Методическая статья

Выделение и характеристика внеклеточных везикул, полученных из адипоцитов человека, с помощью фильтрации и ультрацентрифугирования

DOI:

10.3791/61979

⸱

19 апреля 2021 г.

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 2Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism, University of Oxford

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем выделение внеклеточных везикул (ВВ), полученных из адипоцитов человека, из ягодичной и абдоминальной жировой ткани с помощью фильтрации и ультрацентрифугирования. Мы характеризуем выделенные ВВ, полученные из адипоцитов, определяя их размер и концентрацию с помощью анализа с отслеживанием наночастиц и вестерн-блоттинга на наличие гена восприимчивости опухоли к ВВ-белку 101 (TSG101).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой покрытые липидами оболочки, которые несут биологически активные материалы, такие как белки, РНК, метаболиты и липиды. ВВ могут модулировать клеточный статус других клеток локально в тканевых микросредах или путем высвобождения в периферическую кровь. ВВ, полученные из адипоцитов, повышены в периферической крови и демонстрируют изменения в своем грузе (РНК и белке) во время метаболических нарушений, включая ожирение и диабет. ВВ, полученные из адипоцитов, могут регулировать клеточный статус соседних сосудистых клеток, таких как эндотелиальные клетки и резидентные макрофаги жировой ткани, способствуя воспалению жировой ткани. Изучение изменений в ВВ, полученных из адипоцитов, in vivo является сложным процессом, поскольку ВВ, полученные из периферической крови, очень неоднородны и содержат ВВ из других источников, а именно тромбоцитов, эндотелиальных клеток, эритроцитов и мышц. Таким образом, культура адипоцитов человека обеспечивает модельную систему для изучения ВВ, полученных из адипоцитов. Здесь мы предоставляем подробный протокол экстракции общих малых ВВ из питательных сред ягодичных и абдоминальных адипоцитов человека с использованием фильтрации и ультрацентрифугирования. Кроме того, мы демонстрируем использование анализа отслеживания наночастиц (NTA) для количественной оценки размера и концентрации EV и показываем присутствие гена восприимчивости к опухоли 101 (TSG101) белка EV в ягодичных и абдоминальных адипоцитах, производных от EV. Выделенные ВВ из этого протокола могут быть использованы для последующего анализа, включая просвечивающую электронную микроскопию, протеомику, метаболомику, секвенирование малых РНК, микрочипы, а также могут быть использованы в функциональных исследованиях in vitro/in vivo.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой покрытые липидами оболочки, несущие биологически активные материалы, такие как белки, микроРНК, метаболиты и липиды. Термин ВВ обозначает различные субпопуляции, которые включают экзосомы, микровезикулы (микрочастицы/эктосомы) и апоптотические тельца1. ВВ могут служить биомаркерами, поскольку они участвуют в патологической передаче сигналов и выделяются в биожидкости, включая кровь и мочу. ВВ могут модулировать клеточный статус других клеток локально в тканевых микросредах или путем высвобождения в периферическую кровь2. ВВ несут в себе черты родительской клетки, но дифференцировка каждой субпопуляции в первую очередь основана на размере ВВ и содержании белка, таких как маркеры ВВ, включая присутствие тетраспанинов (CD9, CD63 и CD81), гена восприимчивости к опухоли 101 (TSG101) и ALG-2-взаимодействующего белка X (ALIX). Эти белковые маркеры являются репрезентативными для эндосомального происхождения (CD9, CD63 и CD81) для экзосом, которые генерируются внутри многовезикулярных телец или представляют собой белки, связанные с отпочковыванием или блеббингом непосредственно из плазматической мембраны для микровезикул. Тем не менее, существует значительное перекрытие между этими субпопуляциями, и трудно различить отдельные субпопуляции в сложных биожидкостях, таких как плазма, сыворотка или моча.

Метаболические нарушения, включая ожирение, резистентность к инсулину и нарушения внеклеточной глюкозы, кислорода и воспаления, могут изменить размер и концентрацию ВВ и их груза. ВВ, полученные из адипоцитов, несут перилипин А, адипонектин и демонстрируют изменения в своем белке и РНК-грузе во время ожирения и диабета 3,4,5,6. ВВ, полученные из адипоцитов, регулируют клеточный статус соседних эндотелиальных клеток сосудов7 и резидентных макрофагов жировой ткани, способствуя воспалению жировой ткани и резистентности к инсулину 8,9,10,11. Изучение изменений в ВВ, полученных из адипоцитов, in vivo является сложным процессом, поскольку популяции ВВ, полученные из сложных биожидкостей, таких как плазма, сыворотка или моча, содержат ВВ из нескольких источников, таких как тромбоциты, эндотелиальные клетки, эритроциты и мышцы, которые участвуют в патогенезе метаболической дисфункции и заболевания.

