В настоящем исследовании экспрессия сбивается двумя нисходящими сигнальными компонентами пути PERK, цитопротекторным кальциневрином и проапоптотическим CHOP, с использованием специфических шРНК. Противоположным образом, они модулируют восприимчивость первичных корковых нейронов к атрофии нейритов после индукции стресса эндоплазматического ретикулума.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Молекулярная модуляция доставляемыми лентивирусом специфическими шРНК в нейронах, подверженных стрессу эндоплазматического ретикулума
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Накопление развернутых белков в эндоплазматическом ретикулуме (ER), вызванное любым стрессовым состоянием, вызывает реакцию развернутого белка (UPR) посредством активации специализированных датчиков. УПО пытается сначала восстановить гомеостаз; Но если повреждение сохраняется, передача сигналов вызывает апоптоз.
Появляется все больше доказательств того, что устойчивый и неразрешенный стресс ER способствует развитию многих патологических состояний, включая нейродегенеративные заболевания. Поскольку UPR контролирует судьбу клеток, переключаясь между цитопротекторными и апоптотическими процессами, важно понимать события, определяющие этот переход, а также элементы, участвующие в его модуляции.
Недавно мы продемонстрировали, что аномальное накопление ганглиозидов GM2 вызывает истощение содержания ERCa 2+ , что, в свою очередь, активирует PERK (PKR-подобную киназу ER), один из датчиков UPR. Кроме того, передача сигналов PERK участвует в атрофии нейритов и апоптозе, вызванных накоплением GM2. В связи с этим мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам молекулярно модулировать экспрессию нижестоящих компонентов PERK и, таким образом, изменять уязвимость нейронов к нейритной атрофии.
Мы выполнили нокдаун экспрессии кальциневрина (цитопротекторного) и CHOP (проапоптотического) в культурах нейронов коры крыс. Клетки инфицировали доставляемой лентивирусом специфической шРНК, а затем обрабатывали GM2 в разное время, фиксировали и иммуноокрашивали антителом против MAP2 (микротрубка-ассоциированный белок 2). Позже изображения клеток были записаны с помощью флуоресцентного микроскопа, а общий рост нейрита был оценен с помощью общедоступного программного обеспечения для обработки изображений ImageJ. Ингибирование экспрессии этих сигнальных компонентов PERK явно позволяло либо ускорить, либо отсрочить нейритную атрофию, вызванную стрессом ER.
Этот подход может быть использован в моделях клеточной системы стресса ER для оценки уязвимости нейронов к атрофии нейритов.
Введение
Стресс эндоплазматического ретикулума (ER) определяется как любое возмущение, которое ставит под угрозу способность сворачивать белок в органелле. Накопление развернутых белков в просвете ER активирует сигнал каскада трансдукции, называемый развернутым белковым ответом (UPR). Этот сложный сигнальный путь управляется тремя датчиками стресса: PERK (протеинкиназная РНК [PKR]-подобная ER-киназа), IRE1 (инозитол-требующий фермент 1) и ATF6 (активированный транскрипционный фактор 6). Все вместе пытаются восстановить гомеостаз. Но если стресс сохраняется, UPR в конечном итоге вызывает гибель клеток путем апоптоза1.
PERK, тр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Процедуры на животных выполняются в соответствии с утвержденными протоколами Руководства Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Разрешение на проведение исследования выдается Комитетом по уходу за животными и этике (CICUAL) INIMEC-CONICET-UNC (резолюции No 014/2017 B и 006/2017 A).
1. Первичные культуры нейронов коры крысы
- Анестезируйте беременных крыс E18 Wistar в камере CO 2 смесью 80% CO 2/20% O 2 в течение 60 с воздействия, а затем жертвуйте, затем вывихивая шейные позвонки.
- Выполните следующие действия в вытяжном шкафу с ламинарным пот....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы рассматриваем вопрос о том, влияет ли молчание двух последующих компонентов PERK на переходную фазу UPR в модели стрессовых клеток ER. Чтобы достичь этого, мы заглушаем ген CN-Aα, а также ген CHOP двумя специфическими последовательностями шРНК для каждой (таблица 1) в культуре клеток первичных нейронов в течение 1 дня10. Выражение анализируется методом вестерн-блоттинга (рис. 1 и рис. 2). Наблюда.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описываем экспериментальную систему, которая обеспечивает молекулярную модуляцию перехода от фаз выживания к апоптотическим фазам UPR в модели нейрональной клетки.
Для правильного анализа атрофии нейритов необходимо получить первичные культуры нейронов с многочисленными, длинными, сильно разветвленными отростками 9,11. Это облегчает изучение расширения нейронного процесса, позволяя обнаружить четкие различия между методами лечения. .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим доктора Гонсало Квасолло за его неоценимую помощь в визуализации и доктора Андреа Пеллегрини за техническую поддержку клеточных культур.
Это исследование было поддержано грантами: Национального института здравоохранения, США (#RO1AG058778-01A1, Соглашение No 165148/165147 между UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) и Национального агентства Национального агентства по развитию науки и технологий, Аргентина (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| анти-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| анти-&бета;-актин | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| апротинин | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 эпифлуоресцентный микроскоп | Zeiss | ||
| B27 дополнение | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Фетальная сыворотка для теленков (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Щипцы с тонкими наконечниками стиль #5 | Пинцеп Dumont | ||
| стиль #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW вторичное антитело | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 вторичное антитело | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW вторичное антитело | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW вторичное антитело | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| лентивирусная оболочка плазмида pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| лентивирусная упаковка плазмида psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| лентивирусный вектор pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| лейпептин гемисульфат | Santa Cruz Biotechnology | #295358 | |
| липофектамин LTX & Плюс Реагент (плазмидный реагент для трансфекции) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSION shRNA | Sigma Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Нитроцеллюлозная мембрана 0,45 & микро; m | BIO-RAD | #1620115 | |
| Система инфракрасной визуализации Odyssey | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Reduced serum media) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| пенициллин-стрептомицин | Life Technologies | #15140122 | |
| Пепстатин А Санта | Круз Биотехнология | # 45036 | |
| фенилметилсульфонилфторид | Санта Круз Биотехнология | # 329-98-6 | |
| Поли-L-лизин | сигма олдрич | P # 2636 | |
| Прямые острые маленькие пружинные ножницы | Fine Science Tools | ||
| T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Трипсин-ЭДТА 0,25 % | Life Technologies | #25200056 | |
| Ультразвуковой жидкостный процессор Vibra-Cell (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard plus SV Minipreps система очистки ДНК | Promega | #A1330 |
Ссылки
- Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
- Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its act....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
