Ультразвуковое исследование с высоким разрешением может помочь упростить эксперименты, требующие беременных мышей, определяя состояние беременности, гестационный возраст и потери беременности. Здесь представлен протокол для иллюстрации методов оценки беременности на мышах, а также потенциальных ловушек (артефактов изображения), которые могут имитировать беременность.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Моя мышь беременна? Высокочастотная ультразвуковая оценка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мышь является предпочтительной моделью млекопитающих для многих заболеваний и биологических процессов человека. Биология развития часто требует поэтапной беременности мышей для определения эволюционирующих процессов в различные моменты времени. Кроме того, оптимальное и эффективное разведение модельных мышей требует оценки своевременной беременности. Чаще всего мышей спаривают на ночь, и определяется наличие влагалищной пробки; однако положительная прогностическая ценность этого метода неоптимальна, и нужно подождать, чтобы узнать, действительно ли мышь беременна. Ультразвуковая биомикроскопия высокого разрешения является эффективным и действенным инструментом для визуализации: 1) беременна ли мышь; 2) Какой гестационной стадии достигла мышь; и 3) Есть ли внутриутробные потери. В дополнение к эмбрионам и плодам, исследователь должен также распознать общие артефакты в брюшной полости, чтобы не принять их за гравидную матку. В этой статье представлен протокол для создания изображений, а также иллюстративные примеры.
Введение
Мышь является предпочтительной моделью млекопитающих для многих заболеваний человека и биологических процессов1,2,3,4. Исследования в области биологии развития часто требуют поэтапной беременности мышей для определения эволюционирующих процессов в различных временных точках5,6,7,8. Кроме того, оптимальное и эффективное разведение модельных мышей требует оценки своевременной беременности, особенно когда исследователи изучают влияние мутации гена на развитие. Как правило, исследователи спаривают гетерозиготных мышей на ночь, ищут вагинальную пробку рано утром следующего дня и надеются, что беременность наступит9. Определение внутриутробной потери обычно начинается с проверки помета новорожденного на менделевские соотношения генотипов, затем работает в обратном направлении, принося в жертву беременных мышей на различных гестационных стадиях и восстанавливая эмбрионы. Исследователи могут определить увеличение веса как показатель положительной беременности10,11; однако, особенно у генетически модифицированных мышей, пометы могут быть очень маленькими и впоследствии рассасываться, когда происходит внутриутробная потеря, из-за которой увеличение веса может быть неочевидным (особенно на ранних сроках беременности, ~ E6,5-8,5). Мышь может оказаться ложно беременной из-за, например, доброкачественной опухоли брюшной полости. По сути, человек работает «вслепую».
Ультразвуковая биомикроскопия высокого разрешения позволяет проводить прямую визуализацию гравидной матки и развивающихся эмбрионов мышей12,13,14,15,16. Хотя мы изначально разработали методы оценки сердечно-сосудистой физиологии эмбриональных мышей16,17,мы признали полезность этого метода визуализации для оптимизации нашего разведения мышей. В частности, нам больше не нужно было ждать, чтобы «увидеть», беременна ли мышь, основываясь либо на очевидном прибавке в весе, либо на родах помета; мы могли бы определить состояние гравида и быстро спаривать мышей, если дамба не была беременна. Кроме того, внутриутробные потери также могут быть легко визуалированы, и временная шкала потери может быть определена без ущерба для мыши (см. Рисунок 1 для схемы). Таким образом, можно сэкономить время, ценных модельных мышей и средства.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все шаги в этом протоколе соответствуют Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованному Национальными институтами здравоохранения, и были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Медицинской школы Гроссмана Нью-Йоркского университета.
1. Спаривание мышей при своевременной беременности
- Соедините подходящую самку мыши (обычно гетерозиготную) в клетке с соответствующим самцом мыши (обычно гетерозиготой) для ночного спаривания.
