Без этикетки Количественные Протеомика Рабочий процесс для Discovery-Driven Хост-патоген взаимодействия

Summary

Здесь мы представляем протокол для профиля взаимодействия между хозяином и патогеном во время инфекции масс-спектрометрии на основе протеомии. В этом протоколе используется количественная оценка без меток для измерения изменений в изобилии белка как хозяина (например, макрофагов), так и патогена (например, неоформанов Cryptococcus)в одном эксперименте.

Abstract

Технологические достижения массовой спектрометрии (МС) на основе количественной протеомии открывает много неоткрытых путей для анализа глобального протеома организма в различных условиях. Эта мощная стратегия, применяемая к взаимодействию микробных патогенов с желаемым хозяином, всесторонне характеризует обе точки зрения на инфекцию. В этом документе описывается безымянная количественная оценка (ЛФЗ) инфекции криптококковых неоформанов, грибкового преподавательского внутриклеточного патогена, который является возбудителем смертельной болезни криптококкоза, в присутствии увековеченных клеток макрофага. В протоколе подробно изготовительная методика приготовления белка как для патогенных, так и для клеток млекопитающих в рамках одного эксперимента, что приводит к соответствующему представлению пептида для анализа жидко-хроматографии (LC)-MS/MS. Высокая пропускная способность общего характера ЛФЗ позволяет широкий динамический диапазон идентификации белка и количественной оценки, а также передачи в любой принимающей патогенной инфекции настройки, сохраняя крайнюю чувствительность. Метод оптимизирован для каталогизации обширных, объективных профилей изобилия белка патогена в инфекционно-имитирующих условиях. В частности, метод, продемонстрированные здесь, предоставляет важную информацию о патогенезах C. neoformans, таких как производство белка, необходимого для вирулентности, и определяет критически важные белки-хозяина, реагирующие на микробное вторжение.

Introduction

Распространенность инвазивных грибковых инфекций значительно возрастает и коррелирует с неприемлемо высокими показателями смертности, чаще всего сообщается у людей с иммунодефицитной предрасположенностью¹. Криптококковые неоформаны – это пресловутый оппортунистический грибковый патоген, способный к внутриклеточному выживанию в клетках макрофага хозяина. Неадекватное противогрибковое вмешательство приводит к грибковому распространению и опасным для жизни проявлениям криптококкового менингита и менингоэнцефалита^2,3. Глобальное повышение иммунокомпромиссного статуса потребовало параллельного увеличения использования противогрибковых препаратов, при котором многие грибковые виды, в том числе C. neoformans, все больше развивались^{сопротивление к 4,5,6}. Поэтому крайне важно внедрить надежные и эффективные технологии для ответа на жизненно важные биологические вопросы, касающиеся ответных мер принимающей стороны на оборону и микробного патогенеза.

Новая эра технологического прогресса в масс-спектрометрии (МС), включая генерацию мощных вычислительных и биоинформатических трубопроводов, обеспечивает основу для интегративного видения для масштабного анализа исследований^{хост-патогенов 7,8}. Обычный патогенез-управляемый протеомный анализ обычно профилирует мнение инфекции с точки зрения хозяина или патогена, включая комплексные методологии, такие как профилирование корреляции белка, хроматография сродства в сочетании с протеомикой, и interactomics⁹. Исследования вирулентности опасных патогенов в принимающей системе имеют огромное клиническое значение; однако применение двойного перспективного анализа в одном эксперименте ранее считалось недостижимым. Например, точка зрения патогена к инфекции часто перегружены весьма обильные белки хозяина в результате снижения чувствительности для обнаружения низкоо изобилия грибковых^{белков 7}. Кроме того, высокая сложность выборки предлагает многим целям исследовать в одной экспериментальной системе и оказывается сложной задачей для выяснения механизмов действия для конкретного патогенного белка.