Таким образом, культура и дифференцировка преадипоцитов человека in vitro обеспечивают модельную систему для изучения ВВ, полученных из адипоцитов. Здесь мы предоставляем подробный протокол экстракции общих малых ВВ из питательных сред клеточных культур адипоцитов человека с использованием шприцевой фильтрации и ультрацентрифугирования. Ультрацентрифугирование остается популярным методом изоляции электромобилей, поскольку он легко доступен и не требует предварительных специальных знаний. Тем не менее, другие методы, такие как осаждение, эксклюзионная хроматография и иммуноаффинный захват с использованием тетраспанинов, позволяют выделять EV из ряда биожидкостей, включая плазму, сыворотку, мочу и кондиционированные среды для клеточных культур. Каждый способ, включая описанный здесь протокол ультрацентрифугирования, позволяет получить препараты EV различной чистоты, поскольку эти методы могут совместно изолировать растворимые белки и липопротеины, которые могут маскироваться под EV. Сочетание этого протокола ультрацентрифугирования с другими методами, такими как центрифугирование по плотности, эксклюзионная хроматография и захват иммуноаффинности, значительно повышает чистоту изолированных электромобилей. Но, как и ультрацентрифугирование, эти другие методы не позволяют захватывать независимые субпопуляции EV из сложных образцов, таких как кровь, плазма и моча. Таким образом, культуры выбранных клеточных популяций остаются одним из наиболее надежных методов получения высоких выходов клеточно-специфичных ВВ. Каждый метод EV имеет ряд предостережений, и выбор метода может повлиять на типы выделенных EV и их концентрацию, что может привести к смещению последующих механистических исследований в области клеточной и тканевой сигнализации и определения EV-груза для диагностических исследований; эти методологические вопросы изоляции электромобилей обсуждаются в других разделах и в разделах об ограничениях ниже 4,12. В данной статье мы описываем выделение ВВ, полученных из адипоцитов человека, с помощью фильтрации и ультрацентрифугирования. Кроме того, мы демонстрируем использование анализа отслеживания наночастиц (NTA) для количественной оценки размера и концентрации EV и показываем наличие гена восприимчивости к опухоли белка EV 101 (TSG101) в наших EV, полученных из адипоцитов человека. Выделенные ВВ из этого протокола могут быть использованы для последующего анализа, включая просвечивающую электронную микроскопию, протеомику, метаболомику, секвенирование малых РНК, микрочипы, а также могут быть использованы в функциональных исследованиях in vitro/in vivo.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы были одобрены советом по институциональной этике при Оксфордском университете. Жировая ткань была получена путем пункционной биопсии под местной анестезией у здоровых добровольцев.

