Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Молекулярная модуляция доставляемыми лентивирусом специфическими шРНК в нейронах, подверженных стрессу эндоплазматического ретикулума

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61974

⸱

24 апреля 2021 г.

 ,  , 
1Instituto de Investigación Médica M y M Ferreyra, INIMEC-CONICET, Universidad Nacional de Córdoba

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем исследовании экспрессия сбивается двумя нисходящими сигнальными компонентами пути PERK, цитопротекторным кальциневрином и проапоптотическим CHOP, с использованием специфических шРНК. Противоположным образом, они модулируют восприимчивость первичных корковых нейронов к атрофии нейритов после индукции стресса эндоплазматического ретикулума.

Аннотация

Накопление развернутых белков в эндоплазматическом ретикулуме (ER), вызванное любым стрессовым состоянием, вызывает реакцию развернутого белка (UPR) посредством активации специализированных датчиков. УПО пытается сначала восстановить гомеостаз; Но если повреждение сохраняется, передача сигналов вызывает апоптоз.

Появляется все больше доказательств того, что устойчивый и неразрешенный стресс ER способствует развитию многих патологических состояний, включая нейродегенеративные заболевания. Поскольку UPR контролирует судьбу клеток, переключаясь между цитопротекторными и апоптотическими процессами, важно понимать события, определяющие этот переход, а также элементы, участвующие в его модуляции.

Недавно мы продемонстрировали, что аномальное накопление ганглиозидов GM2 вызывает истощение содержания ERCa 2+ , что, в свою очередь, активирует PERK (PKR-подобную киназу ER), один из датчиков UPR. Кроме того, передача сигналов PERK участвует в атрофии нейритов и апоптозе, вызванных накоплением GM2. В связи с этим мы создали экспериментальную систему, которая позволяет нам молекулярно модулировать экспрессию нижестоящих компонентов PERK и, таким образом, изменять уязвимость нейронов к нейритной атрофии.

Мы выполнили нокдаун экспрессии кальциневрина (цитопротекторного) и CHOP (проапоптотического) в культурах нейронов коры крыс. Клетки инфицировали доставляемой лентивирусом специфической шРНК, а затем обрабатывали GM2 в разное время, фиксировали и иммуноокрашивали антителом против MAP2 (микротрубка-ассоциированный белок 2). Позже изображения клеток были записаны с помощью флуоресцентного микроскопа, а общий рост нейрита был оценен с помощью общедоступного программного обеспечения для обработки изображений ImageJ. Ингибирование экспрессии этих сигнальных компонентов PERK явно позволяло либо ускорить, либо отсрочить нейритную атрофию, вызванную стрессом ER.

Этот подход может быть использован в моделях клеточной системы стресса ER для оценки уязвимости нейронов к атрофии нейритов.

Введение

Стресс эндоплазматического ретикулума (ER) определяется как любое возмущение, которое ставит под угрозу способность сворачивать белок в органелле. Накопление развернутых белков в просвете ER активирует сигнал каскада трансдукции, называемый развернутым белковым ответом (UPR). Этот сложный сигнальный путь управляется тремя датчиками стресса: PERK (протеинкиназная РНК [PKR]-подобная ER-киназа), IRE1 (инозитол-требующий фермент 1) и ATF6 (активированный транскрипционный фактор 6). Все вместе пытаются восстановить гомеостаз. Но если стресс сохраняется, UPR в конечном итоге вызывает гибель клеток путем апоптоза1.

PERK, трансмембранный белок ER, при стрессе ER приводит к фосфорилированию эукариотического фактора инициации-2 альфа (eIF2α), снижая глобальный синтез белка и, следовательно, белковую нагрузку в ER2. Показано, что кальциневрин A/B (CNA/B), гетеродимерная фосфатазаCa2+, непосредственно связывает цитозольный домен PERK, увеличивая его аутофосфорилирование и значительно усиливая ингибирование трансляции белка и жизнеспособность клеток 3,4. Интересно, что CNA/B в изобилии встречается в мозге млекопитающих, различая две изоформы субъединицы A CN: α и β.

