Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение жизнеспособных адипоцитов и стромально-васкулярной фракции из висцеральной жировой ткани человека, пригодных для анализа РНК и фенотипирования макрофагов

4.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61884

⸱

27 октября 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

В этой статье

Краткое содержание

Данный протокол обеспечивает эффективный метод расщепления коллагеназы для выделения жизнеспособных адипоцитов и клеток стромально-васкулярной фракции-SVF из висцерального жира человека в рамках одного процесса, включая методологию получения высококачественной РНК из адипоцитов и фенотипирование SVF-макрофагов путем окрашивания нескольких мембраносвязанных маркеров для анализа методом проточной цитометрии.

Аннотация

Висцеральная жировая ткань (VAT) — это активный метаболический орган, состоящий в основном из зрелых адипоцитов и клеток стромально-васкулярной фракции (SVF), которые выделяют различные биологически активные молекулы, контролирующие метаболические, гормональные и иммунные процессы; В настоящее время неясно, как эти процессы регулируются в жировой ткани. Поэтому разработка методов, оценивающих вклад каждой клеточной популяции в патофизиологию жировой ткани, имеет решающее значение. Этот протокол описывает этапы выделения и предоставляет необходимые рекомендации по устранению неполадок для эффективного выделения жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF из биопсии НДС человека в одном процессе с использованием метода ферментативного расщепления коллагеназы. Кроме того, протокол оптимизирован для идентификации субпопуляций макрофагов и выделения зрелой РНК адипоцитов для исследований экспрессии генов, что позволяет проводить исследования по анализу взаимодействия между этими клеточными популяциями. Вкратце, биопсии с НДС промывают, измельчают механическим способом и переваривают для получения одноклеточной суспензии. После центрифугирования зрелые адипоциты выделяют флотацией из гранулы SVF. Протокол экстракции РНК обеспечивает высокий выход общей РНК (включая микроРНК) из адипоцитов для последующего анализа экспрессии. Одновременно SVF-клетки используются для характеристики субпопуляций макрофагов (про- и противовоспалительный фенотип) с помощью анализа методом проточной цитометрии.

Введение

Белая жировая ткань состоит не только из жировых клеток или адипоцитов, но и из фракции нежировых клеток, известной как стромально-васкулярная фракция (SVF), которая содержит гетерогенную клеточную популяцию, состоящую из макрофагов, других иммунных клеток, таких как регуляторные Т-клетки (Tregs), а также эозинофилов, преадипоцитов и фибробластов, окруженных сосудистой и соединительной тканью 1,2. Жировая ткань (АТ) в настоящее время считается органом, который регулирует физиологические процессы, связанные с метаболизмом и воспалением, с помощью адипокинов, цитокинов и микроРНК, продуцируемых и высвобождаемых различными клетками в ткани, с аутокринным, паракринным и эндокринным эффектами 3,4. У человека белая жировая ткань состоит из подкожной жировой клетчатки (САТ) и висцеральной жировой ткани (ВАТ) с важными анатомическими, молекулярными, клеточными и физиологическими различиями между ними 2,5. САТ составляет до 80% АТ человека, в то время как АТ находится в брюшной полости, преимущественно в брыжейке и сальнике, будучи метаболически более активными6. Кроме того, НДС является эндокринным органом, выделяющим медиаторы, оказывающие существенное влияние на массу тела, чувствительность к инсулину, липидный обмен и воспаление. Следовательно, накопление НДС приводит к абдоминальному ожирению и связанным с ожирением заболеваниям, таким как диабет 2 типа, метаболический синдром, гипертония и риск сердечно-сосудистых заболеваний, что является лучшим предиктором смертности, связанной с ожирением 6,7,8,9.

В гомеостатических условиях адипоциты, макрофаги и другие иммунные клетки взаимодействуют для поддержания метаболизма НДС посредством секреции противовоспалительных медиаторов10. Однако чрезмерное увеличение НДС способствует рекрутированию активированных Т-клеток, NK-клеток и макрофагов. Фактически, при постном НДС соотношение макрофагов составляет 5%, в то время как при ожирении это соотношение возрастает до 50%, при этом поляризация макрофагов от противовоспалительного к провоспалительному фенотипу, генерирует хроническую воспалительную среду10,11.

