Методическая статья

Комплексный высокоэффективный протокол для выделения, культивирования, поляризации и гликолитической характеристики макрофагов, полученных из костного мозга

DOI:

10.3791/61959

⸱

7 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Nutrition and Food Science, Texas A&M University, 3Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол содержит подробные и всесторонние методы выделения, культивирования, поляризации и измерения гликолитического метаболического состояния живых макрофагов, полученных из костного мозга (МПДМ). В этом документе представлены пошаговые инструкции с реалистичными визуальными иллюстрациями для рабочего процесса и гликолитической оценки BMDM в режиме реального времени.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги являются одними из наиболее важных антигенпрезентирующих клеток. Многие подмножества макрофагов были идентифицированы с уникальными метаболическими сигнатурами. Макрофаги обычно классифицируются как М1-подобные (воспалительные) и М2-подобные (противовоспалительные) подтипы. М1-подобные макрофаги являются провоспалительными макрофагами, которые активируются ЛПС и/или провоспалительными цитокинами, такими как INF-γ, IL-12 и IL-2. М1-подобные поляризованные макрофаги участвуют в различных заболеваниях, опосредуя защиту хозяина от различных бактерий и вирусов. Это очень важно для изучения индуцированных ЛПС М1-подобных макрофагов и их метаболических состояний при воспалительных заболеваниях. М2-подобные макрофаги считаются противовоспалительными макрофагами, активируемыми противовоспалительными цитокинами и стимуляторами. В провоспалительном состоянии макрофаги демонстрируют повышенный гликолиз в гликолитической функции. Гликолитическая функция активно исследовалась в контексте гликолиза, гликолитической емкости, гликолитического резерва, компенсаторного гликолиза или негликолитического подкисления с использованием анализаторов внеклеточного потока (XF).

В этой статье показано, как оценить гликолитические состояния в режиме реального времени с помощью простых шагов, когда макрофаги, полученные из костного мозга (МПДМ), дышат, потребляют и производят энергию. Используя специфические ингибиторы и активаторы гликолиза в этом протоколе, мы показываем, как получить системное и полное представление о гликолитических метаболических процессах в клетках и обеспечить более точные и реалистичные результаты. Чтобы иметь возможность измерять несколько гликолитических фенотипов, мы предлагаем простой, чувствительный, основанный на ДНК метод нормализации для поляризационной оценки МПДМ. Культивирование, активация/поляризация и идентификация фенотипа и метаболического состояния МПК являются важнейшими методами, которые могут помочь в исследовании многих различных типов заболеваний.

В этой статье мы поляризовали наивные макрофаги M0 на М1-подобные и М2-подобные макрофаги с ЛПС и ИЛ4 соответственно и измерили полный набор гликолитических параметров в МПДМ в реальном времени и в лонгитюдном течении, используя анализ внеклеточного потока и гликолитические активаторы и ингибиторы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Макрофаги являются одними из наиболее важных клеток врожденной иммунной системы M1-подобной. Они участвуют в устранении инфекционных заболеваний, фагоцитозе, презентации антигенов и регуляции воспаления2. Кроме того, макрофаги необходимы для регуляции других иммунных клеток с помощью различных цитокинов, которые они выделяют3. Существует большой спектр фенотипов макрофагов4. В зависимости от сигналов, которым подвергаются макрофаги, они поляризуются в сторону различных воспалительных и метаболических состояний5. Макрофаги проявляют метаболические изменения при различных заболеваниях, в зависимости от того, в какой ткани находятся макрофаги6. Поляризованные макрофаги обладают способностью перепрограммировать или переключать свой гликолитический метаболизм, липидный обмен, метаболизм аминокислот и митохондриальное окислительное фосфорилирование (OXPHOS)7,8. Классически активированные М1-подобные макрофаги и альтернативно активированные М2-подобные макрофаги являются двумя наиболее изученными фенотипами макрофагов3. Неактивированные покоящиеся макрофаги называются макрофагами M0. Поляризация М0-макрофагов в сторону М1-подобного фенотипа может быть индуцирована стимуляцией наивных МПДМ бактериальным липополисахаридом (ЛПС)9. Сигнальный путь PI3K-AKT-mTOR-HIF1a может быть активирован в макрофагах в присутствии воспалительных цитокинов, интерферона-гамма (ИФН γ,) или фактора некроза опухоли (TNF)10. М1-подобные макрофаги имеют повышенный уровень метаболизма гликолиза, сниженный уровень окислительного фосфорилирования (OXPHOS), продукцию воспалительных цитокинов, участвующих в инфекционных и воспалительных заболеваниях8. С другой стороны, поляризация в сторону М2-подобного фенотипа может быть индуцирована интерлейкином (IL)-4 через пути JAK-STAT, PPAR и AMPK или (IL)-13 и TGFβ pathays11,12.