Протеомика снизу вверх является популярным методом MS, который позволяет управляемой подготовки образца, в котором пептиды генерируются последовательности конкретных энзиматических пищеварения следуют жидкие хроматографии разделения, идентификации и количественной оценки MS^10,11. Здесь мы представляем метод, демонстрирующий стратегию приобретения, зависящая от данных, направленную на достижение беспристрастного охвата протеома на основе инфекции или «инфекции». В частности, без этикетки количественной оценки (LF) проливает зависимость от химических или метаболических этикеток для надежной и точной идентификации изменений уровня белка через несколько протеомов, снижение обработки образцов^{и обработки шаги 12,13}. Это универсальное применение допрашивает произведенные белки в данный момент в клетке, независимой от ожидаемого производства белка; таким образом, новые идеи могут быть обнаружены, которые имеют решающее значение для инфекции.

Рабочий процесс, описанный в настоящем, оптимизирован для изучения изменений уровня белка C. неоформанов во время инфекционно-мимикряющих состояний с иммунными клетками хозяина(рисунок 1). Вместо того, чтобы полагаться на изоляцию и разделение типов клеток, этот подход извлекает хозяина и патогена протеом вместе, и использует биоинформатическое разделение с использованием двух конкретных организмов баз данных для различения видового производства белка. Этот метод дает преимущества для неограниченного числа образцов, которые будут обработаны без дополнительных дорогостоящих подготовительных шагов, необходимых в изотопных исследованиях маркировки или фракциоции. Кроме того, этот рабочий процесс поддерживает оптимизированные протоколы извлечения белка, переносяные в широкий спектр грибковых и бактериальных патогенов, способных нацеливаться и заражать иммунные клетки хозяина. В целом, в этом протоколе излагаются шаги для завершения беспристрастной извлечения белка и обработки образцов для MS с высоким разрешением, а затем данные и статистический анализ, способный обеспечить богатые знания грибковых белков, важных для инфекции в сочетании с всеобъемлющим профилированием ответной меры защиты хозяина.

Protocol

Увековеченная линия макрофагов, полученных из мышей BALB/c, была использована для следующего протокола, утвержденного Протоколом об использовании животных Университета Гвельфа 4193. Примечательно, что другие штаммы мышей или другие источники увековеченных клеток могут быть применены к изложенному протоколу с достаточным тестированием для оптимизации подробных параметров. Следующий протокол будет перемещаться по шагам, начиная с замороженного флакона клеток макрофагов. Клетки хранятся в 10% FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота), 1% L-глутамина и 5% Пен/Стреп (Пенициллин-Стрептомицин) смесь DMEM (Dulbecco модифицированный eagle Medium) и 20% DMSO (диметилсульфсид).

1. Культивирование неоформанцев С.

1. Используя запас глицерола, полоса wildtype C. neoformans штамм (H99) на дрожжи экстракт пептон декстрозы (YPD) агар пластины для изоляции одиночных колоний.
2. Инкубировать на ночь в течение 16 ч при 37 градусов по Цельсию в статическом инкубаторе.
3. Выберите одну колонию штамма и культуры wildtype C. neoformans в 5 мл бульона YPD в слабо ограниченной пробирке 10 мл. Выполните в четыре раза.
4. Инкубировать на ночь в течение 16 ч при 37 градусов по Цельсию в трясущимся инкубаторе при 200 об/мин.
5. На следующий день субкультуры каждой ночной культуры в 1:100 разбавления в 3 мл бульона YPD.
6. Измерьте оптические значения плотности (OD_600nm)грибковой культуры для определения фазы среднего журнала. В зависимости от спектрофотометра штамм wildtype C. neoformans достигает фазы среднего входа, обычно следуя инкубации от 6 до 8 ч в YPD с общими значениями OD_600nm в диапазоне от 1,0 до 1,5.
7. Как только клетки достигают фазы среднего журнала, возьмите алициты грибковых клеток в чистую микроцентрифугную трубку 1,5 мл и разбавьте 1:100 в стерильный 1x фосфат буферный солевой раствор (PBS). Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.

2. Культивирование клеток макрофагов

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что рабочая среда стерилизована до работы клеточной культуры.