В результате пандемии ожирения появилось поразительное количество отчетов, посвященных различным темам исследований НДС, включая биологию адипоцитов, эпигенетику, воспаление, эндокринные свойства и новые области, такие как внеклеточные везикулы, среди прочего 8,10,12,13. Однако, несмотря на то, что среда НДС определяется перекрестными помехами между адипоцитами и резидентными или прибывающими макрофагами, большинство исследований были сосредоточены только на одной популяции клеток, и существует скудная информация о взаимодействии этих клеток в НДС и их патофизиологических последствиях11,14. Кроме того, ценные исследования, посвященные взаимодействию адипоцитов и макрофагов при АТ, были проведены с использованием клеточных линий, в которых отсутствовали условия прайминга in vivo 11,14,15. Подходящая стратегия для анализа взаимодействия или конкретного вклада этих клеток в НДС требует выделения обоих типов клеток из одной и той же биопсии жира для проведения анализов in vitro, которые отражают как можно более схожие свойства in vivo, регулирующие метаболизм НДС.

Несмотря на то, что методы неферментативной диссоциации, основанные на механических силах для разрушения АТ, обеспечивают минимальные манипуляции, эти методы не могут быть использованы, если целью является изучение SVF-клеток, так как они имеют меньшую эффективность в восстановлении клеток и низкую жизнеспособность клеток по сравнению с ферментативными методами, а также требуется больший объем ткани16,17. Ферментативное расщепление с использованием коллагеназы является щадящим методом, который обеспечивает адекватное переваривание белков коллагена и внеклеточного матрикса волокнистых тканей, таких как WAT18, и часто используется, когда трипсин неэффективен или повреждает19. Протокол содержит фундаментальные рекомендации по устранению неполадок для эффективного выделения жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF-клеток из биопсии человека с НДС в одном процессе с использованием метода ферментативного расщепления коллагеназы, предоставляя информацию для обеспечения высокого выхода (количество, чистота и целостность) общей РНК из зрелых адипоцитов, включая микроРНК, для последующих применений экспрессии. В то же время протокол оптимизирован для идентификации субпопуляций макрофагов из SVF-клеток путем окрашивания нескольких мембраносвязанных маркеров для дальнейшего анализа методом проточной цитометрии20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен IRB Национального института перинатологии (212250-3210-21002-06-15). Участие было добровольным, и все зарегистрированные женщины подписали форму информированного согласия.

1. Забор висцеральной жировой ткани

  1. Получение биопсии с НДС путем частичной оментэктомии во время кесарева сечения у здоровых взрослых женщин с одноплодной беременностью в срок без родов.
  2. После закрытия матки и гемостаза приступают к выявлению большого сальника и вытягивают его на влажном компрессе. Выставляемый АТ является НДС.
  3. Найдите самый большой кровеносный сосуд и проведите воображаемую линию размером 7 х 5 см до основания большого сальника.
  4. Определите аваскулярную зону и с помощью щипцов Келли просверлите внешнюю сторону НДС.
  5. Используйте щипцы Окснера, чтобы зажать проксимальную и дистальную сторону в зоне, где был просверлен НДС, и используйте ножницы Метценбаума, чтобы разрезать ткань.
  6. Свяжите большой сальник черным шелком No 1.
  7. Снимите щипцы Окснера и оцените гемостаз.
  8. Поместите биопсию в НДС в стерильный контейнер и немедленно транспортируйте ее в лабораторию.

2. Ферментативное переваривание висцеральной жировой ткани и выделение зрелых адипоцитов и клеток стромально-васкулярной фракции