В отличие от М1-подобных макрофагов, М2-подобные макрофаги имеют пониженный гликолиз и повышенный OXPHOS, а также участвуют в антипаразитарной и тканевой репарирующей активности 8,13. МПДМ являются широко используемой системой для изучения макрофагов, полученных из стволовых клеток костного мозга. Гликолиз и OXPHOS являются двумя ведущими путями производства энергии в клетках14. В зависимости от микроокружения BMDM могут использовать любой из этих путей; В некоторых случаях переключайтесь с одного на другой или используйте оба пути14. В этом исследовании мы сосредоточились на метаболизме гликолиза в активированных провоспалительных макрофагах. Когда глюкоза в цитоплазме превращается в пируват, а затем в лактат, клетки вырабатывают в этой среде протоны, которые вызывают повышение скорости подкисления в окружающей среде М1-подобныхклеток. Для измерения скорости подкисления клеточных сред использовался анализатор внеклеточного потока. Результаты представлены в виде скорости внеклеточного закисления (ECAR) или скорости оттока протонов.

Оптимизированный, быстрый и простой метод доступа к уровням гликолиза в поляризованных макрофагах необходим для определения гликолитического фенотипа, изменений метаболитов и влияния ингибиторов/активаторов и лекарств на поляризованные макрофаги. Метод, описанный в данной рукописи, был оптимизирован для получения информации о конкретных факторах гликолиза (гликолиз, гликолитическая емкость, гликолитический резерв и негликолитическое подкисление), а также о метаболическом перепрограммировании гликолитического метаболизма. Ингибитор (2DG), который использовался в этом исследовании, явно нацелен на путь гликолиза.

Этот оптимизированный протокол был модифицирован и усовершенствован на основе комбинации опубликованного протокола16, анализа внеклеточного потока гликолитических анализов из руководств пользователя производителя и прямого общения с учеными производителя в области исследований и разработок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мыши были гуманно принесены в жертву в соответствии с рекомендациями Оценки и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC) и Американской ассоциации науки о лабораторных животных (AALAS) и с использованием протоколов, одобренных Комитетом по уходу и использованию животных Техасского университета A&M (IACUC).

1. Мыши, сбор костного мозга и культивирование МПДМ

  1. Принесите в жертву мышь (в возрасте 6-10 недель C57Bl/6 мышей входили в этот протокол) и положите ее на вентральную сторону, разрежьте кожу и брюшинный слой и аккуратно снимите с лапок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте воздействие газа CO2 для усыпления мыши.
  2. Отделите обе задние ноги от бедра вниз, стараясь не порезать кость.
  3. Поместите всю ногу в пустую коническую трубку объемом 50 мл (ногами вверх, чтобы их было удобно вытащить позже) на лед и продолжайте собирать обе ноги с мыши.

2. Обнажение бедренной кости

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие действия в шкафу биобезопасности.

  1. Соберите бедренную кость, отрезав большеберцовую кость с каждой ноги и удалив как можно больше ткани вокруг бедренной кости с помощью ножниц и лабораторной бумаги.
  2. Заготовленные, «очищенные» бедренные кости поместите в 10-сантиметровую пластину, содержащую лист лабораторной бумаги, пропитанный питательной средой (ТК) или ПБС. Выложите их на лед.
  3. Продолжайте забор бедренных костей и удаляйте ткани со всех бедренных костей, прежде чем перейти к этапу промывки (Рисунок 1A).

3. Промывка костного мозга

  1. Чтобы промыть костный мозг из бедренной кости, используйте шприц объемом 3 мл, наполненный средой TC или PBS с иглой 23G. Наполните шприц перед тем, как обнажить костный мозг.
  2. С помощью ножниц обнажите костный мозг, разрезав самый конец бедренной кости на обоих эпифизах.
  3. Вставьте кончик иглы в бедренную кость и аккуратно промойте костный мозг в посуду диаметром 10 см.
  4. Проведите иглой по всей длине бедренной кости и промывайте до тех пор, пока цвет кости не станет белым. Как правило, большую часть костного мозга можно промыть с помощью 2-3 мл среды.
  5. Промойте все бедренные кости и бассейн костного мозга в чашке. С помощью иглы разбейте все видимые комки. Процедите костный мозг в коническую пробирку объемом 50 мл (рис. 1A).