1. Подготовка среды клеточной культуры
   1. Антибиотик дополнением среды: Добавить 10% FBS (фетальной сыворотки крупного рогатого скота), 1% L-глутамин и 5% Пен / Strep (Пенициллин-Стрептомицин) смесь DMEM (Dulbecco модифицированный иглы среднего). Фильтруемую среду через полную систему фильтров на 0,2 мкм и хранить при 4 градусах Цельсия.
   2. Антибиотическая среда: Следуйте идентичному протоколу, но опустить смесь Pen/Strep.
2. Посев макрофагов клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотическая среда (2.1.1.) должна быть подогрета до 37 градусов по Цельсию до работы клеточной культуры.
   1. Оттепель флакон макрофаг клеток быстро в 37 градусов по Цельсию шарик ванны.
   2. Вымойте клетки замораживания раствора путем повторного перерасхода клеток в 1 мл антибиотиков дополненной среде.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные меры предосторожности необходимы для обеспечения клетки не лизировать из-за суровых трубопроводов.
   3. Перенесите повторно наемные клетки в стерильную трубку 15 мл.
   4. Пеллетные клетки путем центрифугирования при температуре 400 × в течение 5 мин при комнатной температуре.
   5. Аккуратно удалите супернатант с серологическим пипеткой или вакуумным аспиратором.
   6. Аккуратно повторное использование гранул в 10 мл антибиотиков дополняется средой.
   7. Аккуратно пипетка resuspended клетки в 60 х 15 мм клеточной культуры обработанные блюдо.
   8. Инкубировать блюдо при 37 градусов по Цельсию с 5% CO_{2 на} ночь.
3. Первоначальный проход клеток макрофагов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные запасы клеток, как правило, содержат от 5 до 10 миллионов клеток на флакон (приблизительно 1 мл). В последующий день, макрофаг клетки, которые пережили протокол посева будет придерживаться нижней части блюда клеточной культуры и будет готов к проходить.
   1. Теплая среда, дополненная антибиотиками (шаг 2.1.1) до 37 градусов по Цельсию до работы клеточной культуры. Обеспечить стерилизацию рабочей среды до начала работы клеточной культуры. Визуализуйте клетки с помощью светового микроскопа, чтобы обеспечить соблюдение и здоровье клеток.
   2. Удалить клеточной культуры среды из блюда либо с серологической пипетки или вакуумного аспиратора.
   3. Аккуратно добавьте 5-7 мл стерильной комнатно-температурной PBS (фосфат-буферный солевой раствор) к блюду 60 х 15 мм.
   4. Аккуратно наклоните блюдо, чтобы вымыть прилипаемые клетки.
   5. Удалите PBS с помощью серологического пипетки или вакуумного аспиратора.
   6. Добавьте 1 мл холодного PBS (хранится при температуре 4 градусов по Цельсию) в клетки, наклоните блюдо, чтобы распределить PBS по всем клеткам, и дайте посидеть при комнатной температуре в течение 1 мин.
   7. Отпустите клетки путем нежного выстукивания тарелки, pipetting холодного PBS против клеток, или путем использование скребка клетки.
   8. Добавьте в блюдо 9 мл мЛ с антибиотиками.
   9. В новое блюдо калибра 60 х 15 мм добавьте 9 мл свежей среды, дополненной антибиотиками, и 1 мл повторно нажатых клеток из оригинального блюда.
   10. После того, как количество желаемых проходных пластин были заполнены, перерасход клеток из оригинального блюда могут быть отброшены.
   11. Инкубировать новое блюдо в настройках, упомянутых выше (шаг 2.2.8).
   12. Выполните последующее протекание, когда клетки достигли 70-80% слияния (примерно каждые 2 дня в зависимости от используемой клеточной линии и среды).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Макрофаг клетки должны пройти как минимум пять раз до инфекционных экспериментов. В зависимости от клеточной линии, инфекционные эксперименты должны быть выполнены от 25 до 30 проходов. После 25 до 30 проходов, клетки должны быть заморожены или отброшены. Раздел 2.4 или 2.5 может быть выбран на основе экспериментальных планов. Раздел 2.4 будет использоваться для следующих разделов.
4. Посев клеток макрофагов до заражения
   1. Выполните этапы протокола прохода от 2.3.1 до 2.3.7.
   2. Использование гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток определяет плотность клеток (клетки/мл).
   3. Передача 0,3 х 10^{6 макрофаговых} клеток в один колодец пластины 6-хорошо клеточной культуры.
   4. Отрегулируйте общий объем хорошо до 1 мл с использованием антибиотико-дополненной среды (шаг 2.1.1).
   5. Повторите шаги 2.4.3 и 2.4.4 до тех пор, пока не будут заполнены 8 скважин (4 скважины заполнены двумя отдельными пластинами).
   6. Дополнительно заполните оставшиеся две скважины 1 мл комнатно-температурного PBS для поддержания уровня влаги во время инкубации.
   7. Разрешить клеткам расти в условиях инкубации, упомянутых в шаге 2.2.8 для 2 d до инфекции.
5. Посев макрофагов в день заражения
   1. Выполните этапы протокола прохода от 2.3.1 до 2.3.7.
   2. Использование гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток определяет плотность клеток (клетки/мл).
   3. Семя 1.2 x 10^{6 макрофаговых} клеток в один колодец пластины культуры клеток 6-хорошо.
   4. Отрегулируйте общий объем хорошо до 1 мл с использованием антибиотиков-дополненной среды (2.1.1).
   5. Повторите 2.4.3 и 2.4.4 до тех пор, пока не будут заполнены 8 скважин (4 скважины заполнены двумя отдельными пластинами).
   6. Дополнительно заполните оставшиеся две скважины 1 мл комнатно-температурного PBS для поддержания уровня влаги во время инкубации.
   7. Инкубационые клетки в условиях, упомянутых в шаге 2.2.8 для 3 ч, чтобы клетки придерживались скважин.