1. Приготовление среды для культивирования клеток и буферов

  1. Приготовьте буфер для расщепления коллагеназы, растворив коллагеназу H (1 мг/мл) в сбалансированном солевом растворе Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (без хлорида кальция и без хлорида магния) и стерильный фильтр с помощью порового шприцевого фильтра размером 0,2 мкм.
    1. Приготовьте буфер для расщепления коллагеназы не более чем за 10 минут до использования.
  2. Приготовьте питательную среду (GM) следующим образом: смесь питательных веществ F12 (DMEM/F12) Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 единиц/мл пенициллина, 100 μг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 0,5 нг/мл фактора роста фибробластов (FGF).
  3. Основную среду для дифференцировки (основную ДМ) готовят следующим образом: DMEM/F12 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина, 17 мкМ пантотената, 100 нМ человеческого инсулина, 10 нМ трийодо-L-тиронина, 33 мкМ биотина, 10 мкг/мл трансферрина и 1 мкМ дексаметазона.
  4. Готовят полную среду для дифференцировки (полную СД) путем добавления основного ДМ с этапа 1.3 0,25 мМ 3-изобутил-1-метилксантина и 4 мкМ троглитазона.
  5. Приготовьте 10 мМ исходных растворов жирных кислот, объединенных до 10% бычьего сывороточного альбумина (БСА), не содержащего жирных кислот, следующим образом.
    1. Растворите 16 г BSA в 160 мл среды DMEM/F12 и подогрейте до 37 °C. В трех отдельных конических пробирках объемом 50 мл отвесьте 150 мг олеата натрия, 139 мг пальмитата натрия и 151 мг линолеата натрия. Добавьте 50 мл подогретого раствора БСА в каждую пробирку и хорошо перемешайте путем многократного вортексирования.
    2. Верните трубки с олеатом и линолеатом на водяную баню при температуре 37 °C на 15 минут. Перемешиваем вортексом до полного растворения.
    3. Для раствора пальмитата поместите трубку на водяную баню при температуре 65 °C на 2-3 минуты. Энергично перемешивайте вортексом.
    4. Повторите шаг 1.5.3 до полного растворения - примерно 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые мелкие частицы все еще могут быть видны.
    5. Стерильно отфильтруйте растворы жирных кислот с помощью шприцевого фильтра с порами 0,2 мкм.
    6. Подтвердите концентрацию неэтерифицированных жирных кислот в каждом исходном растворе с помощью соответствующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы жирных кислот должны составлять 10 мМ (±10%), чтобы получить молярное соотношение 6:1 между жирными кислотами и БСА. Если концентрация выходит за пределы этого диапазона, стоковый раствор следует переделать. Исходные растворы могут быть аликвотированы и храниться при температуре -30 °C.

2. Биопсия жировой ткани человека

  1. Медленно процедите содержимое биопсийного шприца через стерильное клеточное ситечко длиной 200 мкм, прикрепленное к конической трубке объемом 50 мл, чтобы жировая ткань собралась в ситечке.
  2. Перенесите ситечко в новую коническую трубку объемом 50 мл и трижды промойте жировую ткань 10 мл HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться удалить сгустки крови и фиброзную ткань хирургическими ножницами или повторить промывку HBSS для удаления избытка эритроцитов.
  3. Взвесьте промытую салфетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы получаем 400-800 мг ткани с помощью пункционной биопсии.
  4. Поместите буфер для расщепления коллагеназы в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте промытую салфетку. На этом этапе можно использовать хирургические ножницы, чтобы измельчить ткань на кусочки одинакового размера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 5 мл буфера на 0,5 г ткани. Для более крупных тканей образцы можно измельчить в чашке Петри.
  5. Поместите трубку на водяную баню с температурой 37 °C и выдерживайте в течение 35-40 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После успешного переваривания раствор должен стать молочным. Если мелкие кусочки ткани все еще видны, встряхните рукой еще 10-20 с.

3. Выделение преадипоцитов

  1. Для гранулирования преадипоцитарной фракции центрифуга при массе 1,000 х г в течение 5 мин.
  2. Аспирируйте и отбросьте плавающий слой адипоцитов и надосадочную жидкость, оставив примерно 1 мл HBSS, покрывающих клеточную гранулу.
  3. Повторно суспендируйте гранулу в 5 мл HBSS и пропустите клеточную суспензию через сетку размером пор 250 мкм, а затем через ячейку 100 мкм, чтобы удалить любой непереваренный материал. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
  4. Центрифугируйте при давлении 1 000 x g в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага фракцию преадипоцитов можно лечить раствором для лизиса эритроцитов, если загрязнение эритроцитов является проблемой.
  5. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл GM (шаг 1.2) и затравите семена в колбу с адгезивной культурой размером 25см2 . Поместите колбу в инкубатор для клеточных культур (5%CO2, 37 °C).

4. Поддержание преадипоцитарных культур

  1. Заменяйте ГМ каждые 2 дня, пока клетки размножаются
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость пролиферации клеток может варьироваться у разных доноров.
    1. Когда клетки достигнут примерно 80% слияния, перенесите их в колбу с адгезивной культурой размером 75 см2 дюйма. Извлеките ГМ и промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS).
    2. Откажитесь от PBS и добавьте 0,5 мл высокоочищенных ферментов диссоциации клеток, чтобы диссоциировать прикрепленные клетки. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут.
    3. Резко постучите по колбе, чтобы освободить клетки, и добавьте 5 мл GM. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл.
  2. Центрифугируйте при давлении 1 000 x g в течение 5 минут.
  3. Отсадите и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл GM и переложите в колбу75 см 2 . Долейте ГМ до конечного объема 12 мл и замените колбу в инкубаторе для клеточных культур (5%CO2, 37 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания ячеек продолжайте менять ГМ каждые 2-3 дня. Когда клетки достигнут 80% слияния, повторите шаги 4.2-4.3 и разделите клетки 1:3 на новые колбы 75 см2 . Это можно повторять в течение нескольких пассажей до тех пор, пока не будет сгенерировано достаточное количество ячеек для экспериментальной установки. Мы не рекомендуем использовать более 10 пассажей, так как пролиферационная и дифференцировочная способность преадипоцитов снижается.