4. Лизис эритроцитов

  1. Отжим костный мозг при 190 x g в течение 10 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость.
  2. Ресуспендируйте гранулу в 4 мл буфера для лизиса ACK с помощью пипетки. Дайте буферу для лизиса эритроцитов подействовать в течение 5 минут при комнатной температуре.
  3. Добавьте 4 мл среды ТК RPMI-C 10% (RPMI 1640-GlutaMAX) с добавлением 2-меркаптоэтанола, гентамицина, стрептомицина и 10% FCS в суспензию костного мозга и отвертите при 1300 x g в течение 10 мин.
  4. Еще раз процедите, чтобы удалить мусор эритроцитов, и снова суспендируйте в небольшом объеме RPMI-C 10% для подсчета.
  5. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек (рисунок 1B). Для определения количества и жизнеспособности клеток в суспензии использовали счетчик Vi-клеток.

5. Сервировка и культура

  1. Добавьте 10 мл RPMI-C 10% + 10 нг/мл m-CSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор, важный регулятор пролиферации, дифференцировки и выживаемости моноцитов/макрофагов) в любое количество 10-сантиметровых пластин.
  2. Прибавьте соответствующий объем подсчитанных ячеек так, чтобы каждая пластина длиной 10 см содержала 1 x 106 ячеек. Поместите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C (определяется как день 0).
  3. На 3-й день аккуратно добавьте 5 мл свежего RPMI-C 10% + 10 нг/мл M-CSF в каждую тарелку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 7-й день БМДМ должны быть готовы к испытаниям (Рисунок 1C).

6. Сбор урожая с тарелок

  1. Используйте световой микроскоп, чтобы подтвердить, что большинство клеток прилипли к пластинам.
  2. Аккуратно аспирируйте среду. Затем добавьте 3 мл PBS и аккуратно перемешайте пластину. Хорошо аспирируйте его, чтобы удалить все оставшиеся неадгезивные клетки.
  3. Добавьте в планшет 7-10 мл холодного PBS, с помощью пипетки P1000 промойте дно пластин и соберите все оставшиеся клетки в пробирку для сбора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пробирки на льду, так как макрофаги очень плотно прилегают и прилипают к внутренней части пробирки. Если бы клетки оставались холодными, они были бы менее плотно прилегающими.
  4. Центрифуга, счетные и планшетные ячейки для экспериментов (рис. 1D). С помощью проточной цитометрии полученные клетки должны быть на >95% положительными к CD11b и F4/80. (поляризацию макрофагов определяли путем окрашивания М1-подобными маркерами CD38, TNF-a и MCP-1 и М2-подобным маркером CD206.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 6.1-6.3 в шкафу биобезопасности и выполните шаг 6.4 на столе. Придерживайтесь асептических техник на протяжении всей процедуры.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Графический процесс культивирования костного мозга мышей из макрофагов, полученных из BM. (A) Забор ножки, обнажение бедренной кости и промывка костного мозга; (b) лизис эритроцитов; (В) Сервировка и культура; (D) Забор клеток из планшетов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

7. За день до анализа метаболического потока: посев и поляризация клеток для гликолитического теста

  1. Нагрейте анализатор метаболических потоков до 37 °C, включив прибор.
  2. Увлажните картридж, добавив 200 μL раствора Calibrant, и инкубируйте картридж в инкубаторе безCO2 на ночь (рис. 2A). Влажность в инкубаторе без CO2 не имеет значения для гидратации картриджа.
    1. За час до эксперимента опустите пластину несколько раз вверх и вниз, что поможет удалить пузырьки воздуха.
  3. Разработайте карту планшета в программном обеспечении в стандартном стресс-тесте гликолиза - острой инъекции, следуя инструкциям теста.
    1. Нажмите на значок программного обеспечения, а затем нажмите на Гликолиз стресс-острый инъекционный тест. На значке определения группы сгенерируйте имена групп.
  4. Существует пять циклов измерения продолжительностью 18 минут и четыре инъекции. Измените инъекцию порта А на глюкозу, порта В на олигомицин, порта С на ротенон и антимицин А (Rot/AA), а порт D на 2DG.
  5. Повторно суспендировать клетки в RPMI-C в 10% среде и затравке 50k клеток на лунку, за исключением четырех краев планшета (A1, A12, H1 и H12; Добавьте только среды, без клеток) в микропланшет анализатора метаболического потока до конечного объема 100 μл. Обычно для проведения этого анализа требуется минимум 40 тыс. клеток.
  6. Дайте клеткам постоять при комнатной температуре в течение 45 минут, чтобы избежать краевого эффекта клеток. Краевой эффект возникает, когда среда по периметру пластины частично испаряется, что вызывает изменения объема и концентрации и снижает жизнеспособность клеток.
  7. Добавьте 10 нг/мл ЛПС, чтобы поляризовать наивные макрофаги в сторону М1-подобных клеток, и добавьте 20 нг/мл IL-4, чтобы поляризовать их в сторону М2-подобных клеток. Используйте не менее 3–6 скважин для каждого условия (Рисунок 2B).
  8. Проверьте клетки под микроскопом и поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 24 часа.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Графическая демонстрация затравки и поляризации ячеек. (A) Настройка анализатора внеклеточного потока и гидратация картриджа; (Б) Поляризация клеток и ночная инкубация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

