Различные мозжечковые области были замешаны в том, чтобы играть роль в различных поведенческих выходах, но основные молекулярные механизмы остаются неизвестными. В этой работе описывается метод воспроизводимого и быстрого рассечения коры мозжечка полушарий, передней и задней областей вермиса и глубоких ядер мозжечка с целью исследования молекулярных различий путем выделения РНК и тестирования различий в экспрессии генов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Региональное рассечение мозжечка для молекулярного анализа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мозжечок играет важную роль в нескольких ключевых функциях, включая контроль движения, равновесия, познания, вознаграждения и аффекта. Исследования изображений показывают, что различные мозжечковые области способствуют этим различным функциям. Молекулярные исследования, изучающие региональные различия мозжечка, отстают, поскольку они в основном проводятся на целых экстрактах мозжечка, тем самым маскируя любые различия в конкретных мозжечковых областях. Здесь мы описываем технику воспроизводимого и быстрого рассечения четырех различных мозжечковых областей: глубоких ядер мозжечка (DCN), передней и задней вермальной мозжечковой коры и мозжечковой коры полушарий. Анализ этих различных областей позволяет исследовать молекулярные механизмы, которые могут лежать в основе их уникального вклада в баланс, движение, аффект и познание. Этот метод также может быть использован для изучения различий в патологической восприимчивости этих конкретных областей в различных моделях заболеваний мышей.
Введение
Мозжечок содержит более половины нейронов в мозге и исторически упоминается как центр управления и равновесия в мозге1. Совсем недавно исследования показали, что мозжечок играет ключевую роль в различных других функциях, включая познание, обработку вознаграждения и влияние2,3,4,5.
Мозжечок имеет хорошо описанную анатомию: область коры состоит из гранул, Пуркинье и молекулярных слоев. Грануляные клетки образуют грануляный клеточный слой и посылают вход через параллельные волокна в клеточные ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Настройка
- Соберите необходимое оборудование, включая обезглавленные ножницы, тупые щипцы, ножницы для рассечения, сосудистые ножницы, микропатул, сагиттальную матрицу мозга мыши, лезвия бритвы, наконечники пипетки 200 мкл, стеклянную чашку Петри, стеклянную горку и ведро со льдом. Разложите все оборудование на абсорбирующей прокладке.
- Поместите чашку Петри, стеклянную пластину и мозговую матрицу на лед.
- Используя лезвие бритвы под перпендикулярным углом, отрежьте около 5 мм от кончика одного наконечника пипетки 200 мкл. Это делает размер отверстия на конце наконечника шириной около 1 мм. Этого должно быть достаточно, ч....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Для этих экспериментов использовались четыре одиннадцатинедельные самки диких мышей типа C57/Black6. Одна мышь использовалась для проведения полного рассечения мозжечка, которое называется «объемным мозжечком» и позволяло сравнивать уровни РНК в рассеченных областях с полным рассечением. Остальные три мыши использовались для проведения рассечения мозжечка, описанного в этом протоколе. Использование трех мышей позволяет гарантировать, что тенденции, обнаруженные в уровнях РНК, воспроизводи.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод, описанный здесь, позволяет оценить экспрессию основных генов и молекулярные механизмы в четырех различных мозжечковых областях - глубоких ядрах мозжечка (DCN), передней мозжечковой коре вермиса (CCaV), задней мозжечковой коре вермиса (CCpV) и коре мозжечка полушарий (CCH). Возможность оценивать эти области по отдельности расширит наши знания о неоднородности конкретных мозжечковых областей и, возможно, прольет свет на их вклад в различное поведение.
Путем сечения всей мозговой ткани саг.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны Остину Ферро и Жуао-Гильерме Розе в лаборатории Цветановича за их помощь в устранении неполадок вскрытий и в экстракции РНК и RTqPCR. Данное исследование финансируется М. Цветановичем, R01 NS197387; | HHS Национальные институты здравоохранения (NIH).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1.5 Микроцентрифужные пробирки | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% изопропиловый спирт | VWR Медико-биологические науки | 1106C361 | |
| 200 мкл наконечники пипеток | GeneMate | P-1237-200 | |
| Матрица мозга взрослой мыши Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Тупые щипцы | |||
| Хлороформ | Ножницы для | ||
| Ножницы | |||
| препарирования | |||
| этилового спирта | Pharmco | 111000200 | |
| предметное стекло (для электрофореза) | Гомогенизатор BIORAD | ||
| Ведро | |||
| Инсулиновый шприц (.5 мл) | BD | 329461 | |
| iScript Adv набор кДНК для RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| микрошпатель | |||
| Игольчатый щипцы | |||
| чашка | Петри Pyrex | ||
| Primetime Primer для альдолазы C | IDT | Mm.PT.58>43415246 | |
| Primetime Primer for Kcng4 | IDT | Mm.PT.56a.9448518 | |
| Primetime Primer for Parvalbumin | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primetime Primer Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Однолезвийные лезвия Rzor Personna | GEM | ||
| Стерильные, сигловые пестики | FisherScientific | 12141364 | |
| TRIzol Реагент | Ambion by Life technologies | 15596018 | |
| Сосудистые ножницы |
Ссылки
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