5. Посев преадипоцитов для адипогенной дифференцировки

  1. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и засейте 200 000 клеток в несколько лунок 6-луночного планшета в 2 мл GM. В качестве альтернативы засейте 3,5 миллиона клеток на 175 см2 колбы в 22 мл GM среды.
  2. Дайте клеткам размножаться в течение следующих 2-4 дней, пока они не достигнут полного слияния, меняя ГМ на второй день культивирования.
  3. Чтобы начать адипогенную дифференцировку, удалите ГМ и замените его полным ДМ на 4 дня (2 мл полного ДМ на лунку 6-луночного планшета или 22 мл на колбу 175 см2 ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замените на свежий полный DM на день 2.
  4. На 4-й день полностью удалите ДМ и замените его 2 мл основного СВ, дополненного 22,5 мкМ олеатом, 15 мкМ пальмитатом и 12,5 мкМ линолеатом, чтобы получить общую концентрацию жирных кислот 50 мкМ на лунку 6-луночного планшета или 22 мл на колбу 175 см2 колбы. Заменяйте на носитель каждые 2 дня в течение следующих 10 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с 7-го дня, липидные капли должны быть видны в дифференцирующих преадипоцитах.
  5. На 14-й день культивирования соберите среду из клеток для выделения ВВ, полученных из адипоцитов.

6. Получение надосадочной жидкости для выделения или хранения внеклеточных везикул и последующей изоляции внеклеточных везикул

  1. Удалите надосадочную жидкость для клеточных культур с каждого 6-луночного планшета и объедините. Добавьте в пробирку объемом 15 мл или удалите все надосадочные жидкости для клеточных культур из колбы 175 см2 и добавьте в пробирку объемом 50 мл.
  2. Центрифуга при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  3. Сцедите надосадочную жидкость в новую чистую пробирку объемом 15 мл или 50 мл путем заливки соответственно.
  4. Снимите цилиндр шприца объемом 10 мл и прикрепите к нему шприцевой фильтр 0,45 мкм.
  5. Влейте надосадочную жидкость в резервуар шприца и слегка надавите большим пальцем или ладонью на отверстие цилиндра шприца до тех пор, пока надосадочная жидкость клеточной культуры свободно пройдет через фильтр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость этого этапа фильтрации может варьироваться в зависимости от типа шприцевого фильтра.
  6. Соберите фильтрат в чистую пробирку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости кондиционированный отфильтрованный фильтрующий материал может храниться на этом месте при температуре -80 °C в течение нескольких недель. При необходимости надосадочную жидкость клеточных культур размораживают при 4 °C и центрифугируют при 1000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Сцедите надосадочную жидкость в чистую пробирку, вылив ее, прежде чем продолжить изоляцию EV.

