Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сбор образцов и анализ микробиома двенадцатиперстной кишки

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61900

⸱

12 января 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Hepatology and Parenteral Nutrition, Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 2The Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, 3UCLA Microbiome Center, David Geffen School of Medicine at University of California, 4Department of Surgery, University of California, Los Angeles, 5Department of Medicine and Human Genetics, David Geffen School of Medicine at University of California, 6Cedars-Sinai Cancer and Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи мы обсуждаем новый метод отбора проб и анализа микробиома двенадцатиперстной кишки. Этот метод обеспечивает точное изображение микробного разнообразия и состава в двенадцатиперстной кишке и может быть полезен для дальнейшего исследования микробиома двенадцатиперстной кишки.

Аннотация

Сдвиги в микробиоме коррелируют с физиологией и патофизиологией многих систем органов как у людей, так и у мышей. Микробиом кишечника обычно изучается с помощью коллекций образцов кала. Легкость получения образцов кала привела к проведению многих исследований, которые выявили информацию о дистальном отделе люминального желудочно-кишечного тракта. Тем не менее, немногие исследования рассматривали важность микробиома в проксимальном отделе кишечника. Учитывая, что двенадцатиперстная кишка является основным местом пищеварения и всасывания, ее микробиом имеет отношение к питанию и заболеваниям печени и требует дальнейшего изучения. В данной статье мы подробно описываем новый метод отбора проб микробиома проксимального просвета и слизистой оболочки кишечника у людей, проходящих эндоскопию верхних отделов кишечника, путем получения дуоденального аспирата и биопсии. Забор образцов является легким и не зависит от таких артефактов, как прилегание пациента к подготовительной работе, как это может быть в случае получения образцов толстой кишки во время колоноскопии. Предварительные результаты показывают, что микробиомы люминальных и слизистых оболочек существенно различаются, что, вероятно, связано с условиями окружающей среды и барьерными функциями. Таким образом, комбинация дуоденального аспирата и биопсии позволяет получить более полную картину микробиома в двенадцатиперстной кишке. Биопсия берется из нисходящего и горизонтального сегментов двенадцатиперстной кишки, которые анатомически близки к печени и желчевыводящему дереву. Это важно для изучения роли биологии желчных кислот и оси кишечник-печень в заболеваниях печени. Биопсия и аспират могут быть использованы для секвенирования 16S рибосомальной РНК, метаболомики и других подобных приложений.

Введение

В последние годы микробиом кишечника стал областью повышенного интереса. В настоящее время понятно, что разнообразная бактериальная популяция в кишечнике может различаться в зависимости от множества факторов, включая генетику, диету, лекарства и влияние окружающейсреды. Исследования также выявили уникальные микробные профили, связанные с различными желудочно-кишечными заболеваниями, такими как ожирение, воспалительные заболевания кишечника и заболевания печени 2,3. Большинство исследований сосредоточены на профилировании микробиома толстой кишки путем анализа образцов кала и дистальных отделов слизистой оболочки4. Несмотря на то, что самая высокая концентрация кишечных бактерий находится в толстой кишке (10-12 бактерий/грамм), тем не менее, существует сложное сообщество микробов, обитающих в двенадцатиперстной кишке (103/г), тощей кишке (104/г) и подвздошной кишке (107 г), которые играют ключевую роль в пищеварительном метаболизме и всасывании.