8. День проведения анализа: XF Medium и комбинированный препарат

  1. Дополните 100 мл среды для анализа XF RPMI (pH 7,4) 2 мМ глутамина.
  2. Фильтруйте и стерилизуйте фильтрующий материал с помощью вакуумной фильтрующей системы 0,2 мкм.
  3. Поместите пробирный материал на водяную баню при температуре 37°C на 20 минут.
  4. Извлеките металлизированные клетки из инкубатора с температурой 37 °C, 5% CO2 . Дважды промыть ячейки пробирной средой и заменить предыдущую среду на пробирную среду до конечного объема 180 μл.
  5. С помощью микроскопа убедитесь, что во всех лунках есть сливающиеся клетки, и отметьте все лунки, на которых есть царапины от пипетирования. Если есть царапины, снимите эту пластину перед анализом.
  6. Поместите камеру, содержащую клетки, в инкубатор без CO2 на 45 минут (рисунок 3A).
  7. Использование соединений и тестовых сред для получения исходных растворов глюкозы (100 мМ), олигомицина (100 мкМ), Rot/AA (50 мкМ) и 2DG (500 мМ) (Таблица 1).
  8. Сделайте 10-кратное инъекционное введение смеси каждого соединения с использованием пробирного материала (Таблица 2).
Инъекционные приклады (предоставляются в комплектах)Добавить Полная пробирная среда (мл)Конечная концентрация запаса (μM)
Глюкоза3100 тыс.
Олигомицин0.72100
2-ДГ3100 тыс.

Таблица 1. Инъекционные заготовки

Порты на картриджеСтоковые решенияДобавить объем складских запасовДобавить пробирный материалКонечная концентрация инъекций (10x)Добавьте этот объем к указанному порту (μL)Конечная концентрация после закачки в каждую скважину
AГлюкоза (100 мМ)3000 мкл + 0 мкл100 мМ2010 мМ
BОлигомицин (100 мкМ)300 мкл + 2700 мкл10 μМ221,0 мкМ
CРотенон/антимицин А (50 мкМ)300 мкл + 2700 мкл5 мкМ250,5 мкМ
D2-ДГ (500 мМ)300 мкл + 0 мкл500 мМ2850 мМ

Таблица 2. Концентрации при окончательном впрыске

9. День проведения анализа: Проведение острого гликолитического теста на поляризованных макрофагах

  1. Откройте сохраненный шаблон анализа напряжения гликолиза (острая инъекция) из программного обеспечения. Стандартный тест на острый гликостресс-тест включает 3 минуты смешивания и измерения перед каждой инъекцией.
  2. Проверьте шаблон и детали анализа, а когда будете готовы, нажмите «Выполнить» и следуйте инструкциям анализа по умолчанию. Тем не менее, все параметры можно настроить.
  3. Извлеките картридж датчика из инкубатора, не содержащего CO2 , снимите крышку и вставьте прибор таким образом, чтобы отверстие A1 пластины картриджа попадало в верхний левый угол панели вставки машины. Обычно калибровка занимает от 20 до 45 минут.
  4. После завершения калибровки устройство извлечет пластину, содержащую раствор калибра, и будет удерживать картридж датчика. Снимите калибр, в котором находится пластина.
  5. Извлеките клеточную пластину из инкубатора, не содержащего CO2 , снимите крышку пластины и вставьте ее в машину. Нажмите кнопку "Выполнить" (рисунок 3B).
  6. Когда анализ будет завершен, машина извлечет клеточную пластину и картридж датчика.
  7. Снимите носитель с плиты и заморозьте его при температуре -20 °C для дальнейшей нормализации.
  8. Используйте коммерческий набор для анализа пролиферации клеток (например, CyQUANT) для нормализации клеток.
  9. Добавьте 1 мл соединения B или буфера для лизиса в 19 мл дистиллированной воды, не содержащей нуклеаз.
  10. Добавьте в указанный раствор 100 μл рабочего раствора Соединения А или GR.
  11. Убедитесь, что ячейки в планшете размораживаются, а затем добавьте по 200 мкл раствора в каждую лунку.
  12. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
  13. Измерьте флуоресценцию на длинах волн возбуждения 480 нм и длинах волн излучения 520 нм с помощью считывателя пластин.
  14. Нормализуйте ячейки на панели нормализации программного обеспечения.
  15. Нормализация клеток на основе наивного количества клеток макрофагов (рисунок 3C). Примите среднее значение наивных макрофагов как 1 (разделив число клеток каждой лунки на среднее число клеток наивных макрофагов) и примените его ко всем макрофагам.