7. Выделение внеклеточных везикул

  1. Нанесите маркировку на ультрацентрифугирующую пробирку объемом 13 мл, нарисовав круг на дне пробирки, где будет формироваться ожидаемая гранула EV, и наметьте линию вокруг горловины пробирки для ориентации в роторе ультрацентрифугирующей трубки. Пометьте пробирку идентификатором образца.
  2. Поместите пробирку в держатель пробирки.
  3. Прикрепите иглу 16 г к шприцу объемом 10 мл и снимите цилиндр шприца.
  4. Снимите защитный чехол с иглы и вставьте иглу в горлышко ультрацентрифугирующей пробирки.
  5. Налейте надосадочную жидкость клеточной культуры непосредственно в цилиндр шприца, чтобы заполнить ультрацентрифужную пробирку.
  6. Доливайте в трубку PBS по мере необходимости до полного заполнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости дайте трубке немного переполниться, убедившись, что в ультрацентрифужной трубке нет воздушных пространств и пузырьков воздуха.
  7. Запечатайте ультрацентрифужную трубку с помощью паяльника, обеспечив герметичность трубки, слегка сжав ее.
  8. Поместите пробирки для ультрацентрифугирования в ротор ультрацентрифуги; Убедитесь, что линия, отмеченная в верхней части трубки, и круг, нарисованный у основания трубки, обращены наружу, где будет формироваться гранула EV.
  9. Ультрацентрифуга при 120 000 x g в течение 2 ч при 4 °C.
  10. Осторожно снимите ротор с ультрацентрифуги.
  11. Снимите ультрацентрифугирующие пробирки с ротора и поместите в держатель пробирки.
  12. Прикрепите иглу 16 г к шприцу объемом 10 мл.
  13. Проткните верхнюю часть ультрацентрифугирующей пробирки и введите иглу на 2 см в верхнюю часть пробирки и отасуньте надосадочную жидкость в шприц.
  14. Сцедите эту обедненную EV надосадочную жидкость в пробирку объемом 1,5 мл и заморозьте при -80 °C.
  15. Снова вставьте иглу в трубку и осторожно аспирируйте оставшуюся надосадочную жидкость и выбросьте.
  16. Отрежьте верхнюю часть трубки ножницами.
  17. Слейте остатки надосадочной жидкости одним быстрым действием.
  18. Дайте трубке повиснуть вниз головой в течение 1 минуты.
  19. Промокните насухо любую жидкость, которая образуется на трубке, бумажным полотенцем.
  20. Переверните трубку и поместите в держатель трубки.
  21. Добавьте в пробирку 100 мкл PBS.
  22. С помощью кончика пипетки аккуратно вытесните гранулу EV у основания трубки круговыми движениями в области, отмеченной в шаге 7.1.
  23. Вихрь кратковременно (1-2 секунды), дважды.
  24. Пометьте новую ультрацентрифугирующую пробирку объемом 13 мл, нарисовав круг на дне пробирки, где будет формироваться ожидаемая гранула EV, и наметьте линию вокруг горловины пробирки для ориентации в роторе ультрацентрифугирующей трубки. Пометьте пробирку идентификатором образца.
  25. Поместите трубку в держатель трубки.
  26. Добавьте 12 мл PBS в новую ультрацентрифужную пробирку с помощью чистого шприца и иглы.
  27. С помощью шприца и иглы соберите образец EV объемом 100 мкл и добавьте в пробирку. Тщательно смешайте EV и PBS и промойте шприц и иглу, осторожно набирая PBS и отсасывая его в трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырей.
  28. Запечатайте ультрацентрифужную трубку с помощью паяльника, обеспечив герметичность трубки, слегка сжав ее.
  29. Поместите пробирки для ультрацентрифугирования в ротор ультрацентрифуги; Убедитесь, что линия, отмеченная в верхней части трубки, и круг, нарисованный у основания трубки, обращены наружу.
  30. Ультрацентрифуга при 120 000 x g в течение 1 ч при 4 °C.
  31. Осторожно снимите ротор с ультрацентрифуги.
  32. Прикрепите иглу 16 г к шприцу объемом 12 мл.
  33. Проткните верхнюю часть ультрацентрифугирующей пробирки и введите иглу на глубину до 2 см в верхнюю часть пробирки; Аспирируйте надосадочную жидкость в шприц и выбросьте.
  34. Отрежьте верхнюю часть трубки ножницами.
  35. Слейте остатки надосадочной жидкости одним быстрым действием.
  36. Дайте трубке повиснуть вниз головой в течение 1 минуты.
  37. Промокните насухо любую жидкость, которая образуется на краю трубки.
  38. Поместите трубку в держатель трубки.
  39. Добавьте в пробирку 100 мкл PBS.
  40. С помощью кончика пипетки аккуратно вытесните гранулу EV у основания пробирки круговыми движениями в области, указанной на шаге 7.24.
  41. Вихрь кратковременно (1-2 секунды), дважды.
  42. Нанесите пипеткой 100 μл раствора PBS/EV в чистую пробирку объемом 1,5 мл и держите на влажном льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: EV готовы к последующей переработке и могут быть заморожены и храниться при температуре -80 °C.