3. Инфекция клеток макрофагов с C. неоформанами

ПРИМЕЧАНИЕ: По достижении 70-80% слияния, будет около 1,2 х 10^{6 клеток} макрофагов на колодец. Для достижения желаемой множественности инфекции (МВД) 100:1, 1,2 х 10^{8 грибковых} клеток необходимы для каждой реакции. Культуры должны быть установлены соответствующим образом в биологической четверки.

DISCLAIMER: МВД 100:1 достигло желаемых результатов в нашей исследовательской группе и предназначено как предложение читателям. Более низкий MOI может потребоваться для более инфекционных штаммов C. neoformans или для менее устойчивых линий клеток макрофага. Проверка инфекции (раздел 3.5) может быть использована для определения идеального МВД для конкретных комбинаций C. neoformans - макрофагов.

1. Подготовка грибковых клеток
   1. Следуйте шагу 1 для роста C. неоформанов до фазы среднего журнала.
   2. Собирайте и центрифугировать клетки по 1500 х г в течение 10 мин, аккуратно промыть гранулы стерильной комнатной температурой PBS и повторить в общей сложности три моет.
   3. Повторное использование клеток в среде культуры клеток, свободных от антибиотиков (шаг 2.1.2) для достижения концентрации 1,2 х 10⁸ клеток/мл.
2. Подготовка клеток макрофагов
   1. Визуализуй каждую хорошо в 6-хорошо пластины для обеспечения того, чтобы клетки достигли 70-80% слияния. Кроме того, клетки могут быть измерены для достижения приблизительно 1,2 х 10^{6 макрофагов} клеток на колодец.
   2. Следуйте шагам от 2.3.1 до 2.3.4.
3. Со-культура клеток C. neoformans и макрофагов
   1. Добавьте 1 мл ресс-клеток C. neoformans (шаг 3.1.3) к 4 скважинам, содержащим клетки макрофагов, подготовленные в разделе 3.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество необходимых пластин необходимо будет вычислить до начала эксперимента. Добавьте 1 мл среды, свободной от антибиотиков (шаг 2.1.2), в пустые скважины.
   2. Разрешить ячейки инкубировать в условиях, перечисленных (шаг 2.2.8) в течение 3 ч.
   3. Удалите среду клеточной культуры из пластины либо с серологическим пипеткой, либо с помощью вакуумного аспиратора.
   4. Аккуратно добавьте 1 мл стерильной комнатной температуры PBS.
   5. Аккуратно наклоните пластину, чтобы вымыть неприложенные или нефагоцитонные внеклеточные клетки C. neoformans.
   6. Удалите PBS с помощью серологического пипетки или вакуумного аспиратора, повторите в общей сложности три моет. Повторите еще 3,3,4 - 3,3,5 раза.
4. Неинфицированные макрофаги
   1. Аналогичным образом, используйте 4 скважины из 6 скважин пластины, чтобы служить выступать в качестве макрофагов только образцы. Добавьте к этим скважинам 1 мл среды, свободной от антибиотиков (шаг 2.1.2).
   2. Повторите шаги от 3.3.2 до 3.3.6.
5. Проверка инфекции
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используя анализ цитотоксичности, можно измерить уровень инфицирования. В следующем протоколе будет подчеркнуто применение продукта цитотоксичности для измерения выброса LDH (лактат дегидрогеназы). Другие продукты цитотоксии также могут быть использованы.
   1. Подготовка C. неоформанцев инфекции клеток макрофагов
      1. Повторяет шаги 1, 2 и 3 (до 3,5). Анализ LDH может быть выполнен в три раза, если предпочтительнее.
      2. Следуя шагу 3.3.6, добавьте 1 мл среды, свободной от антибиотиков (2.1.2) к каждому хорошо в 6-хорошо пластины.
      3. Повторите шаги 2.4.3 и 2.4.4 до тех пор, пока не будут заполнены 3 скважины плюс 3n скважины (где n измеряется количество измеренных точек времени).
      4. Инкубационые клетки при условиях, перечисленных на шаге 2.2.8.
      5. В выбранных точках времени (например, 1, 3, 6, 12 и 24 часа) собирают супернатант для измерения выпуска LDH в соответствии с инструкциями производителя
      6. В то же время, неинфицированные клетки макрофагов будут лизированы до определенного значения для максимальной цитотоксичности.
      7. Рассчитайте цитотоксичность следующим образом:
         