При длительном стрессе ER сигнальный путь PERK является единственной ветвью UPR, которая остается активированной, тем самым опосредуя как выживаемость, так и апоптотическую реакцию. В хронической фазе одним из основных последующих событий является индукция фактора транскрипции, CHOP (гомологичный белок, связывающий CCAAT/энхансер)5. Хронический стресс ER также все чаще признается в качестве общего фактора, способствующего широкому спектру патологических расстройств, включая нейродегенеративные заболевания6. Важно понять, как УПО может способствовать цитопротекторной передаче сигналов вместо гибели клеток 7. Однако в настоящее время мало что известно о точном механизме, контролирующем переход между этими двумя фазами УПО.

Недавно мы обнаружили, что в культивируемых нейронах ганглиозид GM2 накапливается в мембранах ER и индуцирует истощение кальция в просвете. Это, в свою очередь, активирует передачу сигналов PRK, которая опосредует атрофию нейритов и апоптоз 8. В этом исследовании накопление GM2 в культивируемых нейронах используется в качестве модели клеточной системы атрофии нейритов, вызванной стрессом ER. В частности, манипулируются двумя экспрессиями фактора PERK, CN-Aα и CHOP, которые переключают переход между ранними/защитными событиями и хронической/апоптотической фазой. Для этого соответствующие гены заглушаются; таким образом, первичные культуры корковых нейронов инфицируются доставляемой лентивирусом специфической шРНК. Вестерн-блоттинг выявляет значительное снижение уровней экспрессии CN-Aα и CHOP по сравнению с контрольными клетками, инфицированными лентивирусом, несущим скремблированную шРНК. После этого лечения нейроны подвергаются различным инкубационным периодам экзогенного GM2, фиксированного и иммуноокрашенного антителом 9 к ассоциированному белку 2 (MAP2)против микротрубочек. Изображения получаются с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Общий рост нейрита оценивается по отношению к общему количеству клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры на животных выполняются в соответствии с утвержденными протоколами Руководства Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Разрешение на проведение исследования выдается Комитетом по уходу за животными и этике (CICUAL) INIMEC-CONICET-UNC (резолюции No 014/2017 B и 006/2017 A).

1. Первичные культуры нейронов коры крысы

  1. Анестезируйте беременных крыс E18 Wistar в камере CO 2 смесью 80% CO 2/20% O 2 в течение 60 с воздействия, а затем жертвуйте, затем вывихивая шейные позвонки.
  2. Выполните следующие действия в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Извлеките головной мозг из эмбрионов с помощью щипцов #3 и прямых острых маленьких пружинных ножниц (Таблица материалов) для раствора Хэнкса в чашках для клеточных культур.
  3. Рассеките ткань под 20-кратным увеличительным стеклом, используя два щипца с тонким наконечником в стиле #5, отделяющих лобную кору от мозговых оболочек. Перенесите лобную кору в коническую трубку объемом 15 мл и инкубируйте ткань с 3-4 мл трипсина-ЭДТА (0,25%) в течение 15 минут при 37 ° C для химического разложения.
  4. После пищеварения разбавьте его 3-4 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Затем промойте его 3 раза раствором сбалансированной соли Хэнкса без Ca 2+/Mg2+ и 0,1% глюкозы центрифугированием (3000 г в течение 5 мин).
  5. Механически диссоциируйте ткань 10 раз, пипеткой вверх и вниз с помощью наконечника 1000 мкл в DMEM плюс 10% FCS (таблица материалов). Затем центрифугируют гомогенат при 100 х г в течение 1 мин, собирают надосадочную жидкость и заполняют оставшийся объем до 1000 мкл.
  6. Планшет клеточной суспензии на чашках для клеточных культур плотностью 520 клеток/мм 2 с2 мл DMEM, содержащего 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина и 1% незаменимой аминокислотной добавки (см. Таблицу материалов). Затем инкубировать при 37 °C в увлажненной среде с 5%CO2 в течение 2 ч.
    1. Удаление органических веществ и поли-L-лизиновое покрытие чашек для культивирования клеток
      1. Удалите органическое вещество, поместив стеклянный материал в реакционную камеру и добавив 96% этилового спирта, чтобы покрыть материал. Затем добавляйте 68% (мас./об.) азотной кислоты по каплям, пока не начнут появляться коричневато-зеленоватые пузырьки. Как только это произойдет, частично накройте контейнер и дайте реакции продолжаться до тех пор, пока взрыв не прекратится.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите органические вещества под кабиной для вытяжки газа, чтобы избежать воздействия вредных газов.
      2. Перед нанесением поли-L-лизинового покрытия промойте стаканы стерильной водой Mili-Q около десяти раз. Затем инкубируют культуральные стаканы и чашки с 0,1 мкг/мкл поли-L-лизина в течение 4 ч перед использованием. После инкубации ополосните стаканы стерильной водой Mili-Q около десяти раз.
  7. Чтобы обеспечить дифференцировку нервных клеток, замените среду на нейробазальную среду без сыворотки с добавкой без сыворотки (таблица материалов). Хранить культуры при температуре 37 °C с содержаниемСО2 5% до обработки.