8. Определение размера и концентрации EV с помощью анализа слежения за наночастицами (NTA)

  1. Подготовка системы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный метод использования анализа отслеживания наночастиц (NTA) для определения размера и концентрации EV был представлен Mehdiani et al.13.
    1. Разморозьте образцы и держите их при температуре 4 °C.
    2. Запустите программное обеспечение NTA, нажав на значок программного обеспечения.
    3. Программное обеспечение откроется в режиме «проверка ячейки» и предложит заполнить ячейку потока деионизированной водой. Наполните шприц объемом 10 мл деионизированной водой и вставьте в машину, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали в загрузочную камеру.
    4. Следуйте инструкциям на экране, чтобы подготовить систему к проверке качества (QC). Программное обеспечение выполнит проверку ячеек и выдаст меру качества клеток. Это должно быть от очень хорошего до отличного.
    5. Подготовьте контроль качества, состоящий из 100 нанометровых гранул полистирола. Пипетка 1 мкл стандарта в 999 мкл деионизированной воды (разбавленного запаса). Затем добавьте 10 μL разбавленного материала в 2,5 мл деионизированной воды (образец QC). Перемешайте раствор путем осторожного вортексирования в течение 2-3 с и пипетирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы для контроля качества должны быть приготовлены свежим каждый день, но исходный разбавленный исходный образец стабилен в течение 1 недели при температуре 4 °C.
    6. Наполните шприц объемом 1 мл 1 мл образца для контроля качества и удалите все пузырьки воздуха из шприца.
    7. Впрыскивайте, не вводя пузырьков воздуха, в камеру загрузки проб NTA, осторожно наклоняя кончик шприца в камеру впрыска, одновременно нажимая на поршень. Введите в камеру до 950 μл образца для контроля качества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не вводите пузырьки воздуха в камеру загрузки проб.
    8. Подождите, пока программное обеспечение выполнит автоюстировку (для фокусировки камеры) и проверит напряжение на показания Z-потенциала - график напряжения должен представлять собой плавную U-образную кривую.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если появляется сообщение об ошибке "Ошибка слишком низкого напряжения", возможно, элемент намокший от очистки или ненадежный, или на нем может быть пузырь воздуха.
    9. После завершения автоматической юстировки/проверки напряжения используйте выпадающее меню положения камеры, чтобы проверить все положения (0,1-0,9) на наличие необычных отметок - их наличие указывает на то, что элемент может нуждаться в промывке и/или очистке. После контроля качества система отобразит сообщение «Готово к измерениям».
    10. Загрунтуйте проточную ячейку с помощью PBS. Откройте вкладку Насос/Температура и в разделе Насос нажмите Запустить для насоса 2 (резервуар PBS). При этом PBS будет проходить через ячейку в течение 1 минуты, а затем автоматически остановится.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В камере могут быть частицы, но их можно очистить, протолкнув 10 мл PBS через загрузочное отверстие.
    11. Наполните шприц объемом 10 мл PBS и загрузите в камеру без пузырьков воздуха.
    12. Создайте протокол для работы устройства, который будет измерять несколько положений лазера и усреднять количество частиц в кадре.
    13. Перед тем, как продолжить, убедитесь, что количество частиц меньше 5 (как можно ближе к 0) - при необходимости промойте с большим количеством PBS.
    14. Перед разведением смешайте образец EV с помощью пипетирования.
    15. Разведите образец в соотношении 1:1000 в PBS и перемешайте с помощью пипетирования. Наполните образец в шприц объемом 1 мл и загрузите в камеру без пузырьков воздуха.
    16. Убедитесь, что количество частиц находится в допустимом диапазоне (полоса над значением количества должна находиться в зеленой области или близко к ней). Если нет, отрегулируйте разведение образца соответствующим образом. Между взятием и разведением образца загрузите 10 мл PBS в переднюю часть машины, чтобы очистить камеру, затем загрузите 1 мл разбавленного образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый образец будет иметь независимое разведение в зависимости от концентрации образца. Для точных измерений количество частиц в устройстве должно составлять от 50 до 200 частиц на кадр.
    17. Перейдите на вкладку «Измерение » в программном обеспечении.
    18. Нажмите на кнопку «Запустить захват видео ».
    19. Введите имя образца и выберите папку назначения, чтобы сохранить измерение.
  2. Создайте стандартную операционную процедуру (СОП) для электромобиля.
    1. Создание > Сохранение > загрузка EV SOP, которая будет измерять количество и размер частиц при выдержке 100 и чувствительности камеры 80, 11 положений камеры в течение 2 циклов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец не имеет особых требований, нет необходимости изменять эти настройки.
    2. Введите разбавление образца и добавьте любые другие примечания, которые вы хотите добавить.
    3. Нажмите OK, и программа автоматически начнет запись. После завершения программы программа автоматически загрузит всплывающую таблицу, показывающую среднее количество и размеры частиц для каждого положения камеры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к машине или ближайшим столешницам в течение этого времени, так как вибрация повлияет на окончательные показания.
    4. Положения камер со статистически необычными показаниями будут автоматически исключены — чтобы вручную исключить любые положения камер (или повторно включить исключенные по любой причине), установите флажок слева от сведений об образце.
    5. Нажмите «Продолжить», и программное обеспечение создаст и откроет PDF-файл образца с размером и результатами концентрации.
  3. Статистический анализ
    1. Анализ данных NTA с помощью одностороннего или двустороннего ANOVA с апостериорной коррекцией Тьюки. График данных в виде группы означает ± стандартное отклонение. Значение P в размере <0,05 было признано значимым.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы определили количество ВВ, выделенных из ягодичных адипоцитов человека, в соответствии с описанным протоколом. Мы рассчитали размер и концентрацию ВВ, полученных из адипоцитов, с использованием NTA (рис. 1A, B). Мы использовали контроль с использованием фиктивных сред, которые представляли собой равные объемы сред, которые не контактировали с клетками, но культивировались и подвергались описанной выше процедуре изоляции. Мы измерили концентрацию ВВ, полученную из адипоцитов, после первоначального выделения и после промывки выделенных ВВ адипоцитов в PBS (рис. 1A, B) и построили график средних значений группы ± стандартным отклонением (SD), которое было проанализировано с помощью двустороннего ANOVA с апостериорной коррекцией Тьюки.