4. Сбор образцов

1. Со-культура и неинфицированная коллекция макрофагов
   1. Добавьте 1 мл холодного PBS в клетки (от 3.3.6 и 3.4.2) и дайте посидеть при комнатной температуре в течение 1 мин.
   2. Освобождение клеток от пластины путем мягкого постукивания пластины или нежный трубопровод холодный PBS против клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовый скребок следует избегать, поскольку это может вызвать лиз клеток.
   3. Pipette resuspended клетки в трубку 15 mL.
   4. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант.
   5. Процесс клетки (как подробно в шаге 5) немедленно или вспышки заморожены в жидком азоте и хранятся при -80 градусов по Цельсию для более поздней обработки.

5. Сотовый протеом

ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточное количество лиза должно быть оптимизировано для анализируемого типа клетки (т.е. количество циклов и амплитуд зависит от размера гранул клетки и процент мощности модели зонда sonicator).

1. Зараженный лиз клеток макрофагов
   1. Resuspend гранулированное клетки (шаг 4.1.5) в 300 йл 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), состоящий из свежерапустенного ингибитора протеазы коктейль таблетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один ингибитор протеазы коктейль таблетки добавляется в 10 мл ледяного 100 мМ Tris-HCl (рН 8,5) до начала эксперимента.
   2. Зонд sonicate клетки в ледяной ванне в течение 15 циклов 30 с и 30 с выключенным, чтобы подлить клетки.
   3. Центрифуга клетки кратко в течение 30 с на 400 х г, осторожны, чтобы не сформировать гранулы, просто чтобы удалить жидкость по бокам труб с последующим переводом образца в 2 мл Lo-bind микроцентрифуг трубки.
   4. Добавьте 1:10 объем 20% SDS к конечной концентрации 2%.
   5. Добавьте 1:100 объемом 1 м дитиотрейтол (МТТ) к конечной концентрации 10 мм и тщательно смешайте образец с помощью труб, а затем инкубации на тепловом нагревательном блоке при 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин при агитации 800 об/мин. Далее, прохладно до комнатной температуры (охлаждение может быть сделано на льду).
   6. Добавьте 1:10 объемом 0,55 М иодоацетамида (IAA), чтобы получить окончательную концентрацию 55 мМ и тщательно перемешать образец с помощью труб. Инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 20 минут.
   7. Добавьте 100% ацетон, чтобы получить окончательную концентрацию 80% ацетона и хранить образец на ночь при -20 градусов по Цельсию, чтобы осаждать белки.
2. Белковое пищеварение
   1. На следующий день, собирать осадонные гранулы центрифугации в течение 10 минут при 10000 х г и 4 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатанта и вымойте гранулы с 500 МКЛ 80% ацетона. Повторите в общей сложности две стирки. Воздушные сухие гранулы при комнатной температуре после мытья.
   2. Resolubilize белковые гранулы в 100 йл 8 M мочевины/40 мМ HEPES, чтобы обеспечить полную solubilization, вихрь или sonicate в ледяной водяной бане в течение 15 циклов 30 с и 30 с выключен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Корректировка объема мочевины/HEPES определяется размером осажденных клеточных гранул, если изменения происходят, все объемы ниже по течению должны быть соответствующим образом скорректированы.
