содержит 12,5 нг образца ДНК в качестве входного сигнала, 12,5 мкл 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix и 5 мкл каждого праймера при 1 мкМ.
   2. Проводят ПЦР по следующему протоколу: начальная ступень денатурации, выполняемая при 95°С в течение 3 мин, за которой следуют 25 циклов денатурации (95°С, 30 с), отжиг (55°С, 30 с) и удлинение (72°С, 30 с), и окончательное удлинение 5 мин при 72°С.
   3. Очистите продукт ПЦР от реакционной смеси с магнитными шариками, следуя инструкциям производителя.
   4. Повторите шаги 3.3.1 и 3.3.2.
   5. Тестирование качества. Пожалуйста, обратитесь к шагу 3.2.
   6. Повторите шаг 3.3.3.
   7. Тестирование качества. Используйте 1% электрофорез сефарозного геля для проверки примесей, спектрофотометр для проверки чистоты, флуорометр для проверки концентрации и набор для анализа РНК для проверки целостности. Следуйте протоколу производителя. Нормализовать и объединить библиотеки; затем последовательность (2 x 300 bp парная настройка чтения) с использованием стандартных проточных ячеек V3 с циклом 600 циклов, производя приблизительно 100 000 парных 2 x 300 базовых считывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полноразмерные последовательности праймеров: 16S Amplicon полимеразная цепная реакция (PCR) Форвардный праймер: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] и 16S Amplicon PCR Обратный праймер: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Анализ данных секвенирования генов 16S рРНК

1. Фильтрация необработанных считывания каждого образца на основе качества последовательности с помощью программного пакета QIIME 2-201802²⁰.
   1. Скопируйте в каталог три файла: emp-paired-end-sequences_01
      один файл forward.fastq.gz, содержащий последовательность пересылки,
      один файл reverse.fastq.gz, содержащий обратную последовательность, считывает,
      Один файл barcodes.fastq.gz содержащий связанный штрихкод, считывает
   2. Исполнять
      Импорт инструментов qiime \
      --type EMPPairedEndSequences \
      --input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
2. Удалите последовательности праймера и адаптера.
   qiime cutadapt трим-парный \
   --i-демультиплексированные-последовательности демультиплексированные-seqs_02.qza \
   --p-фронт-ф GCTACGGGGGG \
   --p-фронт-р GCTACGGGGGG \
   --p-частота ошибок 0 \
   --качество-отсека 25\
   --o-обрезанные-последовательности обрезанные-seqs_03.qza \
   --многословный
3. Укороченная последовательность считывает, в которой оба парных качества ниже 25. См. выше --качество-отсечение 25
4. Анализ данных виртуализации.
   1. Соберите последовательности для формирования операционных таксономических единиц (OTA) с отсечкой подобия на уровне 97%.
      qiime vsearch dereplicate-sequences \
      --i-последовательности обрезаны-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      --i-table table_04.qza \
      --i-последовательности rep-seqs_04.qza \
      --i-reference-последовательности 97_otus.qza \
      --p-perc-идентификация 0,97 \
      --o-clustered-table-cr-97.qza \
      --o-кластеризованные последовательности rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza
   2. Для ОТУ рассчитайте относительное изобилие в каждой выборке. Информация об изобилии приведена в таблице cr-97.qza
5. Используйте родной байесовский классификатор, который предназначен для обучающего набора RDP (версия 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), чтобы отсортировать все последовательности. Информация о сопоставляемом таксоне приведена в таблице cr-97.qza
6. В рамках данного OTU назначьте классификацию, которая отражает основную согласованность последовательностей с OTUs. Затем выровняйте ОТУ. См. таблицу-cr-97.qza и rep-seqs-cr-97.qza
7. На основе информации о группе выборки выполните альфа-разнообразие (включая индексы Chao 1, ACE, Shannon, Simpson и Evenness) и анализ главных координат на основе UniFrac (PCoA).
   Экспорт инструментов qiime \
   --input-path table-cr-97.qza \
   --output-path exported-feature-table
   экспортированная таблица объектов
   
   разнообразие цииме альфа \
   --i-table-cr-97.qza \
   --p-метрические observed_otus \
   --o-альфа-разнообразие observed_otus_vector.qza
   
   qiime разнообразие бета \
   --i-table-cr-97.qza \
   --p-метрический braycurtis \
   --o-расстояние-матрица unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Прогнозирование бактериальной функции

1. Чтобы предсказать связанное представление характеристик бактерий, используйте BugBase^21. Входная таблица OTU для BugBase подготавливается с помощью следующих команд.
   biom перевести -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
   biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
   ПРИМЕЧАНИЕ: Прогноз основан на шести категориях фенотипов (Ward et al. unpublished) (https://bugbase.cs.umn.edu/): окрашивание по Граму, толерантность к кислороду, способность образовывать биопленки, содержание подвижных элементов, патогенность и устойчивость к окислительной стрессоустойчивости.
2. Прогнозирование функционального состава метагенома с помощью PICRUSt с использованием данных маркерных генов и базы данных, содержащей эталонные геномы^22.
   make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
   normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
   predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
   categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
   categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. Л1.txt
3. Проанализируйте различия в функциях между каждой группой с помощью STAMP^23,24. Пожалуйста, обратитесь к ссылкам на работу с программным обеспечением.

6. Данные

1. Используйте статистическое программное обеспечение для расчета значимости результатов. Показатель статистической значимости должен быть установлен как P < 0,05.
2. Оцените различия в возрасте и паритете с помощью T-теста Студента. Оцените различия в климактерическом статусе, истории гипертонии и диабета с помощью теста хи-квадрат. Оцените различия в количестве бактериальных таксонов яичников с помощью теста Манна-Уитни U.

Результаты

Пациентов
В общей сложности в исследование было включено 16 квалифицированных пациентов. В контрольную группу вошли 10 женщин с диагнозом доброкачественная опухоль матки (среди них у 3 пациенток была диагностирована миома матки, а у 7 пациенток был диагностирован аденомиоз матки). Между тем, в онкологическую группу входили 6 женщин с диагнозом серозный рак яичников (среди них у 2 пациенток была диагностирована II стадия, а у 2 из них была диагностирована III стадия). Следующие характеристики не показа...

Обсуждение

Рак яичников оказывает заметное влияние на фертильность женщин²⁵. Большинство пациенток с раком яичников диагностируются на поздних стадиях, а 5-летняя выживаемость составляет менее 30%^18. Опубликовано подтверждение бактерий в брюшных твердых внутренностей, включая печень, поджелудочную железу и селезенку. Существование бактерий в верхних женских репродуктивных путях происходит потому, что шейка матки не заключена^{в 2,3,}

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2200 Программное обеспечение TapeStation	Agilgent США
AmpliSeq для Illumina Подготовка библиотеки, индексы и аксессуары	Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetics
Leica ASP 300S	Leica Biosystems подразделение Leica Microsystems
Leica EG 1150	Leica Biosystems подразделение Leica Microsystems
Leica RM2235	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
LPS Core моноклональное антитело, клон WN1 222-5	Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus магнитные шарики	Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Silva база данных	Института морской микробиологии Макса Планка и Университет
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2670
Trimmomatic	Bjö rn Усадель
ZytoChem Plus (HRP) Anti-Rabbit (DAB) Kit	Zytomed Systems	HRP008DAB-RB