figure-protocol-3
Рисунок 3: День проведения анализа: приготовление сред и соединений и проведение анализа. (A) Подготовка клеток к анализу; (В) Приготовление соединений, калибровка и проведение анализа; (C) Нормализация и анализ данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гликолиз и митохондриальное окислительное фосфорилирование являются двумя основными путями производства АТФ в клетках (рисунок 4A). Некоторые клетки обладают способностью переключаться между этими двумя путями для удовлетворения своих потребностей в энергии. Превращение глюкозы в пируват в цитоплазме называется гликолизом. У Пирувата две судьбы; он либо преобразуется в лактат, либо далее метаболизируется через цикл ТСА и, в конечном итоге, через цепь переноса...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как упоминалось ранее, анализатор внеклеточного потока может предоставлять информацию в режиме реального времени о двух основных энергетических путях клеток, измеряя OCR (скорость потребления кислорода), показатель активности митохондриального OXPHOS, и ECAR (скорость внеклеточного закисления), которая является индикатором гликолиза. Макрофаги могут использовать оба пути, в зависимости от их микроокружения. Они также могут переключать свои пути производства энергии

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим г-жу Джоанну Роча за помощь в редактировании. Работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R01DK118334 (докторам Сану и Аланизу) и (NIH) R01A11064Z (докторам Джаяраману и Аланизу).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Иглы 23GVWRBD305145
2-меркаптоэтанолLife Technologies21985023
50мл Коническая трубкаVWR21008-951
ACK буфер для лизисаThermo Fisher ScientificA1049201Это может быть лабораторный набор
стресс-тестов гликолиза Agilent Seahorse XFAgilent Technologies103020-100
Agilent Seahorse XF Набор для стресс-тестов на гликолиз Руководство пользователяAgilent Technologies103020-400
Agilent Seahorse XF Набор для анализа гликолитической скоростиAgilent Technologies103344-100
Agilent Seahorse XF Набор для анализа гликолитической скорости Руководство пользователяAgilent Technologies103344-100
Alexa Fluor 488 антимышиный CD206 (MMR) антителоBioLegend141710
anti-mouse CD11b eFluor450 100ugeBioscience48-0112-82
BD 3ML - ШПРИЦVWRДругие шприцы тоже приемлемы
Клеточный счетчик Vi-CELL- XR Complete SystemBECKMAN COULTER Life Sciences731050Клетки тоже можно подсчитать вручную
Cell Strainer-70&микро; mVWR10199-656
CyQUANT Набор для анализа пролиферации клетокThermo Fisher ScientificC7026
F4/80 моноклональное антитело (BM8) pe-Cyanine7eBioscience25-4801-82
Фетальная бычья сыворотка LifeTechnologies16000-044
Проточный цитометр: BD LSFRFortessa X-20BD656385
Kim WipesVWR82003-822
LPS-SM ультрачистый (tlrl-smpls) 5 мгInvivogentlrl-smlps
MCSFPeprotech315-02
Murine IL-4Peprotech214-14
PE Rat Anti-Mouse CD38BD Biosciences553764
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Life Technologies15140122
Чашка Петри 100 мм x 15 ммFisher ScientificF80875712
RPMI, Glutamax, HEPESInvitrogen72400-120
Морской конек Калибр РастворAgilent Technologies103059-000
Морской конек XF 200mM Раствор глютаминаAgilent Technologies103579-100
Seahorse XF Набор для анализа гликолитической скоростиAgilent Технологии103344-100
Seahorse XFe96 FluxPaksAgilent Technologies102416-100
XF Набор для стресс-тестов на гликолизAgilent Technologies103020-100
XF RPMI Medium, pH 7,4 без фенола RedAgilent Technologies103336-100
для BD309657