   3. Количественная оценка концентрации белка с использованием анализа белка (например, анализ белка BCA) в соответствии с инструкциями производителя и корректировка для фонового измерения путем пустой нормализации с 8 M мочевины/40 мМ HEPES.
   4. Добавьте 300 мкл бикарбоната аммония 50 мм, чтобы получить окончательную концентрацию 2 М мочевины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможность нормализовать концентрацию белка для измерений вниз по течению, предложил переварить 100 мкг белка и хранить оставшиеся непереваренные образца путем флэш-замораживания в жидком азоте, а затем хранить при -20 градусов по Цельсию в краткосрочной перспективе, или при -80 градусов по Цельсию в долгосрочной перспективе.
   5. Добавьте 2:50 (v/w) соотношение ферментов к белку трипсина/Lys-C протеазной смеси на льду и аккуратно коснитесь трубки, чтобы перемешать, инкубировать на ночь при комнатной температуре.
   6. После инкубации прекратите пищеварение, добавив 1:10 раствор остановки тома (20% ацетонитриля, 6% трифтороацетической кислоты) и образцы центрифуги при 10 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   7. Соберите супернатант(состоит из переваренных пептидов)и выбросьте любой гранулированного мусора или осадка.
3. Пептидное опреснирование
   1. Активируйте наконечник C18 Stop And Go Extraction (STAGE) (состоящий из 3 слоев смолы C18 в наконечнике пипетки 200 йл), добавляя 100 мкл из 100% ацетонитрила и центрифуги при 1000 х г в течение 2 минут.
   2. Эквилибрировать наконечник C18 STAGE, добавив 50 МКЛ буфера B (80% (v/v) ацетонитриле, 0,5% (v/v) уксусной кислоты) и центрифуги при 1000 х г в течение 2 мин.
   3. Equilibrate C18 STAGE наконечник, добавив 200 йл буфера А (2% (v/v) ацетонитрил, 0,1% (v/v) трифтороацетической кислоты, 0,5% (v/v) уксусной кислоты) и центрифуги на 1000 х г в течение 3-5 мин.
   4. Добавьте 50 мкг переваренного образца на кончик C18 STAGE и центрифугу при 1000 х г в течение 3-5 мин, или до тех пор, пока образец не прошел через спиновую колонку. Вспышка заморозить оставшийся усваиваемый образец в жидком азоте и хранить при -20 градусов по Цельсию, пока это необходимо.
   5. Вымойте наконечник C18 STAGE с 200 йл буфера А и центрифуги при 1000 х г в течение 3-5 мин.
   6. Добавьте 50 йл буфера B к кончику C18 STAGE и центрифуге при 500 x g в течение 2 мин. Соберите элеваторные пептиды в трубках ПЦР 0,2 мл.
   7. Высушите эластиированные пептиды в вакуумной центрифуге в течение 30-40 минут на максимальной скорости. Полностью высушенные образцы могут храниться при комнатной температуре или при температуре -20 градусов по Цельсию до обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сушеные и опресненные пептиды являются подходящими образцами для установки масс-спектрометрии для обработки и могут быть отправлены при температуре окружающей среды.