2. Производство лентивирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотиды, содержащие последовательности, нацеленные на 3'UTRs изоформы CN-Aα или CHOP, и с нецелевыми последовательностями (скремблами), перечислены в таблице 1.

  1. Для отжига смешайте два одноцепочечных олигонуклеотида с комплементарными последовательностями в равных молярных количествах, используя буфер для отжига (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА).
  2. Нагрейте при 95 °C в течение 2 минут, а затем медленно охладите, перенеся образцы из нагревательного блока или водяной бани на столешницу при комнатной температуре. Разбавьте полученный продукт [короткую шпилечную РНК (шРНК) с когезионными концами] до конечной концентрации 0,5 мкМ, аликвотируйте их и храните при -20 °C.
  3. Клонируйте вставку шРНК в лентивирусный вектор pLKO.3G с GFP в качестве зеленого флуоресцентного маркера. Для этого переваривают 1 мкг вектора с ферментами рестрикции EcoRI и PacI, смешивая в стерильной пробирке следующее: 2 мкл 10-кратного буфера рестрикционного фермента (100 мМ бис-трис пропана-HCl, рН 6,5, 100 мМ MgCl2, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина), 1 мкл 1 мкг/мкл pLKO.3G, 0,5 мкл 10 ЕД/мкл ECoRI, 0,5 мкл PacI (10 ЕД/мкл) и 16 мкл стерильной ионизированной воды.
    1. Аккуратно перемешайте пипеткой. Инкубировать реакцию в течение 3-4 ч при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ночные пищеварения, как правило, не нужны и могут привести к деградации ДНК.
  4. Для лигирования смешайте переваренный вектор и вставьте в молярном соотношении 3:1 и инкубируйте его с лигазой Т4 и буфером лигазы (предоставленными производителем) в течение ночи при 16 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе реакцию лигирования можно хранить при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
  5. Трансформируют DH5α компетентные клетки (таблица материалов) или другой подходящий штамм E. coli с реакцией лигирования следующим образом.
    1. Смешайте компетентную кишечную палочку с общим объемом реакции лигирования и охладите ее на льду в течение 15 минут, поместите в ванну с температурой 42 ° C на 2 минуты, а затем снова охладите ее на льду в течение 15 минут.
    2. Перенесите весь объем, подвергшийся тепловому удару, в пробирку объемом 15 мл и дополните объем до 1000 мкл жидкой средой Лурия-Бертани (LB), которая ранее поддерживалась при температуре 37 °C. Встряхните бактерии в течение 90 мин при 37 ° C в орбитальном шейкере примерно при 330 об/мин.
    3. Центрифугируйте их при 5000 x g в течение 5 мин при 4 ° C и выбросьте 900 мкл надосадочной жидкости. Используйте оставшуюся надосадочную жидкость для ресуспендирования гранулы. Равномерно распределите суспензию бактерий по твердой пластине ампициллина (100 мкг / мл) LB.
    4. Инкубировать при 37 °C в течение ночи, затем проверить рост бактерий. На этом этапе бактерии могут храниться при температуре 4 ° C в течение 4-5 дней.
    5. Выберите одну колонию для переноса в пробирку объемом 50 мл с 10 мл жидкой среды LB и ампициллином (100 мкг / мл). Встряхните бактерии при 37 °C при примерно 330 об/мин.
    6. Центрифугируйте культуру, чтобы гранулировать бактерии в 5,000 x g в течение 5 мин при 4 ° C, выбросьте надосадочную жидкость и сохраните бактериальную гранулу. Его можно хранить при температуре -20 °C.
  6. Очистите плазмиду с помощью набора для очистки ДНК от гранул бактерий, следуя инструкциям производителя (таблица материалов). Рассчитайте концентрацию ДНК, измерив поглощение при 260 нм и умножив на коэффициент разбавления, используя следующее соотношение: A260 1,0 = 50 мкг/мл чистой двухцепочечной (ds) ДНК.

