Здесь описан точный и воспроизводимый метод количественного определения in vivo нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Этот метод использует ВЭЖХ-МС/МС.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Заводская пробоподготовка для измерения содержания нуклеозидов/нуклеотидов с помощью ВЭЖХ-MS/MS
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нуклеозиды / нуклеотиды являются строительными блоками нуклеиновых кислот, частей косубстратов и коферментов, клеточных сигнальных молекул и энергоносителей, которые участвуют во многих клеточных действиях. Здесь мы описываем быстрый и надежный метод абсолютной квалификации содержания нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Вкратце, 100 мг гомогенизированного растительного материала экстрагировали с помощью 1 мл экстракционного буфера (метанол, ацетонитрил и вода в соотношении 2:2:1). Позже образец концентрировали пять раз в сублимационной сушилке, а затем вводили в ВЭЖХ-MS/MS. Нуклеотиды отделяли на пористой графитовой углеродной (PGC) колонке, а нуклеозиды отделяли на колонке C18. Массовые переходы каждого нуклеозида и нуклеотида контролировались масс-спектрометрией. Содержание нуклеозидов и нуклеотидов было количественно определено в сопоставлении с их внешними стандартами (ESTD). Поэтому, используя этот метод, исследователи могут легко количественно оценить нуклеозиды / нуклеотиды в разных растениях.
Введение
Нуклеозиды / нуклеотиды являются центральными метаболическими компонентами во всех живых организмах, которые являются предшественниками нуклеиновых кислот и многих коферментов, таких как никотинамидадениндинуклеотид (NAD), и важны в синтезе макромолекул, таких как фосфолипиды, гликолипиды и полисахариды. Структурно нуклеозид содержит нуклеоосно, которое может быть аденином, гуанином, урацилом, цитозином или тимином, и сахарный мутик, который может представлять собой рибозу или дезоксирибозу1,2. Нуклеотиды имеют до трех фосфатных групп, связывающихся с 5-углеродным положением сахарного муля нуклеозидов3. Метаболизм нуклеотидов в растениях необходим для прорастания семян и роста листьев4,5,6. Чтобы лучше понять их физиологическую роль в развитии растений, следует установить методы абсолютной количественной оценки различных нуклеозидов/нуклеотидов in vivo.
Один из наиболее часто используемых подходов к измерению нуклеозидов /нуклеотидов использует высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в сочетании с ультрафиолетовым (UV-VIS) детектором4,7,8,9,10,11. В 2013 году, используя ВЭЖХ, Данке и Витте количественно оценили несколько типов нуклеозидов в Arabidopsis thaliana7. Они идентифицировали повышенное содержание гуанозина в мутанте, нацеленном на вставку Т-ДНК в гене гуанозиндезаминазы по сравнению с растением дикого типа. Другой пиримидин нуклеозид, цитидин, также был количественно обнаружен в растениях, использующих этот метод, что привелок идентификации гена 4 добросовестной цитидиндеаминазы. Однако, основанный на УФ-детекторе, этот метод не может легко отличить нуклеозиды, которые имеют сходные спектры и время удержания, например, гуанозин или ксантозин. Предел обнаружения метода ВЭЖХ относительно высок, поэтому его часто используют для измерения высокого содержания нуклеозидов in vivo, таких как цитидин, уридин и гуанозин.
Кроме того, газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (GC-MS) также может быть использована в измерении нуклеозидов. Извлекая из этого выгоду, Хаук и др. al. успешно обнаружены уридин и мочевая кислота, которая является последующим метаболитом нуклеозидного катаболического пути, в семенах A. thaliana12. Однако ГК обычно используется для разделения летучих соединений, но не подходит для термически лабильных веществ. Поэтому жидкостная хроматография, связанная с масс-спектрометрией (LC-MS/MS), вероятно, является более подходящим и точным аналитическим методом для идентификации, разделения и количественного определения нуклеозидов/нуклеотидов in vivo13,14. В нескольких предыдущих исследованиях сообщалось, что колонка HILIC может быть использована для разделения нуклеозидов и нуклеотидов15,16 и изотопно меченые внутренние стандарты были использованы для количественной оценки соединения17. Тем не менее, оба компонента являются относительно дорогими, особенно коммерческие стандарты, маркированные изотопами. Здесь мы сообщаем об экономически применимом подходе LC-MS/MS для измерения нуклеозидов/нуклеотидов. Этот метод уже успешно используется для количественного определения различных нуклеозидов/нуклеотидов, включая АТФ,N6-метил-АМФ,АМФ, GMP, уридин, цитидин и псевдоуридин1,5,6,18,у растений и дрозофилы. Более того, метод, о который мы здесь сообщаем, может быть использован и в других организмах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1 Рост растений и сбор материалов
- Убедитесь, что семена Arabidopsis стерилизованы в 70% этаноле в течение 10 минут и посеяны на агаровых пластинах, которые были приготовлены из питательных веществ Мурашиге и Скуга половинной силы.
- Инкубировать пластины, содержащие семена арабидопсиса, в темноте при 4 °C в течение 48 ч, а затем перенести их в контролируемую камеру роста при 16 ч при свете 55 мкмольм-2 с-1 при 22 °C и 8 ч темной при 20 °C.
- Соберите 100 мг 2-недельной рассады (свежий вес) и заморозьте в жидком азоте для экстракции метаболитов.
ВНИМАНИЕ: Исследователи должны надлежащим образом носить перчатки, защитные очки и лабораторный халат, чтобы избежать загрязнения тканей человека во время сбора материалов.