  1. Взвесьте биопсию с НДС и промойте 1x PBS pH 7,4.
  2. Отрежьте 4 г чана и ножницами измельчите ткань на мелкие кусочки в лотке для вскрытия.
  3. Перелейте фарш в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавьте 20 мл PBS и осторожно встряхните, чтобы удалить избыток красных кровяных телец.
  4. Откажитесь от PBS и повторите процедуру дважды.
  5. Переложите НДС в новую стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 25 мл раствора для сбраживания (0,25% коллагеназы II типа, 5 мМ глюкозы, 1,5% альбумина в PBS).
  6. Инкубировать при 37 °C в течение 60 мин в орбитальном шейкере при 125 об/мин.
  7. Отфильтруйте переваренную ткань через три слоя марли в новую стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл.
  8. Центрифуга при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  9. Получаются две фазы, верхняя фаза, которая соответствует зрелым адипоцитам, в то время как клетки SFV остаются в грануле. Осторожно перенесите зрелые адипоциты в новую стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью трансферной пипетки.
  10. Добавьте 20 мл холодного PBS, осторожно встряхните и центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  11. Откажитесь от PBS и повторите процедуру дважды.
  12. Используйте пипетку для переноса, чтобы аккуратно перенести зрелые адипоциты в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, свободную от ДНКазы-РНКазы.
  13. Центрифугу при 200 x g в течение 1 мин при 4 °C и удалите излишки PBS с помощью микропипетки P200. При необходимости повторите этот шаг.
  14. Осторожно перенесите 300 мкл зрелой суспензии адипоцитов в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, свободные от ДНКазы-РНКазы. Хранят зрелые адипоциты при -80 °C до экстракции РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адипоциты не образуют гранул.
  15. После отделения адипоцитов (шаг 2.9) отсасывайте большую часть пищеварительного раствора с помощью трансферной пипетки, держа гранулу SVF на дне пробирки.
  16. Переложите гранулы с SVF-клетками в новую центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки для переноса.
  17. Осторожно промойте гранулы ячейки, повторно суспендировав в 20 мл холодного 1x PBS, пипетируя вверх и вниз.
  18. Центрифугу при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C и быстро выбросьте надосадочную жидкость путем декантации.
  19. Выполните вторую стирку, повторив шаги 2.17 и 2.18.
  20. Добавьте 5 мл буфера для лизиса эритроцитов, сбалансированного до комнатной температуры (RT), к грануле SVF и суспендируйте путем повторного пипетирования. Не вихритесь.
  21. Инкубируют в течение 5 мин при RT и центрифугируют в течение 5 мин при 800 x g. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки для переноса и утилизируйте надлежащим образом.
  22. Чтобы нейтрализовать лизисный буфер, добавьте 10 мл холодного 1x PBS и осторожно перемешайте, пока гранула клеток не распадется.
  23. Центрифугу при 800 x g в течение 5 мин для получения гранул SVF и выброса PBS. На дне тюбика должна быть видна белая дробинка.
  24. Ресуспендировать клетки в 5 мл 1x PBS при РТ путем повторного пипетирования и отфильтровать через три слоя марли в новую коническую пробирку объемом 50 мл. В дальнейшем эти клетки будут использоваться для характеристики субпопуляции макрофагов методом проточной цитометрии.

3. Выделение РНК из зрелых адипоцитов

  1. Подготовьте чистый участок, используя спрей для обеззараживания РНКазы, чтобы избежать деградации РНК. Используйте набор пипеток, предназначенных для процедур с РНК. Все используемые трубки и наконечники не должны содержать РНКазу.
  2. Зрелую суспензию адипоцитов (раздел 2.14) разморозить при 4 °С, если она хранилась до -80 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нескольких циклов замораживания-оттаивания.
  3. Лизируйте клетки, добавив 1 000 мкл реагента на основе кислоты, гуанидиния и фенола, и тщательно перемешайте с помощью микропипетки P1000 для гомогенизации.
  4. Инкубируйте в течение 5 мин при ЛТ для ускорения диссоциации нуклеопротеидных комплексов.
  5. Центрифужный клеточный лизат в течение 5 мин при 12 000 x g при RT. Будут получены три фазы: верхняя фаза (желтая), соответствующая липидам адипоцитов, средняя фаза (розовая), соответствующая нуклеиновым кислотам, и гранула (клеточный мусор).
  6. Осторожно удалите липидный слой с помощью микропипетки P200.
  7. Переложите среднюю фазу в новую пробирку объемом 2 мл, избегая нарушения остатков липидов и гранул (примерно 700 мкл).