6. Массовая спектрометрия

1. Восстановленные пептиды в буфере A и измеряют концентрацию, необходимую для введения пептидов от 1,5 до 3 мкг на столб MS. Количество выборки будет зависеть от приборов.
2. Используйте заранее определенный градиент ацетонитрила (приблизительно 5-60%) в 0,5% уксусной кислоты в течение желаемого времени (например, 2 ч) отделить пептиды от высокой производительности жидкой хроматографии, а затем ионизации электроспрей в масс-спектрометр.
3. Приобретайте сканирование MS с помощью масс-спектрометра высокого разрешения в режиме получения данных(м/з от 300 до 1650).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процент градиента и длина определяются экспериментом и пользователем. Точные настройки масс-спектрометра зависят от приборов, экспериментов и предпочтений пользователей.

7. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: MS данные могут быть обработаны с помощью многочисленных трубопроводов биоинформатики. В этом протоколе мы описываем обработку с помощью общедоступных платформ Max'u'3 и Perseus, но рекомендуем отдельным пользователям оценить биоинформатические инструменты, подходящие для анализа, предпочтения и использования.

1. Загрузите необработанные файлы данных (непосредственно с инструмента MS) с помощью программного обеспечения Max'u'ut. Определите белки по измененным параметрам поиска Max'u'u'ut; минимум два уникальных пептида, необходимых для идентификации белка с использованием целевого приманки подход для ложной скорости открытия 1%, осуществлять этикетки свободной количественной оценки с сопоставлением между работает, включить организмы FASTA файл, полученный из базы данных UniProt (т.е., Cryptococcus неоформанов H99, Mus musculus) для выявления и количественной оценки нынешних пептидов с поисковой системой Andromeda. Проконсультируйтесь с публичными онлайн-инструментами Max'u'ut для подробных учебников (см. таблицу материалов).
2. Загрузите выходной файл Max'u'.txt)) в Персей.
3. Фильтровые ряды, содержащие потенциальные ложные срабатывания и загрязняющие вещества, а также модифицированные только пептидами участка с помощью строк фильтра на основе категорического столбца.
4. Преобразование значений данных по_{шкале журнала 2.}
5. Создание групп наборов данных путем предоставления категорической аннотации к строкам.
6. Набор данных фильтра по действительным значениям для определения отрезка для обнаружения белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для строгого и надежного анализа предлагается идентификация на 50%. Например, если было обработано четыре репликации, то будет выбрано минимальное число из трех действительных значений.
7. Если предпочтительнее, вменять данные, заменяя недостающие значения из обычного распределения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вмененые значения оптимизированы на основе нормального распределения и обеспечивают случайную интенсивность ЛФЗ для замены амплуа "NaN" для имитации типичных измерений изобилия. Это вменение обеспечивает платформу для вниз по течению статистического анализа, которые требуют количественных данных.
8. Добавьте аннотации к белковым рядам (например, названия белков, термины генной онтологии).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот рабочий процесс Perseus, генерируемый в настоящее время надежная основа для дальнейшей биоинформатической обработки, статистического анализа и визуализации данных, обратитесь к общественности Perseus онлайн инструменты для подробных учебников (см. таблицу материалов).

Results

Протокол, изложенный выше, позволяет определить и количественно определить белки, полученные как из грибкового патогена, C. неоформанов, и хозяина, макрофаг клеток, в одном эксперименте. После совместной культуры клетки собираются и обрабатываются вместе и биоинформатически разделены на основе пептидных профилей, характерных для каждого вида. Это мощный подход для определения взаимодействия отношений между принимающей стороной и патогеном во время инфекции. Количество белков, выявленных в ходе эксперимента, зави...