Тонкая кишка служит основным местом расщепления и всасывания питательных веществ в желудочно-кишечном тракте. Комменсальные бактерии, выстилающие тонкую кишку, играют фундаментальную роль в содействии химическому расщеплению пищевых субстратов и высвобождении биологически активных соединений, способствующих усвоению питательных веществ6. Эти взаимодействия способствуют формированию сложной среды микроб-микробной активности и активности хозяина-микроба в тонком кишечнике7. Исследование, в котором изучалась микробиота тонкого кишечника на мышиных моделях, показало, что у стерильных мышей, которых кормили пищей с высоким содержанием жиров, нарушалось всасывание липидов, но при колонизации микробиотой тощей кишки наблюдалось прямое увеличение абсорбции липидов6. Пилотное исследование на людях по изучению микробиоты двенадцатиперстной кишки у людей с ожирением и здоровых людей показало, что в микробиоте двенадцатиперстной кишки людей с ожирением наблюдаются изменения в путях распада жирных кислот и сахарозы, вероятно, вызванные зависимостью от диеты8. Кроме того, дисбиоз микробиоты тонкой кишки был выявлен при нескольких заболеваниях, включая избыточный бактериальный рост в тонком кишечнике, синдром короткой кишки, резервуарный илеит, кишечную дисфункцию окружающей среды и синдром раздраженного кишечника7.

Нас интересует взаимосвязь между микробиомом и различными стадиями хронического заболевания печени. В частности, двенадцатиперстная кишка служит первым местом химического расщепления и всасывания питательных веществ в тонком кишечнике. Кроме того, портальное печеночное кровообращение доставляет питательные вещества и метаболиты в печень, где они перерабатываются и регулируются в кровоток. Анатомическая близость кишечника и печени создает среду, восприимчивую к провоспалительным реакциям, которые могут возникнуть из-за сбоя в кишечном барьере или изменений в микробиоме кишечника9. Исследования, изучающие микробиом и прогрессирование заболеваний печени, выявили микробный дисбиоз у пациентов с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), стеатогепатитом (НАСГ), алкогольной болезнью печени и циррозомпечени 10,11. В то время как большинство исследований характеризуют микробиом толстой кишки, мы были заинтересованы в изучении микробиома тонкой кишки в связи с заболеваниями печени. Используя представленный здесь новый метод, мы идентифицировали уникальные микробные профили двенадцатиперстной кишки у пациентов с циррозом печени в отношении диеты12.

Поскольку характеристика микробиома тонкой кишки продолжает вызывать повышенный интерес, необходимо разработать единые методы получения образцов, которые точно представляют микробиоту тонкой кишки. Тем не менее, существуют проблемы, связанные с получением образцов, которые усложняют изучение микробиома тонкой кишки. Современные методы отбора проб требуют инвазивных процедур, которые часто подвержены загрязнению, как описано в Kastl et al7. В данной статье мы подробно описываем новый метод получения дуоденального аспирата и биопсии для микробного анализа у пациентов с заболеваниями печени, проходящих эзофагогастродуоденоскопию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Образцы двенадцатиперстной кишки были получены в Системе здравоохранения Большого Лос-Анджелеса, Медицинском центре Седарс-Синай и Медицинском центре Рональда Рейгана в Калифорнийском университете в Лос-Анджелесе после того, как клинический протокол исследования микробиома, микробных маркеров и заболеваний печени (M3LD) был принят институциональным наблюдательным советом местного комитета по этике. Письменное информированное согласие было получено от всех участвующих пациентов.

1. Согласие участников

  1. Подходить к субъектам с диагнозом цирроз печени любой этиологии с эндоскопией, назначенной для скрининга варикозно расширенных вен или портальной гипертензии для рекрутинга. Исключить пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК).
  2. Представьте исследование, внимательно обеспечьте понимание участников и спросите их, не хотят ли они добровольно принять участие в исследовании. Заполните форму информированного согласия, если они согласны.
  3. Убедитесь, что эндоскопию выполняет должным образом обученный и сертифицированный медицинский работник.

