В этом исследовании мы представляем метод визуализации в режиме реального времени с использованием конфокальной микроскопии для наблюдения за клетками, двигамися в направлении поврежденных тканей путем инкубации ex vivo с кохлеарным эпителием, содержащим орган Корти.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging для изучения миграции клеток к органу Корти
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Для изучения влияния мезенхимальных стволовых клеток (MSC) на регенерацию клеток и лечение, этот метод отслеживает миграцию MSC и морфологические изменения после совместной культуры с кохлеарной эпителием. Орган Корти был обездвижен на пластиковой крышке, нажав на часть мембраны Рейсснера, генерируемую во время вскрытия. MSCs ограничивается стеклянный цилиндр мигрировали в сторону кохлеарного эпителия, когда цилиндр был удален. Их преобладающая локализация наблюдалась в модиоле органа Корти, выровненном в направлении, аналогичном нервному. Тем не менее, некоторые MSCs были локализованы в области лимбуса и показали горизонтально удлиненной формы. Кроме того, миграция в область волосяных клеток была увеличена, и морфология MSCs изменилась на различные формы после лечения канамицина. В заключение, результаты этого исследования показывают, что кокультура MSCs с кохлеарной эпителия будет полезна для развития терапии через трансплантацию клеток и для исследований регенерации клеток, которые могут изучить различные условия и факторы.
Введение
Потеря слуха может происходить врожденно или может быть вызвана постепенно несколькими факторами, включая старение, наркотики и шум. Потеря слуха часто трудно лечить, потому что это очень сложно восстановить нарушенную функцию, как только волосковых клеток, ответственных за слух повреждены1. По данным Всемирной организации здравоохранения, 461 миллион человек во всем мире, по оценкам, имеют потерю слуха, что составляет 6,1% населения мира. Из тех, кто с потерей слуха, 93% взрослых, и 7% детей.
Был предпринят ряд подходов к лечению потери слуха; в частности, перспективным методом лечения стал подход к регенерации с ис....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все протоколы исследований с участием мышей МЦР были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Yonsei в Медицинском колледже Вонджу. Эксперименты проводились в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации. В этом протоколе беременные мыши МЦР содержались в светло-темном цикле 12/12 ч с бесплатным доступом к пище и воде.
1. Вскрытие улитки
- Стерилизовать ламинарный поток ткани культуры капот, включив ультрафиолетовый свет в течение 30 минут, и спрей все поверхности с 70% этанола до использования. Дайте поверхностям высохнуть.
- Поместите инструменты для ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Миграция MSC в трехмерном режиме была оценена системой Transwell или традиционным методом заживления ран для наблюдения за миграцией в двухмерном (2D) режиме11. Орган Корти является сложной структурой, состоящей из различных клеток, таких как клетки Boettcher, клетки Клавдия, клетки Deiters, клетки столба, клетки Хенсена, внешние волосковые клетки, внутренние клетки волос, нервные волокна, базилярная мембрана, и ретикулярнаяламина 12. Когда .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Тщательно изучена трансплантация MSC в поврежденные участки для содействия регенерации поврежденных клеток, и терапевтический эффект очевиден. Трансплантация и последующая дифференциация MSCs, как сообщается, восстановить слух у крыс с потерей слуха, вызванной 3-нитропропионовойкислоты 13. Хотя Ли и др. применяли MSCs к людям поперечно, они не достигли каких-либо значительных улучшений в слух14. До недавнего времени было проведено около 12 экспериментов по восстановлению сл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана научно-исследовательскими грантами (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) от Национального исследовательского фонда (NRF) Кореи и Исследовательского фонда Халлымского университета.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10X PBS Buffer | GenDEPOT | P2100-104 | |
| 4% формалина | T& I | BPP-9004 | |
| Ампициллин | сигма | A5354-10 мл | |
| BSA | сигма | A4503-100G | |
| конфокальная микроскоп | SPL | 200350 | |
| ZEISS | LSM800 | ||
| покровное покрытие | SPL | 20009 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-018 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Thermo Fisher scientific | 16140071 | |
| Fluorsheild с DAPI | sigma | F6057 | |
| Щипцы | Dumont | 0508-L5-P0 | |
| HBSS | Thermo Fisher scientific | 14065056 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| N2 добавка | Gibco | 17502-048 | |
| Фаллоидин-iFluor 647 Реагент | abcam | ab176759 | |
| Инкубатор Stage Top TOKAI | HIT | WELSX | |
| Штамм C57BL/6 мышиные мессенхимальные стволовые клетки с | циагеном | GFP MUBMX-01101 | |
| Triton X-100 | sigma | Т8787 |
Ссылки
- Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise revie....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