Discussion

Критические шаги в протоколе включают подготовку клеток макрофагов и сбор образцов совместной культуры для обработки белка с минимальным нарушением клеток. Важно выполнять шаги мытья, инокулации и удаления клеток макрофагов адепта мягко и тщательно, чтобы предотвратить ненужныйлиз клеток перед сбором. Создание правильного МВД для эксперимента также имеет решающее значение, как инокулирование с чрезмерно высоким МВД может привести к быстрой смерти клеток макрофага и трудности в сборе и обработке образцов для MS. И наоборо...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 мМ Tris-HCl, pH 8,5	Fisher Scientific	BP152-1	поддерживать на уровне 4°С;
C 60 x 15 мм Тарелка, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
6-луночная клеточная культуральная тарелка	ThermoFisher Scientific	140675
Ацетонитрил, MS марки	Pierce	TS-51101
Уксусная кислота	Sigma Aldrich	1099510001
ацетон	Sigma Aldrich	34850-1L
Аммоний бикарбонат (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Приготовьте запасной 50 мМ раствор ABC, стабильный при комнатной температуре в течение одного месяца.
Бел-Арт&трейд; Система сбора вакуумных аспираторов HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	Не обязательно, для удаления сред можно использовать серологические пипетки.
Смола C18	3M Empore	3M2215
Скребки для клеток	VWR	10062-906	Не обязательно, можно использовать другие методы высвобождения макрофагальных клеток.
Центробежный вакуумный концентратор	Eppendorf	07-748-15
Комплектная фильтрационная установка	VWR	10040-436
Конические соколиные пробирки (15 мл)	Fisher Scientific	05-539-12
Автоматизированный счетчик ячеек Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Не обязательно, в качестве альтернативы можно использовать гемоцитометр.
CytoTox 96 Анализ нерадиоактивной цитотоксичности	Promega	G1780
Дитиотреитол (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Приготовьте массовый раствор 1 М DTT, мгновенно заморозьте и храните при -20 °°; C до использования. Выбрасывайте после каждого использования (не замораживайте-не размораживайте повторно).
DMEM, высокий уровень глюкозы, добавка GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Тепло инактивировать путем инкубации при температуре 60°С; C в течение 30 минут. Приготовьте 50 мл аликвот и мгновенно заморозьте. Разморозить перед приготовлением среды
Гемоцитометр	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Приготовить 40 мМ HEPES/8 М мочевину в нерасфасованном исходном растворе, мгновенной заморозке, хранить при -20°С; C до использования. Выбрасывайте после каждого использования (не замораживайте-не размораживайте повторно).
Высокопроизводительная система жидкостной хроматографии	ThermoFisher Scientific	LC140	Длина градиента основана на сложности образца, рекомендуемый градиент 120 мин для образцов инфекции.
Масс-спектрометр высокого разрешения	ThermoFisher Scientific	726042
йодоацетамида (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Приготовить 0,55 М массовый раствор, мгновенно заморозить, хранить при -20°С; C до использования. Выбрасывайте после каждого использования (не замораживайте-не размораживайте повторно).
L-глютамин	ThermoFisher Scientific	25030081	может быть аликвотным и замороженным для хранения. Разморозьте перед подготовкой среды.
LoBind Микроцентрифужные пробирки	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant — это общедоступная платформа, которая предлагает учебные пособия, такие как Летняя школа MaxQuant, в которых излагаются этапы вычислительного анализа больших наборов данных MS
Микроцентрифуга	Eppendorf	13864457
пенициллин: стрептомицин 10k/10k	VWR	CA12001-692	Может быть аликвотным и замороженным для хранения. Разморозьте перед подготовкой среды.
Колонки для разделения пептидов	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
буферизованный солевым раствором	VWR	CA12001-676	Puchase не требуется. PBS также можно приготовить, но перед использованием необходимо провести стерильную фильтрацию.
Анализ белка Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	23225
Пипетка, одноразовая серологическая (10 мл)	Fisher Scientific	13-678-11E
Пипетка, одноразовая серологическая (25 мл) Basix	Fisher Scientific	14955235
зондовый зондатор	ThermoFisher Scientific	100-132-894
Коктейль ингибитора протеазы	Roche	4693159001
додецилсульфат натрия	ThermoFisher Scientific	28364	20% (б/в)
Спектрофотометр (нанокапля)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE опрокидывающаяся центрифуга		Sonation STC-V2
Термошейкер	VWR	NO89232-908
Трифторуксусная кислота	ThermoFisher Scientific	85183
Смесь трипсина/протеазы Lys-C, Марка MS	Pierce	A40007	Поддерживайте при -20 °C.
Ультразвуковая ванна	Bransonic	A89375-450	Хранится в холодильной камере (4С)
Мочевина	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Готовится 40 мМ HEPES/8 М Мочевина в сыпучем исходном растворе, мгновенной заморозке, хранить при температуре -20 °°; C до использования. Выбрасывайте после каждого использования (не замораживайте-не размораживайте повторно).
Дрожжевой экстракт пептона декстрозы бульон	BD Difco	BM20