3. Лентивирусная инфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните процедуру генерации лентивируса в капюшоне с ламинарным потоком класса II.

  1. За 24 ч до трансфекции высевают семена 1-5 × 106 HEK 293 клетки в культуральные чашки диаметром 100 мм в 8 мл питательной среды и инкубируют их при 37 °C, 5% CO2 в течение ночи.
  2. Смешайте 14 мкг вектора pKLO.3G со специфической вставкой, 10,5 мкг упаковочной плазмиды psPAX и 3,5 мкг плазмиды оболочки pMD2.G (Таблица материалов). Разведите 45 мкл реагента для трансфекции плазмиды (Таблица материалов) в 700 мкл восстановленной сывороточной среды (Таблица материалов) и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем смешайте смесь ДНК с разбавленным реагентом для трансфекции плазмиды, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
  3. Между тем, замените на свежий DMEM среду чашки для культивирования клеточных культур HEK 293 (70% сливающихся во время трансфекции). Затем добавьте весь объем раствора ДНК по каплям. Аккуратно покачайте блюдо. Нет необходимости добавлять/менять среду после трансфекции.
  4. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2 в течение 48-72 часов, чтобы позволить шРНК достичь оптимальной трансдукции, проверенной флуоресценцией GFP с помощью флуоресцентного микроскопа. После этого соберите среду с лентивирусом и храните при температуре 4 °C.
  5. Фильтрат вирусной надосадочной жидкости с нейлоновой мембраной 0,45 мкм. Аликвота проточной в 1 мл. Затем центрифугу при 17 000 х г в течение 4 ч. Выбросьте надосадочную жидкость и законсервируйте гранулы. Дайте невидимым гранулам высохнуть, а после высыхания храните при температуре -80 °C.
    1. Выполняют титрование вирусов с помощью флюсовой цитометрии. Засейте 4 x 105 HEK 293 ячейки в 24-луночные планшеты и инкубируйте при 37 ° C в течение 24 часов. Затем ресуспендируют вирусные частицы в 200 мкл питательной среды DMEM (таблица материалов) и добавляют 0,05, 0,02 и 0,005 мкл в каждую лунку.
    2. Инкубировать вирусную инфекцию в течение 72 ч, удалить среду и трипсинизировать (0,05% трипсина, 1 мл) в течение 3 мин. Добавьте 1 мл DMEM в 10% раствор FCS и центрифугу при 500 x g в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и дважды промойте гранулы с помощью PBS.
    3. Ресуспендируют гранулу 100 мкл PBS и фиксируют ячейки 100 мкл 2% параформальдегида (PFA) в PBS. Проанализируйте клетки с помощью флюометрического цитометра и определите процент флуоресцентных клеток GFP. Соберите эти данные, чтобы рассчитать титрование вируса по следующей формуле:
      Титрование вирусов
      figure-protocol-1