- Отделите мышей на следующее утро. В качестве альтернативы, непрерывно спариваться самки и самцов мышей, тем самым увеличивая шансы на беременность.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тем не менее, точно скорпорированная беременность не может быть гарантирована с альтернативой, и постановка эмбрионов мышей с помощью ультразвука не ясна, особенно когда процесс заболевания приводит к задержке внутриутробного роста. Если предполагается, что эмбрионы, несущие вариант гена, маленькие, ищите более крупных однопометников дикого типа, чтобы измерить гестационный возраст.- Необязательно: Найдите вагинальную пробку. Если влагалищной пробки нет, самка мыши не была спаривания. Если есть вагинальная пробка, все равно вероятно, что самка мыши не забеременеет.
- Время на следующий день после ночного спаривания - Е0,5.
- Выполните визуализацию на E6.5–E.8.5 для определения беременности и повторно спаривайте мышей, если мышь не беременна (см. шаг 1.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе женская плотина явно не беременна глазом; следовательно, ультразвуковая визуализация позволяет на ранней стадии определить и повторно спариваться.
2. Анестезия и подготовка мыши
- Поместите беременную мышь в анестетиковую индукционную камеру.
- Смешайте изофлуран с воздухом в помещении или медицинским кислородом в концентрации 2%-3% при скорости потока 1 л/мин, чтобы вызвать сакдацию беременной мыши в индукционной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сакдацией обычно является 1–2 мин. Мышь будет лежать неподвижно, и ее дыхание замедлится. - Быстро перенесите мышь на платформу обработки изображений. Платформа визуализации обычно также имеет нагревательные элементы, которые могут помочь сохранить мышь в тепле.
- Поместите нос мыши в анестетик носовой конус.
- Быстрое изменение маршрута смеси изофлуран/кислород к носовой конусу платформы визуализации. Поддерживают изофлуран на уровне 2%–3% при расходе 1 л/мин.
- Определите уровень ускупа по ущемлению лапы, рефлексу роговицы, уровню дыхания и любым движениям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс роговицы можно первоначально определить, нанеся увлажняющую мазь на глаза, чтобы они не высохли, пока мышь анестезируется (мышь не закрывает глаза). - Когда мышь лежит лежа на спине (на спине), прикрепите лапы к подушечкам электрокардиограммы (ЭКГ) платформы визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Однако ЭКГ не является необходимой для такого рода визуализации. - Удалите мех с живота беременной дамы следующим образом:
- Тщательно смочите брюшную шерсть 70% этанолом, в том числе до боковых краев. Не наносите столько, чтобы на платформу был сток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол лучше работает в качестве смазки для бритья, чем вода. - Используйте лезвие бритвы, чтобы тщательно побрить живот. Будьте осторожны, чтобы не разрезать соски.
- Вытрите бритый мех с живота марлей или салфетками.
- В качестве альтернативы, используйте крем для депиляции после использования кусачки для меха, чтобы удалить большую часть меха.
- Тщательно смочите брюшную шерсть 70% этанолом, в том числе до боковых краев. Не наносите столько, чтобы на платформу был сток.
3. Трансабдоминальная визуализация (предполагаемой) беременной мыши
- После бритья брюшной полости уменьшают изофлуран до 1%–1,5%, сохраняя скорость потока 1 л/мин. Следите за уровнем уседачи по уровню дыхания и любым движениям, а также по защемлению лап и/или рефлексу роговицы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота сердечных сокращений анестезируемой мыши обычно составляет 400–500/мин, в зависимости от температуры ядра (ректальной). С целью быстрой проверки беременности не нагревайте мышь до физиологической температуры ядра; частота сердечных сокращений будет ближе к 400-450 / мин, но может упасть еще больше с нерегулярным ритмом, если мышь замерзнет при длительной визуализации.- Важно убедиться, что дыхание умеренное по глубине и регулярности, а не ненерционное или агональное (задыхание: глубокое, медленное и неустойчивое, с глубокими межреберными и подреберными втягиваниями).
ПРИМЕЧАНИЕ: Частота дыхания невентилируемой, анестезируемой мыши обычно составляет 60–100/мин. См. https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html и https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice.
- Важно убедиться, что дыхание умеренное по глубине и регулярности, а не ненерционное или агональное (задыхание: глубокое, медленное и неустойчивое, с глубокими межреберными и подреберными втягиваниями).