2 Экстракция нуклеозидов/нуклеотидов
- Измельчают 100 мг замороженных растительных тканей с 7-8 стальными шариками в предварительно холодном смесительном стане в течение 5 мин с частотой 60 Гц.
- Готовят экстракционный раствор, который содержит метанол, ацетонитрил и воду в соотношении 2:2:1.
- Повторное суспендирование гомогенизированных материалов (включая большинство метаболитов, но не белков) 1 мл экстракционного раствора.
- Центрифугируют полученный раствор при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °С.
- Переложите 0,5 мл суспензии в новую трубку объемом 1,5 мл и заморозьте в жидком азоте.
- Выпарить замороженный образец в морозильных красителях и повторно суспендировать в 0,1 мл 5% ацетонитрила и 95% воды.
- Центрифугируют полученный раствор (0,1 мл) при 40 000 х г в течение 10 мин при 4 °С. Загрузите супернатант во флакон для измерения LC-MS/MS.
3 измерения LC-MS/MS
- Готовят буфер ацетата аммония 10 мМ, растворяя 1,1 г ацетата аммония в 2 л двойной деионизированной воды (подвижная фаза А). Отрегулируйте рН до 9,5 на 10% аммония и ацетатной кислоты.
- Готовят 2 л сверхчистого 100% метанола (подвижная фаза В1) для измерения нуклеозидов. Кроме того, приготовьте 2 л сверхчистого 100% ацетонитрила (подвижная фаза B2) для измерения нуклеотидов.
- Вводят 0,02 мл предварительно обработанного экстракции метаболитов каждого образца со этапа 2.7 в систему ВЭЖХ с бинарными насосами (LC) в сочетании с трехквадрупольных масс-спектрометром (MS).
ВНИМАНИЕ: Система ВЭЖХ использует колонну C18 (50 x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм; работает при 25 °C), буферизующую подвижной фазой A и B1(рисунок 1A)для разделения нуклеозидов и использует столб пористого графитового углерода (PGC) (50 x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм; работает при 25 °C) с подвижной фазой A и B2(рисунок 1B)для разделения нуклеотидов. Каждый образец вводили три раза для технической репликации. - Запрограммировать метод, как показано в таблице 1 для столбца C18, и метод, как показано в таблице 2 для столбца PGC. Установите расход 0,65 млмин-1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Массовые переходы(таблица 3)контролировались масс-спектрометром. Условия анализа масс-спектра восьми нуклеозидов и пяти нуклеотидов, содержащих канонические и модифицированные, приведены в таблице 3. - Запишите пиковые области каждого целевого соединения(рисунок 1).
4 Генерация стандартных калибровочных кривых
- Пул шесть образцов экстракции вместе, которые были получены в соответствии с описанием в разделе 2, и вихревые его. Затем снова переотсутите его на шесть извлечений (тот же объем), чтобы получить каждый фон.
- Добавьте шесть различных концентраций каждого стандарта к этим шести экстракциям, соответственно, и вводите их одну за другой после шага 3.3.
- Регистрируйте пиковые области каждого стандарта при различных концентрациях посредством переходов массы, как описано на этапах 3.4 и 3.5.
- Постройте пиковую область по отношению к номинальной концентрации каждого стандарта, чтобы создать шеститочечную кривую.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые области нуклеозидов/нуклеотидов, зарегистрированные на шаге 3.5, должны находиться в диапазоне стандартных калибровочных кривых. - Вычисление уравнения прямой для каждого стандартного соединения: Y = aX + b
5 Количественная оценка метаболитов
- Рассчитайте содержание метаболитов, используя пиковую область, зарегистрированную на шаге 3.5, и уравнение из шага 4.5.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы показываем идентификацию и количественную оценку N1-метиладенозина, известного модифицированного нуклеозида, в 2-недельных саженцах дикого типа Arabidopsis (Col-0) в качестве примера. Профиль масс-спектрометрии указывает, что ионыпродукта, образующиеся из стандарта N1-метиладенозина, составляют 150 м/z и 133 м/z(фиг.2A),и такой же профиль также наблюдается при экстракции Col-0(рисунок 2B). ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Организмы содержат различные нуклеозиды/нуклеотиды, в том числе канонические и аберрантные. Однако происхождение и метаболические конечные точки их, особенно модифицированных нуклеозидов, все еще неясны. Кроме того, современное понимание функции и гомеостаза метаболизма нуклеозидов/нуклеотидов еще предстоит изучить и расширить. Для их исследования необходимо использовать точный и золотой стандартный метод идентификации и количественной оценки этих метаболитов. Здесь мы описали протокол, использующий массовый спектр для о...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Эта работа была финансово поддержана Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (KJQN202060), Национальным фондом естественных наук Китая (31900907), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (BK20190528), Международным центром генной инженерии и биотехнологии (CRP / CHN20-04_EC) до M.C. и Фондами фундаментальных исследований для центральных университетов (LGZD202004) до X.L.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| ацетонитрил | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| аденозин | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| ацетат аммония | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| АМФ | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| ЦМП | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| цитидин | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| ГМП | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| гуанозин | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| колонка Hypercarb | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| ИМП | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| инозин | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| метанол | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-метиладенозин | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-метилгуанозин | Carbosynth | NM02922 | |
| Среда Мурасиге и Скуга | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| колонка Polaris 5 C18A | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| псевдоуридин | Carbosynth | NP11297 | |
| УМП | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| уридин | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
Ссылки
- Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
- Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
- Witte, C. -P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
- Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
- Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
- Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
- Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
- Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
- Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
- Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
- Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
- Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
- Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
- Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
- Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
- Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
- Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
- Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