4. Культуры первичных нейронов, подвергшиеся стрессу с накоплением ганглиозида GM2 и иммуноцитохимией с использованием антител против MAP2

  1. Инфицируют первичные культуры корковых нейронов (15 дней in vitro) специфическими олигонуклеотидами шРНК, нацеленными на 3'-UTR CN-Aα или CHOP, и инкубируют их при 37 ° C с 5% CO2 в течение 1 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные культуры корковых нейронов в течение 7-8 дней in vitro также могут быть использованы, если клетки демонстрируют высокий рост нейритов.
    1. Приготовьте 500 мкМ исходный раствор ганглиозида GM2 в этаноле и обработайте его ультразвуком в течение 1 часа.
    2. Добавьте исходный раствор GM2 в питательную среду в конечной концентрации 2 мкМ. Дайте инкубировать при 37 ° C с 5% CO2 в течение 16, 24 и 48 часов.
  2. Используйте некоторые культуры для приготовления клеточного гомогената для анализа вестерн-блоттинга (спецификацию антител см. в Таблице материалов).
  3. Выполните шаги 1.4. и 1.5. а затем зафиксируйте ячейки 4% PFA и сахарозой 120 мМ в PBS на 20 мин при 37 °C, а затем промойте PBS. Выполняйте эту процедуру на противоскользящей мембране во влажной камере. После этого добавьте раствор для пермеабилизации (0,2% Triton X-100 в PBS) в течение 5 минут и смойте PBS.
    1. Используйте 5% BSA, разведенный в PBS, в течение 45 мин, чтобы обеспечить блокировку, затем инкубируйте с антителом против MAP2, разбавленным 1:800 в блокирующем растворе, при 4 ° C в течение ночи.
    2. По окончании инкубационного времени дважды промыть PBS и инкубировать со вторичными антителами (Таблица материалов) в течение 1 ч. Затем промойте ячейки с помощью PBS и установите стекла на предметные стекла с помощью водной монтажной среды (Таблица материалов).

5. Анализ атрофии нейритов

  1. Получение изображений с помощью 20-кратной воздушной линзы (NA 0.8) с помощью эпифлуоресцентного инвертированного микроскопа, оснащенного ПЗС-камерой. Анализируйте изображения с помощью подключаемых модулей ImageJ. Для этого загрузите изображение в ImageJ и вычтите фон, нажав « Обработать» | Вычтите фон.
  2. Нажмите на изображение | Отрегулируйте | Пороговое значение или введите следующие клавиши: Ctrl (или Cmd) + Shift + T. Откроется окно для настройки минимальных значений, что позволит различить трассировку пути и сомы. Кликните по бинарному изображению (нейриты и сомы белого цвета). На этом изображении используйте выделение от руки, чтобы удалить сомы; Выбранная область сомы снова становится черной.
  3. Выберите трассировки и нажмите кнопку Редактировать | Выбор | Создать выделение. Получите ROI, нажав клавиши Ctrl (или Cmd) и T выделения, и сохраните его. Откройте исходное изображение, затем нажмите на панель менеджера ROI и выберите принадлежащий ROI, полученный ранее. Затем нажмите на исходное изображение.
  4. Как только ROI будет отслеживаться на изображении, введите клавиши Ctrl (или Cmd) и M (Analyze | Мера). Окно открывается; Скопируйте среднее значение (произвольные единицы а.е.) для обработки статистического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить значения в мкм, нажмите «Анализировать» | Установите масштаб. Откроется окно для установки значений. Убедитесь, что вы добавили правильный масштаб (Analyze | Set Scale) в зависимости от характеристик используемого микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Здесь мы рассматриваем вопрос о том, влияет ли молчание двух последующих компонентов PERK на переходную фазу UPR в модели стрессовых клеток ER. Чтобы достичь этого, мы заглушаем ген CN-Aα, а также ген CHOP двумя специфическими последовательностями шРНК для каждой (таблица 1) в культуре клеток первичных нейронов в течение 1 дня10. Выражение анализируется методом вестерн-блоттинга (рис. 1 и рис. 2). Наблюда...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описываем экспериментальную систему, которая обеспечивает молекулярную модуляцию перехода от фаз выживания к апоптотическим фазам UPR в модели нейрональной клетки.