- Нанесите ультразвуковой (акустический) гель на живот обильно.
- Поместите преобразователь изображения на брюшную полость, чтобы сориентировать ее в горизонтальной плоскости: сориентировать зонд для получения ориентации влево-вправо на системе визуализации; «точка» или гребень, указанные на стороне зонда визуализации, должны быть обращены вправо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скольжение зонда изображения вправо от мыши должно сместить соответствующее изображение на ультразвуковой системе вправо от мыши (представьте, что вы смотрите «вверх» с хвоста мыши — справа от мыши будет оставлено на мониторе).- Как правило, используйте крепление преобразователя системы визуализации и систему манипулятора рельсами. Здесь была использована визуализация «свободной руки», в которой датчик изображения держится вручную (две руки устойчивее, чем одна) и которая позволяет более быстрые движения вокруг живота. Эти движения, как будет описано ниже, включают как вращательные, так и поступательные движения. Однако это требует больше практики.
- Определите мочевой пузырь на экране(Видео 1).
- Сканируя каудально из мочевого пузыря, идентифицируем влагалище. Затем, сканируя медленно и плавно в черепном направлении, выявляют бифуркацию влагалища в левый и правый рога матки(рисунок 2; Видео 1).
- Начало обследования матки (левого и правого рогов матки)13 (рисунок 3; Видео 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: До середины беременности (E10.5 или E11.5) эмбрионы мышей будут расположены вдоль правой и левой периферии. По мере их роста более дистальные части матки и соответствующие им эмбрионы будут поворачиваться наружу и к задней части. По мере дальнейшего роста эмбрионов (E15.5 и позже, как правило) плоды мышей будут располагаться почти случайным образом в различных направлениях, и становится трудно «отследить» матку от проксимального до дистального.- Быстро сканируйте, чтобы проверить, беременна ли мышь или нет. Этот быстрый метод требует только распознавания гравидной матки и эмбрионов мыши.
- Кроме того, потратьте дополнительное время на перечисление эмбрионов (живых, мертвых, рассасывшихся) в каждом маточном роге.
ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, живой эмбрион будет демонстрировать различные органы, такие как сердце, конечности, голова с желудочками и глаза. Мертвый эмбрион приобретает однородный, «кашеобразный» вид, если только он не мертв. Рассасывая эмбрионы имеют точечное эхогенное пятно в середине гравидной матки(Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8). - Чтобы определить, действительно ли эмбрион жив, ищите сердцебиение и / или кровоток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Картирование цветного допплеровского потока может помочь в определении наличия кровотока, как у эмбриона, так и в пуповине. В целом, это может быть применено к эмбрионам старше E8.5. - Распознавать потенциальные артефакты, которые могут имитировать гравидную матку(рисунок 9, рисунок 10). Кроме того, поскольку газ кишечника и другие ультразвуковые «теневые» артефакты могут затемнять сегменты маточного рога, выполняют визуализацию с нескольких точек зрения, чтобы обеспечить адекватную визуализацию матки.
- После того, как обследование будет завершено, протрите гель с живота марлей или салфетками. Постарайтесь удалить как можно больше, так как гель имеет тенденцию охлаждать мышь.
- Расстежните лапы и извлеките мышь из анестезирующего носового конуса.
- Осторожно переместите мышь обратно в ее клетку. Она должна проснуться и начать двигаться в течение минуты или около того.
ПРИМЕЧАНИЕ: Генетически модифицированным мышам может потребоваться немного больше времени, чтобы восстановиться после анестезии, и за ними нужно следить более внимательно.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол позволит исследователю уверенно определить, беременна ли мышь, в том числе на ранних стадиях, и определить, есть ли очевидные пренатальные эмбриональные или фетальные потери без необходимости жертвовать беременной дамбой. Этот протокол особенно полезен при разведении генетически модифицированных мышей; Как правило, гетерозиготные х гетерозиготные скрещивки с выходом гомозиготного потомства приводят к сбою правильного развития, что вызывает пренатальную летальность. На рисунке 1...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее важным первым шагом в визуализации является идентификация влагалища, а затем определение раздвоения маточного рога влево и вправо. Следуя за каждым маточным рогом, имиджер с меньшей вероятностью неправильно идентифицирует петли кишечника как матку. Кроме того, понимание различий во внешнем виде кишечника (с / без фекалий) важно отличать их от матки; иногда фекальные «шарики» в петлях кишечника могут имитировать гравидную (беременную) матку. Хотя другие авторы описали диагностику беременности и этапы эмбрионально...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| для депиляции | |||
| Этанол, 70% | |||
| Машинки | |||
| Марля или KimWipes | |||
| Изофлуран | |||
| Медицинский кислород (опционально) | |||
| Медицинская лента | |||
| Система визуализации мыши (включая настройку для анестезии и платформу визуализации) | Fujifilm Visual Sonics | Различные | Любая система с зондом ультразвукового преобразователя центральной частоты 40 МГц |
| Лезвие бритвы (не безопасная бритва) | |||
| Весы (для взвешивания мыши) | |||
| Гель |
Ссылки
- Bogue, M. A., et al. Mouse Phenome Database: an integrative database and analysis suite for curated empirical phenotype data from laboratory mice. Nucleic Acids Research. 46, 843-850 (2018).
- Ito, R., Takahashi, T., Ito, M. Humanized mouse models: Application to human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3723-3728 (2018).
- Law, M., Shaw, D. R. Mouse Genome Informatics (MGI) is the international resource for information on the laboratory mouse. Methods in Molecular Biology. 1757, 141-161 (2018).
- Rydell-Törmänen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods in Molecular Biology. 1940, 3-22 (2019).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Reviews of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
- Tam, P. P. L., et al. Formation of the embryonic head in the mouse: attributes of a gene regulatory network. Current Topics in Developmental Biology. 117, 497-521 (2016).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Letters. 590 (22), 3965-3974 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Selecting female mice in estrus and checking plugs. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (8), (2016).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- Finlay, J. B., Liu, X., Ermel, R. W., Adamson, T. W. Maternal weight gain as a predictor of litter size in Swiss Webster, C57BL/6J, and BALB/cJ mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 694-699 (2015).
- Zhou, Y. Q., et al. Applications for multifrequency ultrasound biomicroscopy in mice from implantation to adulthood. Physiological Genomics. 10 (2), 113-126 (2002).
- Ji, R. P., Phoon, C. K. L. Noninvasive localization of nuclear factor of activated T cells c1-/- mouse embryos by ultrasound biomicroscopy-Doppler allows genotype-phenotype correlation. Journal of the American Society of Echocardiography. 18 (12), 1415-1421 (2005).
- Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-117 (2006).
- Mu, J., Slevin, J. C., Qu, D., McCormick, S., Adamson, S. L. In vivo quantification of embryonic and placental growth during gestation in mice using micro-ultrasound. Reproductive Biology and Endocrinology. 6, 34(2008).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Cardiovascular imaging in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 15-38 (2016).
- Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Ultrasound biomicroscopy-Doppler in mouse cardiovascular development. Physiological Genomics. 14 (1), 3-15 (2003).
- Peavey, M. C., et al. A novel use of three-dimensional high-frequency ultrasonography for early pregnancy characterization in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (128), e56207(2017).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), 77205(2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kühl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).
- Norton, W. B., et al. Refinements for embryo implantation surgery in the mouse: comparison of injectable and inhalant anesthesias - tribromoethanol, ketamine and isoflurane - on pregnancy and pup survival. Laboratory Animal. 50 (5), 335-343 (2016).
- Thaete, L. G., Levin, S. I., Dudley, A. T. Impact of anaesthetics and analgesics on fetal growth in the mouse. Laboratory Animal. 47 (3), 175-183 (2013).
- Phoon, C. K. L., et al. Tafazzin knockdown in mice leads to a developmental cardiomyopathy with early diastolic dysfunction preceding myocardial noncompaction. Journal of the American Heart Association. 1 (2), (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