2. Сбор образцов

  1. Обезболить пациента 50 мг фентанила и 2 мг мидазолама. Увеличивайте дозировку по мере необходимости до тех пор, пока пациент не получит умеренную анестезию и не сможет переносить эндоскоп.
  2. Введите эндоскоп (например, Pentax EG29-i10) в пищевод пациента и продвигайтесь к привратнику.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер эндоскопа будет варьироваться в зависимости от физиологии пациента. Не используйте эндоскоп для аспирации перед сбором образца, чтобы избежать загрязнения канала эндоскопа желудочным или ротоглоточным секретом.
  3. Возьмите предметное стекло для микроскопа и затупите иглу шприца 18 калибра, чтобы подготовиться к забору образца. Подготовьте стерильную прокладку, которая будет использоваться для переноса биопсии со предметного стекла микроскопа на криовалиал.
  4. Когда эндоскоп достигнет второй части двенадцатиперстной кишки дистальнее ампулы Фатера, аспирируйте любую присутствующую жидкость через стерильный одноразовый аспирационный катетер, пропущенный через рабочий канал верхнего эндоскопа, и соберите ее в одноразовый контейнер для образцов объемом 40 мл. Смойте до 30 мл дополнительной стерильной воды с помощью шприца в двенадцатиперстную кишку и аспирируйте жидкость в ловушку для жидкостей для образцов, чтобы собрать в общей сложности 15 мл.
  5. Немедленно снимите и закройте аспирационный контейнер, прикрепленный к аспирационному компоненту катетера. Поместите контейнер в термос со льдом и в сумку для транспортировки образцов для транспортировки в лабораторию обработки.
  6. Введите одноразовые биопсийные щипцы диаметром 2,8 мм в порт на боковой стороне эндоскопа для забора образцов тканей для исследования. Выполните 2 случайных прохода щипцов в пределах второй части двенадцатиперстной кишки, собирая по два кусочка ткани в каждый проход.
  7. С помощью тупой иглы шприца 18 калибра извлеките образцы ткани из щипцов на предметное стекло микроскопа, прежде чем перенести образцы в четыре отдельных пустых криовалиала объемом 2 мл. Плотно закрутите крышки.
  8. Вставьте все 4 плотно закрытых криовалиала в пустую емкость, например, в чашку для мочи, и создайте ванну, состоящую из 20 мл этанола и сухого льда, чтобы мгновенно заморозить биопсию.
  9. Поместите криополиальные биоптаты в изолированный контейнер из пенополистирола на слой сухого льда и перенесите образцы в морозильную камеру при температуре -80 °C для длительного хранения, чтобы сохранить образцы.

3. Обработка аспирата

  1. После сбора биообразцов они сразу же передаются в лабораторию BSL2 или выше для обработки.
  2. Аккуратно переверните емкость с аспиратной жидкостью четыре раза, а затем распределите примерно 1,5 мл жидкости на 2 мл криоциалов.
  3. Храните образцы при температуре -80 °C до тех пор, пока не будет выполнен анализ партии.

4. Анкетирование и сбор клинических данных

  1. Попросите участников заполнить анкеты, чтобы получить информацию о питании, демографии, привычках курения/алкоголя, заболеваниях/лекарствах и качестве жизни13.
  2. Просматривайте медицинские карты для сбора клинических данных, включая клинические лабораторные анализы, данные визуализации, лекарства и медицинские осложнения.