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 13 (1), (2020).
  2. Martinez-Pomares, L., Gordon, S. The Autoimmune Diseases. , Elsevier. 191-212 (2020).
  3. Orecchioni, M., Ghosheh, Y., Pramod, A. B., Ley, K. Macrophage polarization: different gene signatures in M1 (LPS+) vs. classically and M2- (LPS–) vs. alternatively activated macrophages. Frontiers in immunology. 10, 1084(2019).
  4. Barrett, T. J. Macrophages in atherosclerosis regression. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (1), 20-33 (2020).
  5. Ni, Y., et al. Adipose tissue macrophage phenotypes and characteristics: the key to insulin resistance in obesity and metabolic disorders. Obesity. 28 (2), 225-234 (2020).
  6. Chu, C., et al. Modulation of foreign body reaction and macrophage phenotypes concerning microenvironment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 108 (1), 127-135 (2020).
  7. Batista-Gonzalez, A., Vidal, R., Criollo, A., Carreño, L. J. New insights on the role of lipid metabolism in the metabolic reprogramming of macrophages. Frontiers in Immunology. 10, 2993(2020).
  8. Kang, S., Kumanogoh, A. The spectrum of macrophage activation by immunometabolism. International Immunology. , (2020).
  9. Shi, Y., et al. M1 But Not M0 Extracellular Vesicles Induce Polarization of RAW264. 7 Macrophages Via the TLR4-NFκB Pathway In Vitro. Inflammation. , 1-9 (2020).
  10. Zhang, L., Li, S. Lactic acid promotes macrophage polarization through MCT-HIF1α signaling in gastric cancer. Experimental Cell Research. 388 (2), 111846(2020).
  11. Geng, T., et al. CD137 signaling induces macrophage M2 polarization in atherosclerosis through STAT6/PPARδ pathway. Cellular Signalling. , 109628(2020).
  12. Liu, Q., et al. Combined blockade of TGf-β1 and GM-CSF improves chemotherapeutic effects for pancreatic cancer by modulating tumor microenvironment. Cancer Immunology & Immunotherapy. , 1-16 (2020).
  13. Rigoni, T. S., et al. RANK Ligand Helps Immunity to Leishmania major by Skewing M2 Into M1 Macrophages. Frontiers in Immunology. 11, 886(2020).
  14. Viola, A., Munari, F., Sánchez-Rodríguez, R., Scolaro, T., Castegna, A. The metabolic signature of macrophage responses. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  15. Ivashkiv, L. B. The hypoxia–lactate axis tempers inflammation. Nature Reviews Immunology. 20 (2), 85-86 (2020).
  16. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).
  17. Van den Bossche, J., et al. Mitochondrial dysfunction prevents repolarization of inflammatory macrophages. Cell reports. 17 (3), 684-696 (2016).
  18. Liu, P. S., Ho, P. C. Metabolic Signaling. , Springer. 173-186 (2019).
  19. Wang, F., et al. Glycolytic stimulation is not a requirement for M2 macrophage differentiation. Cell metabolism. 28 (3), 463-475 (2018).
  20. Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. Quantifying Cellular ATP Production Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Agilent Technologies, Inc. (2018).
  21. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).
  22. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).
  23. Yang, S., et al. Macrophage polarization in atherosclerosis. Clinica Chimica Acta. 501, 142-146 (2020).
  24. Hörhold, F., et al. Reprogramming of macrophages employing gene regulatory and metabolic network models. PLoS Computational Biology. 16 (2), e1007657(2020).
  25. Han, X., Ma, W., Zhu, Y., Sun, X., Liu, N. Advanced glycation end products enhance macrophage polarization to the M1 phenotype via the HIF-1α/PDK4 pathway. Molecular and Cellular Endocrinology. , 110878(2020).
  26. Müller, E., et al. Toll-like receptor ligands and interferon-γ synergize for induction of antitumor M1 macrophages. Frontiers in Immunology. 8, 1383(2017).
  27. Soto-Heredero, G., Gómez de las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis–a key player in the inflammatory response. The FEBS Journal. , (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

M1 like Macrophage PolarizationM2 like Macrophage PolarizationExtracellular Flux AnalysisDNA based NormalizationMacrophage Culture ProtocolLPS ActivationIL4 StimulationMetabolic Phenotyping
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи