Здесь представлен протокол для доставки олигонуклеотидов, таких как малоинтерферная РНК (siRNA), микро-РНК-мимики (miRs) или анти-микро-РНК (anti-miR) в зрелые адипоциты для модуляции экспрессии белка и микро-РНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель культуры клеток адипоцитов для изучения влияния модуляции белка и микро-РНК на функцию адипоцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изменение функции адипоцитов способствует патогенезу метаболических заболеваний, включая диабет 2 типа и резистентность к инсулину. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Модуляция экспрессии белков и микро-РНК в адипоцитах остается очень сложной задачей. В данной работе описан протокол дифференцировки мышиных фибробластов в зрелые адипоциты и модуляции экспрессии белков и микро-РНК в зрелых адипоцитах посредством обратной трансфекции с использованием малоинтерферирующих РНК (siRNA) и микро-РНК, имитирующих (miR-mimic) олигонуклеотидов. Этот протокол обратной трансфекции включает инкубацию трансфекционного реагента и олигонуклеотидов с образованием комплекса в пластине клеточной культуры, к которой добавляются зрелые адипоциты. Затем адипоцитам дают повторно прикрепиться к поверхности адгезивной пластины в присутствии комплекса олигонуклеотидов/трансфекционных реагентов. Функциональные анализы, такие как изучение передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липогенеза и липолиза, могут быть выполнены на трансфектированных зрелых адипоцитах 3T3-L1 для изучения влияния манипуляций с белком или микро-РНК на функцию адипоцитов.
Введение
Ожирение считается основным фактором риска для многочисленных метаболических заболеваний, включая резистентность к инсулину (IR), диабет 2 типа (T2D) и сердечно-сосудистые заболевания1. Современные методы лечения не смогли остановить постоянно растущую распространенность этих заболеваний, и управление ИК пациентов с ожирением и диабетом остается важной клинической проблемой. Жировая ткань играет важнейшую роль в контроле энергетического гомеостаза, а ее патологическое расширение при ожирении способствует развитию ИК иСД22,3. Это подчеркивает необходимость лучшего понимания молекулярного механизма, участвующего в дисфункции адипоцитов, для разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с ожирением. Многие исследования изучали роль кодирующих белок РНК в физиологии адипоцитов и их связь с ожирением.
Совсем недавно открытие некодирующих РНК (ncRNAs), особенно микро-РНК (miRs), создало новые концепции, связанные с механизмом регуляции программ экспрессии генов. Исследования показали, что нРНК являются важными регуляторами функции адипоцитов, и что их дисрегуляция играет важную роль при метаболических заболеваниях4. Таким образом, манипуляции с белками и ncРНК в адипоцитах имеют решающее значение для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их влияния на такие патологии, как СД2. Тем не менее, манипулирование экспрессией белков и ncRNAs in vivo, а также в первичных адипоцитах остается очень сложным, что способствует использованию моделей адипоцитов in vitro.
Мышиные фибробласты 3T3-L1 легко дифференцируются в зрелые, функциональные и инсулин-чувствительные адипоциты, которые представляют собой хорошо охарактеризованные клеточные линии, используемые для изучения функции адипоцитов (например, передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, липолиза и секреции адипокинов)5,6,7,8,9,10. Эти свойства делают адипоциты 3T3-L1 привлекательной моделью для модуляции экспрессии кодирующих белок и nc-РНК для расшифровки их роли в функции адипоцитов и их потенциальной роли в заболеваниях, связанных с ожирением. К сожалению, в то время как фибробласты 3T3-L1 легко трансфектируются с использованием коммерчески доступных реагентов, дифференцированные адипоциты 3T3-L1 являются одной из самых сложных клеточных линий для трансфектации. Вот почему многочисленные исследования, манипулируя экспрессией генов в клетках 3T3-L1, были сосредоточены на дифференцировке адипоцитов, а не на функции адипоцитов.
Долгое время единственным эффективным методом трансфектации адипоцитов была электропорация5,которая утомительна, дорога и может вызвать повреждение клеток. В этой статье сообщается о методе обратной трансфекции с использованием общего трансфекционного реагента, который сокращает практическое время для трансфекции, не влияет на жизнеспособность клеток и намного дешевле, чем электропорация. Этот протокол идеально подходит для трансфекции siRNA и других олигонуклеотидов, таких как микро-РНК-мимики (miR-мимики) и антимир-мимики. Принцип протокола обратной трансфекции заключается в инкубации трансфекционного реагента и олигонуклеотидов для образования комплекса в пластине клеточной культуры, а затем посева зрелых адипоцитов в колодцы. Затем адипоциты повторно прикрепляются к поверхности адгезивной пластинки в присутствии комплекса реагентов олигонуклеотидов/трансфекции. Эта простая, эффективная и недорогая методология позволяет изучать роль кодирующих белок РНК и миР в функции адипоцитов и их потенциальную роль в заболеваниях, связанных с ожирением.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные методы для выполнения всех этапов протокола в ламинарной проточной культуре клеток. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех реагентах и оборудовании.
1. Дифференцировка фибробластов мысиной 3T3-L1 в адипоциты
- Выращивают фибробласты 3T3-L1 в посуде по 100 мм в культуральном среде-ДМЭМ без пирувата, глюкозы 25 мМ, 10% сыворотки новорожденных телят и 1% пенициллина и стрептомицина(рисунок 1А). Поместите посуду в инкубатор для культивации тканей (7% CO2 и 37 °C).
- Через два дня после слияния изменяют культуральную среду, заменяя ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% сыворотки для телят плода (FCS) и 1% пенициллина и стрептомицина, дополненных 0,25 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), 0,25 мкМ дексаметазона, 5 мкг / мл инсулина и 10 мкМ росиглитазона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения слияния требуется 5 дней, когда клетки засеиваются по 300 000 клеток на чашку размером 100 мм. - Через два дня замените культуральный среду ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина с добавлением инсулина 5 мкг/мл и 10 мкМ росиглитазона и инкубата в течение 2 дней. Затем кормите клетки каждые 2 дня ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина(Рисунок 1B).
- Трансфектируют адипоциты 3T3-L1 через 7-8 дней после начала протокола дифференцировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно достичь высокого уровня дифференцировки (>80%) до трансфекции, чтобы избежать пролиферации оставшихся фибробластов после трансфекции, что приведет к смешанной популяции клеток, которые могут сузить результаты.
2. Подготовка плит с предварительным покрытием
- За сутки до или за несколько часов до трансфекции готовят раствор коллагена I типа по 100 мкг/мл в 30% этаноле из запасного раствора по 1 мг/мл. Добавьте 250 мкл коллагена на скважину 12-скважинной пластины и 125 мкл на скважину 24-скважинной пластины и распределите раствор по поверхности скважины.
- Оставьте тарелку без крышки под культуральным капюшоном до тех пор, пока коллаген не высохнет. Дважды промыть фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (D-PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты с покрытием доступны для покупки.
3. Приготовление трансфекционной смеси
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация siRNA составляет от 1 до 100 нМ (от 1 до 100 пмоль siRNA на скважину 12-скважинной пластины). Конечная концентрация miR-мимики составляет 10 нМ (10 пмоль/колодец). Определите наилучшую концентрацию каждой siRNA, miR-мимики или другого олигонуклеотида до начала эксперимента, чтобы избежать нецелевых эффектов. Проводите трансфекционные эксперименты в трех количествах, чтобы облегчить статистический анализ результатов. Подготовьте все реагенты в избытке, чтобы учесть нормальные потери во время пипетки.
- Смешайте путем пипетирования (объем/объем) siRNA (или других олигонуклеотидов) с улучшенной минимальной существенной средой(таблица 1). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте трансфекционный реагент и улучшенную минимальную необходимую среду к siRNA и пипетку для смешивания(таблица 1). Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (в течение этого времени переходить к разделу 4). Добавьте трансфекционную смесь в каждый кладезы коллагеновой пластины.
4. Получение адипоцитов 3T3-L1
- Дважды вымойте ячейки в 100-миллиметровой чашке Петри с помощью D-PBS. Добавьте в ячейки 5 трипсина (1 мл на 100 мм тарелки), обязательно покрывая трипсином всю поверхность. Подождите 30 с и аккуратно удалите трипсин.
- Высиживать чашку Петри в течение 5-10 мин при 37 °C в инкубаторе. Коснитесь тарелки 100 мм, чтобы отсоедать ячейки.
- Добавьте 10 мл DMEM без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина для нейтрализации трипсина. Осторожно пипетируйте среду вверх и вниз, чтобы отсоедать клетки и гомогенизировать клеточную суспензию.
- Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Malassez или автоматизированного счетчика клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 6,25х 10 5 клеток / мл среды. Посев 800 мкл клеточной суспензии/скважины 12-скважинной пластины (5 х 105 ячеек) или 400 мкл клеточной суспензии/скважины 24-скважинной пластины (2,5 х 105 клеток), содержащей трансфекционную смесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одна 100-миллиметровая чашка Петри адипоцитов позволит подготовить одну 12-скважинную пластину или одну 24-скважинную пластину. Тарелка толщиной 100 мм обычно содержит 6-7 х 106 адипоцитов, что соответствует 5 х 105 адипоцитов на колодец 12-колодезной пластины. - Инкубируют пластины в инкубаторе клеточной культуры (7% CO2 и 37 °C) и не нарушают работу клеток в течение 24 ч. На следующий день осторожно замените супернатант свежим ДМЭМ без пирувата, 25 мМ глюкозы, 10% FCS и 1% пенициллина и стрептомицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно засеять клетки в коллагеновые предварительно покрытые 48- и 96-колодезными пластинами, но принять больше мер предосторожности при замене среды, чтобы избежать отслоения адипоцитов.