5. Экстракция ДНК

  1. Немедленно после удаления биопсии двенадцатиперстной кишки провести экстракцию ДНК и аспират из хранилища при температуре -80 °C. Никаких подготовительных этапов для извлечения ДНК из образцов биопсии двенадцатиперстной кишки не требуется.
  2. Проведите экстракцию и секвенирование ДНК для всех образцов в один и тот же день, чтобы снизить риск эффекта партии при анализе. Настройте библиотеку, специфичную для собранных образцов, прежде чем образцы будут секвенированы.
  3. Используйте набор для микроподготовки ДНК для извлечения ДНК из образцов биопсии двенадцатиперстной кишки в соответствии с протоколом производителя14.
  4. Добавьте максимальное количество образца в соответствии с рекомендациями протокола в пробирку для лизиса, содержащую 750 μл раствора для лизиса, и 0,7 мл сухого объема стеклянных шариков диаметром 2 мм.
  5. Закрепите трубки для лизиса в бисере с держателем трубки и запустите венчик на максимальной скорости не менее пяти минут. Время будет варьироваться в зависимости от взбивателя бисера и анализируемого образца.
  6. Центрифугируйте пробирки для лизиса в микроцентрифуге при давлении 10 000 x g в течение 1 мин.
  7. Пропустите до 400 μл надосадочной жидкости через отфильтрованную сборную пробирку и снова центрифугируйте при 8000 x g в течение 1 минуты.
  8. Добавьте 1200 мкл связующего буфера в фильтрат в микроцентрифужной пробирке и тщательно перемешайте до однородности.
  9. Переведите 800 μL смеси в спиновую колонку и трубку в сборе. Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 1 мин. Откажитесь от проточного потока.
  10. Поместите спиновую колонку на новую центрифужную пробирку с 400 мкл буфера для промывки ДНК и тщательно перемешайте до однородности. Центрифугируйте при давлении 10 000 x g в течение 1 мин. Откажитесь от проточного потока.
  11. Повторите шаг 5.10 два раза, используя 700 μл, а затем 200 μл буфера для промывки ДНК на одну промывку.
  12. Добавьте 20 мкл элюирующего буфера в спиновую колонку в новой центрифужной пробирке. Инкубируйте в течение одной минуты, затем центрифугируйте при 10 000 x g в течение 1 минуты для элюирования ДНК. Откажитесь от столбца.
  13. Снова отфильтруйте ДНК. Теперь ДНК готова к амплификации методом ПЦР.

6. Амплификация ДНК

  1. Выполнить ПЦР-амплификацию V4-области гена 16S рибосомальной РНК путем 250 × 2-го парного секвенирования на секвенаторе aMiSeq, HiSeq или NovaSeq15.
  2. Создайте 96-луночную грунтовочную пластину. Создайте мастер-смесь из 165 μL консервированного предварительного праймера ILHS_515f (100 мМ запаса) и 2970 μL воды молекулярно-биологического качества. Добавьте по 28,5 мкл этой смеси в каждую лунку.
  3. Добавьте 1,5 мкл соответствующего обратного праймера из 96-луночного планшета со штрих-кодом IL_806r уникальными праймерами (100 мкМ стока). Эти штрих-коды будут идентифицировать уникальные образцы пациентов.
  4. Создайте мастер-смесь из воды (23,1 мкл x 3,3 x количество образцов), буфера для ПЦР (3 μL x 3,3 x количество образцов), dNTP (0,6 μL x 3,3 x количество образцов) и ДНК-полимеразы JumpStart Taq (0,3 μL x 3,3 x количество образцов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: 16S амплификацию ДНК следует проводить в трех экземплярах.
  5. Добавьте 81 мкл мастер-смеси в каждую лунку в первой 96-луночной пластине. Добавьте в каждую лунку 6 μл ДНК и 3 мл праймерной смеси. С помощью многоканальной пипетки P200 перемешайте лунки, затем нанесите 30 мкл в соответствующую лунку каждого из двух других ПЦР-планшетов. Запечатайте пластину.
  6. Используйте следующие настройки термоамплификатора: 94 °C x 3 мин; 35 циклов: 94 °C x 45 с, 50 °C x 1 мин, 72 °C x 1,5 мин. После 35 циклов: 72 °C x 10 мин, 94 °C x 5 мин, 4 °C бесконечно.

7. Очистка и настройка библиотеки

  1. Используйте набор для очистки ПЦР или ДНК для очистки продуктов ПЦР. Разбавьте ДНК 30 μл воды класса PCR (обработанной DEPC).
  2. Используйте спектрофотометр УФ-видимого спектра, который имеет возможность количественного определения образцов ПЦР.
  3. Откройте программу спектрофотометра на рабочем столе компьютера. Нажмите на нуклеиновую кислоту.
  4. Протрите порт дистиллированной водой. Добавьте 1 мкл 1x PCR буфера/воды в порт и откалибруйте.
  5. Введите идентификатор образца и нанесите пипетку объемом 1 мкл образца в порт.
  6. Закройте порт и нажмите Измерить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха при добавлении образцов в порт.
  7. Сотрите образец с помощью лабораторных салфеток и дистиллированной воды, а затем подготовьте следующий образец. Записывайте значения для каждого образца. Компьютер также должен автоматически сохраняться.
  8. Соедините по 250 нг каждого амплифицированного продукта ПЦР в 1 пробирке. Это и есть библиотека ДНК.
  9. Доставьте библиотеку вместе с материалами для чтения 1 и 2 и праймерами по индексному секвенированию в лабораторию секвенирования для секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если местная лаборатория недоступна, для этого этапа можно использовать коммерческую лабораторию секвенирования.

8. Форматирование данных

  1. Данные секвенирования предоставляют результаты в прямых и обратных файлах .fastq. Преобразуйте эти данные в таблицу данных и очистите их, чтобы их можно было проанализировать для последующих приложений.
  2. Откройте программу программирования R. Следуйте инструкциям и коду, перечисленным в дополнительном файле кодирования, чтобы продолжить работу по конвейеру DADA2 и очистить данные секвенирования ДНК16. Загрузите справочную базу данных SILVA для назначения таксономии после того, как последовательности были пропущены через конвейер17.
  3. Вкратце, загрузите пакет DADA2 в R. Определите путь, по которому все файлы .fastq будут сохранены в одном каталоге, и извлеките файлы в R.
  4. Прочитайте имена файлов fastq и сопоставьте списки файлов прямого и обратного fastq.
  5. Проверьте качество прямых и обратных считываний.
    Примечание: Нуклеотидные последовательности могут быть усечены для поддержания высокого качества последовательностей.
  6. Отфильтруйте и обрежьте файлы fastq. Используйте метод learnErrors для изучения параметрической модели ошибок, используемой DADA2. Это покажет наблюдаемую и ожидаемую частоту ошибок для каждой возможной замены нуклеотидов (A → C, A → T, A → G и т. д.).
  7. Примените алгоритм вывода выборки, чтобы определить количество уникальных последовательностей в каждой выборке, и дополнительно проверьте объект класса dada, чтобы получить количество истинно уникальных вариантов в выборке.
  8. Объедините прямое и обратное чтение для получения полных и шумоподавленных последовательностей.
  9. Постройте таблицу вариантов ампликонной последовательности (ASV).
  10. Удалите химеры со стола ASV. Химерные последовательности — это одна последовательность, возникающая в результате двух более распространенных родительских последовательностей.
  11. Отслеживайте общее количество операций чтения, прошедших через конвейер. DADA2 будет использовать SILVA для присвоения таксономии каждой уникальной последовательности. Точность может быть проанализирована путем включения сообщества известных последовательностей бактерий в конвейер DADA2 и сравнения вариантов последовательностей DADA2 с ожидаемым составом сообщества.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные секвенирования ДНК теперь очищены и готовы к анализу в зависимости от конкретного объема и целей исследовательского проекта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Популяционные различия между слизистой оболочкой и микробиомом просвета проксимального отдела кишечника
В предыдущих исследованиях были обнаружены различия в микробных популяциях образцов просвета и слизистой оболочки толстой кишки 4,5,18. Предварительные результаты показывают, что образцы дуоденального аспирата и биопсии могут измерять микробиоту как люминальной, так и слизистой оболочки в проксимальном отде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования микробиома невероятно важны, поскольку эта сложная экосистема играет решающую роль в энергетическом гомеостазе, иммунологических реакциях и метаболизме. Существуют региональные различия в микробиоме, которые могут отражать различные физиологические функции различных областей желудочно-кишечного тракта, которые могут влиять на различные состояния заболевания20. Чаще всего изучается фекальный микробиом, но в последнее время изуча...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых конфликтов интересов, о которых можно было бы сообщить.

Благодарности

Это исследование было профинансировано грантом Национального института здравоохранения/Национального института рака No RO1CA204145.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 мл криовалиалCorning430659
96-луночные планшетыПрикладные биосистемы4306737
dNTPsSigmaD7295
Сухой ледПредоставлен учреждением
Эндоскоп EG29-i10PentaxN/AРазмер эндоскопа может варьироваться в зависимости от физиологии пациента
Микропланшет Epoch спектрофотометрBiotekN/A
ЭтанолSigma Aldrich676829
HiSeq 2500IlluminaN/A
IL_806r обратный праймерIDT ДНК пользовательскиепраймеры
ILHS_515f форвардный праймерIDT DNA технологиикастомныепраймеры
JumpStart Taq DNASigmaD4184
Ловушка для образцовслизи Busse Hospital Disposables40540 куб. см ловушка для образцов с транспортировочным колпачком
Nanodrop Gen5 программное обеспечениеThermoFisher Scientific
PCR bufferSigmaP2192
набор для очистки ПЦРZymo ResearchD4204
Radial Jaw 4 Jumbo ЩипцыBoston ScientificM00513343Наружный диаметр челюсти 2,8 мм
Диетический опросник VioCareN/A
ZymoBIOMICS DNA Microprep KitZymo ResearchD430025 мкг связывающая способность