Для правильного анализа атрофии нейритов необходимо получить первичные культуры нейронов с многочисленными, длинными, сильно разветвленными отростками 9,11. Это облегчает изучение расширения нейронного процесса, позволяя обнаружить четкие различия между методами лечения. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора Гонсало Квасолло за его неоценимую помощь в визуализации и доктора Андреа Пеллегрини за техническую поддержку клеточных культур.

Это исследование было поддержано грантами: Национального института здравоохранения, США (#RO1AG058778-01A1, Соглашение No 165148/165147 между UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) и Национального агентства Национального агентства по развитию науки и технологий, Аргентина (ANPCyT, PICT 2017 #0618).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 anti-MouseThermo Fisher Scientific#R37120
anti-CHOPThermo Fisher# MA1 - 250
Anti-CN-AαMillipore# 07-067
Anti-GM2Matreya#1961
анти-MAP2Sigma Aldrich# M2320
анти-&бета;-актинThermo Fisher# PA1 - 183
апротининSanta Cruz Biotechnology#3595
Axiovert 200 эпифлуоресцентный микроскопZeiss
B27 дополнениеLife Technologies#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies#11966025
EcoRIPromega#R6011
Фетальная сыворотка для теленков (FCS)Life Technologies#16000044
Щипцы с тонкими наконечниками  стиль #5Пинцеп Dumont
стиль #3Dumont
HEK 293ATCC#CRL-1573
IRDye 680 CW вторичное антителоLI-COR Biosciences#92632221
IRDye 680 вторичное антителоLI-COR Biosciences#92632220
IRDye 800 CW вторичное антителоLI-COR Biosciences#92632210
IRDye 800 CW вторичное антителоLI-COR Biosciences#92632211
лентивирусная оболочка плазмида pMD2.GAddgene#12259
лентивирусная упаковка плазмида psPAX2Addgene#12260
лентивирусный вектор pLKO.3GAddgene#14748
лейпептин гемисульфатSanta Cruz Biotechnology#295358
липофектамин LTX & Плюс Реагент (плазмидный реагент для трансфекции)Life Technologies#A12621
MISSION shRNASigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2Matreya#1502
NanoDrop 2000Thermo Scientific
Neurobasal MediumLife Technologies#21103049
Нитроцеллюлозная мембрана 0,45 & микро; mBIO-RAD#1620115
Система инфракрасной визуализации OdysseyLI-COR Bioscience
OneShot Top 10Life Technology#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)Life Technologies#105802
PacIBioLabs#R0547S
пенициллин-стрептомицинLife Technologies#15140122
Пепстатин А СантаКруз Биотехнология# 45036
фенилметилсульфонилфторидСанта Круз Биотехнология# 329-98-6
Поли-L-лизинсигма олдричP # 2636
Прямые острые маленькие пружинные ножницыFine Science Tools
T4 DNA LigasePromega#M1801
Трипсин-ЭДТА 0,25 %Life Technologies#25200056
Ультразвуковой жидкостный процессор Vibra-Cell (VCX 130)Sonics
Wizard plus SV Minipreps система очистки ДНКPromega#A1330

Ссылки

  1. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
  2. Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
  3. Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925(2010).
  4. Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
  5. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
  6. Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
  7. Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170(2009).
  8. Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
  9. Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
  10. Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
  11. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
  12. Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
  13. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
  14. Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ACHOPMAP2GM2
Молекулярная модуляция доставляемыми лентивирусом специфическими шРНК в нейронах, подверженных стрессу эндоплазматического ретикулума
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.