5. Функциональный анализ трансфектированных адипоцитов 3T3-L1
- Исследование целевого нокдауна через 24-48 ч и 48-96 ч после симумической доставки siRNA или miR для мРНК и белка соответственно.
- Выполняйте функциональный анализ трансфефицированных адипоцитов для изучения передачи сигналов инсулина, поглощения глюкозы, секреции адипокина, липолиза и липогенеза.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя описанную здесь процедуру обратной трансфекции для модуляции экспрессии белков или микро-РНК в адипоцитах 3T3-L1, было показано, что адипоциты сохраняют свою морфологию после трансфекции(рисунок 1B,C). Действительно, через 2 дня после трансфекции адипоциты были хорошо распределены и прикреплены к пластинке и представляли собой многолокулярные липидные капли, характерные для зрелых адипоцитов 3T3-L1. Содержание липидов не отличалось ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данной работе представлен подробный протокол дифференцировки и трансфекции зрелых адипоцитов. Этот метод обратной трансфекции является простым, экономичным и высокоэффективным методом трансфекции олигонуклеотидов, таких как, но не ограничиваясь ими, siRNAs, микро-РНК-мимика и анти-микро-РНК в 3T3-L1 адипоциты, что является одной из самых сложных клеточных линий для трансфекции. Этот метод имеет некоторые ограничения, которые необходимо учитывать. Этот протокол не эффективен для трансфекции плазмидной ДНК, что ограничив...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана INSERM, Университетом Лазурного берегу и Французским национальным исследовательским агентством (ANR) в рамках программы «Инвестиции для будущей Лаборатории передового опыта» (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) и «Инициатива передового опыта» (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. поддерживается грантами От Французского сообщества диаспоры (SFD), Французской ассоциации исследований и исследований в области обезите (AFERO), Института технологий мультигезитов в санте (ITMO) и Фонда Бенджамина-Делессерта. J.G. поддерживается ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. поддерживается грантом ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 и грантом Фонда по области ремерче-едикаля (Equipe FRM, DEQ20180839587). Мы также благодарим Центр визуализации C3M, финансируемый Департаментом Приморских Альп и Région PACA, который также поддерживается платформой микроскопии и визуализации GIS IBiSA Côte d'Azur (MICA).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 12-луночный планшет для культуры тканей | Dutscher | 353043 | |
| 2,5% трипсин (10x) | Gibco | 15090-046 | разбавленный до 5x с D-PBS |
| 2-пропанол | Sigma | I9516 | |
| 3-изобутил-1-метилксантин | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-Targeted Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Бычья сыворотка альбумин (БСА) | Sigma | A7030 | |
| Коллаген I типа I из телячьей кожи | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Дексаметазон | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Модифицированная среда Eagles's (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4,5 г/л D-глюкозы; L-глютамин; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-меченый отрицательный контроль si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10270-106 | |
| Свободный глицерин | Реагент Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Глицерин Стандартный раствор | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 антитела | Santa Cruz | sc-131119 | Разбавление: 0,5 & микро; г/мл |
| Улучшенная минимальная незаменимая среда (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Инсулин, человеческий рекомбинантный | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN микро-РНК имитирует | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Анализы Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Праймер Анализы Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Сыворотка для новорожденных телят | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Открытие | L-056623-01-0005 | |
| Пенициллин и стрептомицин | Gibco | 15140-122 | |
| Антитело к перилипину-1 | Клеточная сигнализация | 3470 | Разведение: 1/1000 |
| чашка Петри 100 мм x 20 мм | Дучер | 353003 | |
| Антитело к ПКБ | Клеточная сигнализация | 9272 | Разведение: 1/1000 |
| ПКБ Фосфо Thr308 антитело | Клетка Сигнализация | 9275 | Разведение: 1/1000 |
| Росиглитазон | Сигма-Олдрич | R2408 | |
| Реагент для трансфекции (ИНТЕРФЕРин) | Polyplus | 409-10 | |
| &альфа;-тубулин антитело | Sigma aldrich | T6199 | Разведение: 0,5 &микро; г/мл |
| антитела Vamp2 | R& D системы | MAB5136 | разбавления: 0,1 &; г/мл |
Ссылки
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