Ссылки

  1. Kau, A., Ahern, P., Griffin, N., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474, 327-336 (2011).
  2. Young, V. B. The intestinal microbiota in health and disease. Current Opinion in Gastroenterology. 28 (1), 63-69 (2012).
  3. Kolodziejczyk, A. A., Zheng, D., Elinav, E. Diet-microbiota interactions and personalized nutrition. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 742-753 (2019).
  4. Tuddenham, S., Sears, C. L. The intestinal microbiome and health. Current Opinion in Infectious Diseases. 28 (5), 464-470 (2015).
  5. Dieterich, W., Schink, M., Zopf, Y. Microbiota in the Gastrointestinal Tract. Medical Sciences (Basel). 6 (4), 116(2018).
  6. Martinez-Guryn, K., et al. Small Intestine Microbiota Regulate Host Digestive and Absorptive Adaptive Responses to Dietary Lipids. Cell Host Microbe. 23 (4), 458-469 (2018).
  7. Kastl, A. J., Terry, N. A., Wu, G. D., Albenberg, L. G. The Structure and Function of the Human Small Intestinal Microbiota: Current Understanding and Future Directions. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (1), 33-45 (2020).
  8. Angelakis, E., et al. A Metagenomic Investigation of the Duodenal Microbiota Reveals Links with Obesity. PLoS One. 10 (9), 0137784(2015).
  9. Yu, L. X., Schwabe, R. F. The gut microbiome and liver cancer: mechanisms and clinical translation. Nature Reviews. Gastroenterology and Hepatology. 14 (9), 527-539 (2017).
  10. Schnabl, B., Brenner, D. A. Interactions between the intestinal microbiome and liver diseases. Gastroenterology. 146 (6), 1513-1524 (2014).
  11. Shen, T. D., Pyrsopoulos, N., Rustgi, V. K. Microbiota and the liver. Liver Transplant. 24 (4), 539-550 (2018).
  12. Hussain, S. K., et al. Dietary Protein, Fiber and Coffee Are Associated with Small Intestine Microbiome Composition and Diversity in Patients with Liver Cirrhosis. Nutrients. 12, 1395(2020).
  13. Kristal, A. R., et al. Evaluation of web-based, self-administered, graphical food frequency questionnaire. Journal of the Academy of Nutrition and Dietetics. 114 (4), 613-621 (2014).
  14. Benhammou, J. N., et al. Novel Lipid Long Intervening Noncoding RNA, Oligodendrocyte Maturation-Associated Long Intergenic Noncoding RNA, Regulates the Liver Steatosis Gene Stearoyl-Coenzyme A Desaturase As an Enhancer RNA. Hepatology Communications. 3 (10), 1356-1372 (2019).
  15. Earth Microbiome Project. 16S Illumina Amplicon Protocol. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2020).
  16. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
  17. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, 590-596 (2013).
  18. Eckburg, P. B., et al. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).
  19. Nieuwdorp, M., Gilijamse, P. W., Pai, N., Kaplan, L. M. Role of the microbiome in energy regulation and metabolism. Gastroenterology. 146 (6), 1525-1533 (2014).
  20. Jacob, N., et al. Inflammation-independent TL1A-mediated intestinal fibrosis is dependent on the gut microbiome. Mucosal Immunology. 11 (5), 1466-1476 (2018).
  21. Fujimori, S. What are the effects of proton pump inhibitors on the small intestine. World Journal of Gastroenterology. 21 (22), 6817-6819 (2015).
  22. Garcia-Tsao, G., Abraldes, J. G., Berzigotti, A., Bosch, J. Portal hypertensive bleeding in cirrhosis: Risk stratification, diagnosis, and management: 2016 practice guidance by the American Association for the study of liver diseases. Hepatology. 65 (1), 310-335 (2016).
  23. Prodan, A., Tremaroli, V., Brolin, H., Zwinderman, A. H., Nieuwdorp, M., Levin, E. Comparing bioinformatic pipelines for microbial 16S rRNA amplicon sequencing. PLoS One. 15 (1), (2019).
  24. Bolyen, E., et al. interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37, 852-857 (2019).
  25. Li, G., et al. Diversity of Duodenal and Rectal Microbiota in Biopsy Tissues and Luminal Contents in Healthy Volunteers. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 1136-1145 (2015).
  26. de Groot, P. F., et al. Distinct fecal and oral microbiota composition in human type 1 diabetes, an observational study. PLoS One. 12 (12), (2017).
  27. Kong, X., et al. New and Preliminary Evidence on Altered Oral and Gut Microbiota in Individuals with Autism Spectrum Disorder (ASD): Implications for ASD Diagnosis and Subtyping Based on Microbial Biomarkers. Nutrients. 11 (9), 2128(2019).
  28. Dethlefsen, L., Huse, S., Sogin, M. L., Relman, D. A. The Pervasive Effects of an Antibiotic on the Human Gut Microbiota, as Revealed by Deep 16S rRNA Sequencing. PLOS Biology. 6 (11), 280(2008).
  29. Dethlefsen, L., Relman, D. A. Incomplete recovery and individualized responses of the human distal gut microbiota to repeated antibiotic perturbation. PNAS. 108 (1), 4554-4561 (2011).
  30. Williams, R. C., Showalter, R., Kern, F. In vivo effect of bile salts and cholestyramine on intestinal anaerobic bacteria. Gastroenterology. 69 (2), 483-491 (1975).
  31. Seto, C. T., Jeralod, P., Orenstein, R., Chia, N., DiBiase, J. K. Prolonged use of a proton pump inhibitor reduces microbial diversity: implications for Clostridium difficile susceptibility. Microbiome. 2 (42), (2014).
  32. De Luca, F., Shoenfeld, Y. The microbiome in autoimmune diseases. Clinical and Experimental Immunology. 195 (1), 74-85 (2019).
  33. Belkaid, Y., Hand, T. W. Role of the microbiota in immunity and inflammation. Cell. 157 (1), 121-141 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Микробиома кишечникаанализ микробиомааспират двенадцатиперстной кишкибиопсия двенадцатиперстной кишкиверхняя эндоскопиясеквенирование 16S рРНКметаболомикаось кишечник-печень

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.