4. Очистка общей РНК, в том числе микроРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высококачественной общей РНК используется метод очистки общей РНК на основе колонок.

  1. Добавьте равный объем этанола (95–100%) к образцу из секции 3.7, примерно 700 мкл, и перемешивайте вручную, переворачивая пробирку, в течение 10 с.
  2. Перелейте 700 мкл смеси в колонку, вставленную в сборную трубку, центрифугу и выбросьте проточную жидкость.
  3. Перезагрузите столбец и повторите шаг 4.2.
  4. Переложите колонку в новую сборную трубку.
  5. Добавьте 400 мкл буфера предварительной промывки в колонку и центрифугу. Откажитесь от проточного отверстия и повторите этот шаг.
  6. Добавьте 700 мкл промывочного буфера в колонку и центрифугу в течение 2 минут.
  7. Осторожно переложите колонку в безнуклеазную пробирку.
  8. Добавьте 50 мкл воды, не содержащей нуклеазы, непосредственно в матрицу колонки и элюируйте РНК путем центрифугирования. Приготовьте аликвоты по 10 мкл, используя пробирки для микрофуги объемом 200 мкл.
  9. Сразу же положите аликвоты на лед и используйте один из них для определения концентрации и чистоты РНК.
  10. Приготовьте аликвоту 5 мкл общей РНК, доведенной до 100 нг/мкл, для измерения целостности РНК и концентрации микроРНК.
  11. Хранить при температуре -80 °C до использования.

5. Определение концентрации, чистоты и целостности зрелой РНК адипоцитов; Количественный анализ микроРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Определение концентрации и чистоты РНК выполняется с помощью УФ-ВИД спектрофотометра; Определение целостности РНК и количественное определение микроРНК проводится с помощью анализатора контроля качества РНК.

  1. Промойте считыватель образцов молекулярной водой и протрите.
  2. Загрузите 2 мкл элюирующей воды (пустой), измените настройку на РНК и нажмите кнопку Пусто .
  3. Загрузите 2 мкл образца и нажмите кнопку Измерить .
  4. После завершения считывания запишите соотношение А260/А280 и А260/А230, а также количество РНК (нг/мкл) (рис. 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК с соотношением OD260/OD280 и OD260/OD230 около 2,0 считается чистой.
  5. Измерьте число целостности РНК (RIN) с помощью набора для измерения целостности РНК в соответствии с инструкциями производителя (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: RIN =10 соответствует интактной РНК, в то время как RIN ≤ 3.0 указывает на сильно деградированную РНК. Для экспрессии микрочипов или ОТ-кПЦР используйте РНК с RIN ≥ 6.0.
  6. Для определения концентрации и процентного содержания микроРНК используйте небольшой набор РНК, следуя инструкциям производителя (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать завышения малых и микро РНК, используйте образцы РНК с RIN ≥ 6.0.

6. Количество и жизнеспособность клеток стромально-васкулярной фракции

  1. Развести 10 мкл суспензии SVF-клеток (раздел 2,24) в 90 мкл 0,4% раствора трипанового синего (окончательное разведение 1:10) и нанести 10 мкл на стандартный гемоцитометр.
  2. Тщательно подсчитайте жизнеспособные клетки, исключая мертвые, в четырех квадратах в углу счетной камеры.
  3. Определите концентрацию клеток, присутствующих в исходной суспензии: Концентрация клеток = Общее количество клеток / 4 x коэффициент разведения (10) x 10 000 = Клетки/мл
  4. Чтобы рассчитать полученный клеточный выход (клеток на грамм ткани), умножьте клеточную концентрацию на исходный общий объем образца (в мл) и разделите на вес переваренной ткани (в граммах).
  5. Оцените жизнеспособность клеток в процентах от числа живых клеток следующим образом: % жизнеспособности = (Количество жизнеспособных клеток / Общее количество клеток) x 100.

7. Характеристика субпопуляций макрофагов из стромально-васкулярной фракции

  1. Перенесите в общей сложности 1 x 106 SVF-клеток/мл в полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 5 мл для проточной цитометрии и грануляторных клеток путем центрифугирования при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  2. Осторожно встряхните, чтобы разрыхлить гранулу и повторно суспендировать клетки в 100 мкл 1x PBS при RT.
  3. Добавляют предварительно титрованную оптимальную концентрацию каждого флуорохром-конъюгированного моноклонального антитела, специфичного для антигена поверхности клетки; аккуратно перемешать и инкубировать 15 мин в темноте при РТ.
  4. Добавьте избыток холодного 1x PBS (≈ 1 мл) и центрифугируйте SVF при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  5. Быстро выбросьте надосадочную жидкость путем декантации. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулу.
  6. Добавьте 500 мкл 1x лизирующего раствора и инкубируйте 15 мин при RT, защищая пробирки от прямого света.
  7. После центрифуги удалить раствор при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C и хранить при 2–8 °C в темноте до получения данных.
  8. Тщательно перемешайте клетки на низкой скорости, чтобы уменьшить агрегацию перед получением.
  9. Ресуспендируйте гранулу SVF в 5 мл жидкости оболочки на RT, а затем отфильтруйте через три слоя марли в новую полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 5 мл перед анализом методом проточной цитометрии, чтобы уменьшить засорение линий сортировщика клеток.
  10. Кратковременно взболтайте каждую пробирку перед анализом.
  11. Получение данных из интересующих образцов. Для анализа потока учитывайте не менее 10 000 событий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании проточного цитометра для сортировки клеток отделите макрофаги для применения в последующих исследованиях.

8. Стратегия стробирования

  1. Постройте график высоты или ширины в зависимости от области прямого рассеяния (FSC), чтобы определить синглетную популяцию (рис. 2A).
  2. Выберите ячейки, наносящие область бокового рассеяния (SSC) на FSC, отбрасывая клеточный мусор (рис. 2B).
  3. Из отобранных клеток выделите популяции, экспрессирующие CD45, как гемопоэтические клетки (рис. 2C), а двойные CD45/CD14 — как макрофаги (рис. 2D).
  4. В макрофагах CD45+/CD14+ обнаруживают отрицательные и позитивные клетки HLA-DR (рис. 2E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включите элементы управления компенсацией для панели антител и отрегулируйте спектральное перекрытие на многоцветном проточном цитометре, подходящем для панели. Мы проводим анализ методом проточной цитометрии с помощью цитометра, оснащенного тремя лазерами (405 нм фиолетовый лазер, 488 нм синий лазер и 640 нм красный лазер), а также детекторами для указанных флуорохромов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом протоколе описывается ферментативный метод с использованием расщепления коллагеназы с последующим дифференциальным центрифугированием для выделения в одном процессе жизнеспособных зрелых адипоцитов и SVF-клеток из биопсии НДС, полученной от здоровых беременных женщин после частичной оментэктомии. В этом случае мы используем адипоциты для экстракции РНК и SVF для фенотипирования макрофагов.

Протокол экстракции РНК позволил получить РНК достаточной чистоты высокой целостности, а также мик...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

НДС играет решающую роль в регуляции обмена веществ и воспалении. Растущий интерес к роли адипоцитов и иммунных клеток в хроническом воспалении, связанном с ожирением, привел к разработке различных методов разделения SVF и жировых клеток, присутствующих в АТ. Тем не менее, большинство методов не позволяют получить эти два разных набора клеток, пригодных для последующего применения, из одной и той же биопсии с НДС за одну процедуру, что может иметь решающее значение для исследований взаимодействия между адипоцитами и клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Исследование выполнено при поддержке Национального института перинатологии (номера грантов: 3300-11402-01-575-17 и 212250-3210-21002-06-15) и CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (номер гранта 2015-3-2-61661).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл ПЦР-пробиркиAxygenPCR-02-CРНКаза, ДНКазные и непирогенные
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиAxygenMCT-150-CРНКаза, ДНКазы свободные и непирогенные
10 мл серологические пипеткиCorningCLS4101-50EAИндивидуально упакованные в пластиковую упаковку
10 и микро; L универсальный наконечник для пипеткиAxygenT-300-L-RРНКаза, свободный от ДНКазы и непирогенный
10 & микро; L универсальный наконечник для дозатораAxygenT-300-R-SРНКаза, свободный от ДНКазы и непирогенный
1000 &микро; L универсальный наконечник для пипеткиAxygenT-1000-B-RРНКаза, свободная от ДНКазы и непирогенная
2,0 мл микроцентрифужная трубкаAxygenMCT-200-CРНКаза, свободная от ДНКазы и непирогенная
200 &микро; L универсальный наконечник для дозатораAxygenT-200-Y-RРНКаза, ДНКазный и непирогенный
2100 Биоанализатор ПриборAgilent
G2939BA-2101 Биоанализатор PCAgilentG2953CA2100 Expert Программное обеспечение предустановлено в ПК
5 мл Круглое дно Полистирольная пробиркаCorning352003 Колпачок с кнопками, стерильный
Центрифужные пробирки объемом 50 млCorningCLS430828-100EAПолипропилен, конический донный и стерильный
Реагент на основе кислоты-гуанидиния-фенолаZymo ResearchR2050-1-200TRI Реагент или аналогичный
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-Agilent
Набор малых РНКAgilent5067-1548-APC
/Cy7 античеловеческое антитело к CD14BioLegend3256200,4 мг/106 клеток, присутствует на моноцитах/макрофагах, клон HCD14
Baker--250 мл, нестерильный
бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA3912-100GФракция теплового шока, pH 5,2, ≥ 96%
Станция прайминга чиповAgilent5065-9951-Коллагеназа
типа IIGibco17101-015Порошок
D-(+)-глюкозыSigma-AldrichG8270-100GПорошок
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Поставляется с 50 мл TRI reagen
Рассекающие щипцы--Стальные, зубчатые и круглые
торцы Поддон для препарирования--Нержавеющая сталь
Этиловый спиртSigma-AldrichE7023-500ML200  доказательство, для молекулярной биологии
FACS Flow Tumor FluidBD Biosciences342003-FACS
Лизирующий растворBD Biosciences
349202-FACSAria III Проточный цитометр/сортировщик клетокBD Biosciences
648282-FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868программное обеспечение v6.0 предустановленный
гемацитометрSigmaZ359629-1EA-Ручной
счетчик ячеек---Ножницы
для препарирования Майо-Микроцентрифуга из нержавеющей стали
--Нанофотометр с регулируемой температурой
нанофотометрThermo ScientificND2000LAPTOP-Орбитальный
шейкер--Регулируемая температура и скорость
П10  переменный объем  микропипетки Thermo Scientific-Finnpipette4642040от 1 до 10 μ L
P1000  переменный объем  микропипетки Thermo Scientific-Finnpipette4642090от 100 до 1000 мкм; L
P2  переменный объем  микропипетки Thermo Scientific-Finnpipette46420100,2 до 2 мкм; L
P200  переменный объем  микропипетки Thermo Scientific-Finnpipette4642080от 20 до 200 μ L
Штатив для хранения пробирокAxygenR96PCRFSP-PE
/Cy5 античеловеческое антитело HLA-DRBioLegend3076080,0625 мг/106 клеток, присутствующих на макрофагах, клонирует L243
PE/Cy7 античеловеческое антитело CD45BioLegend3040160,1 мг/106 клеток, присутствующих на лейкоцитах, клон H130
Фосфат буферизованный физиологическим растворомSigma-AldrichP3813-10PAKПорошок, pH 7,4, для приготовления 1 л растворов
Контроллер пипетки---
Буфер для лизиса эритроцитовRoche11 814 389 001Для преимущественного лизиса эритроцитов из цельной крови человека
Охлаждаемая центрифуга--Адаптер Уайта для конических пробирок объемом 50 мл
Контейнер для стерильных образцов--- T
Переводная пипеткаThermo Scientific-Samco204-1SSterile
Trypan BlueGibco15250-0610,4% раствор
Тубы штативы--Для различных размеров пробирок
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-
-, .

Ссылки

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403(2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613(2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202(2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015(2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88(2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074(2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017(2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457(2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282(2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321(2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54(2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610(2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59(2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693(2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212(2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115(2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807(2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683(2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514(2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение жизнеспособных адипоцитов и стромально-васкулярной фракции из висцеральной жировой ткани человека, пригодных для анализа РНК и фенотипирования макрофагов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.