Концентрация ВВ, полученных из адипоцитов, определенная с помощью NTA из1-го выделения, варьировала от 6,10 x 106 до 2,70 x 107 с медианой 2,60 x 107 EVs/мл (рис. 1 A, B). После промывки PBS было выявлено значительно меньшее количество ВВ, полученных из адипоцитов на образец (рис. 1A, B) (P < 0,001), которое варьировало от 5,00 x 105 до 4,30 x 106 с медианой 2,70 x 106 EVs/мл. Элементы управления фиктивной средой не содержали EV, как определено NTA (рис. 1A, B). Модальный размер EV из первой изоляции составил 125 нм и 105 нм после промывки PBS (рис. 1A, B). Описанный протокол в дальнейшем применяли к абдоминальным и ягодичным адипоцитам из более крупных колб T175 см2 . Эти образцы ягодичных EV, полученные из колб T175 cm2 , варьировались по концентрации от 3,60 x 107 до 7,50 x 107/мл со средним значением 5,40 x 107 EVs/мл. Концентрация ВВ, полученных из абдоминальных адипоцитов из колб T175 cm2 , варьировалась в концентрации от 6,30 x 107 до 8,60 x 107/мл с медианой 7,60 x 107 EVs/мл (рис. 1C, D). Модальный размер ВВ, полученных из колб T175 cm2 , составлял 115 нм для ягодичных ВВ и 125 нм для абдоминальных ВВ. Мы подтвердили присутствие белка EV в ВВ ягодичного и абдоминального происхождения с помощью иммуноблоттинга на ген восприимчивости к опухоли 101 (TSG101) и обнаружили, что гранулы клеток абдоминальных и ягодичных адипоцитов, а также ВВ, полученные из абдоминальных и ягодичных адипоцитов, были положительными на TSG101, в то время как в качестве фиктивной контрольной среды, которая не контактировала с клетками, была отрицательной (рис. 1E).

figure-results-1
Рисунок 1: Размер и профиль распределения ВВ, полученных из адипоцитов, из сред клеточных культур и определение EV-белка TSG101. Общие концентрации EV и профили распределения по размеру и концентрации, определенные с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA) от1-го выделения (N = 5) и после промывки PBS (N = 6). (C) Общие концентрации и (D) профили распределения размеров и концентраций, определенные NTA для ВВ абдоминального и ягодичного происхождения из колб T175cm2 (N = 4 на группу). (E) Вестерн-блоттинг ягодичных и абдоминальных ВВ для TSG101. Клеточные гранулы и фиктивные среды использовались в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Данные являются групповыми средними ± стандартным отклонением (SD). Односторонняя или двусторонняя ANOVA с апостериорной коррекцией по Тьюки. Р < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем протокол выделения ВВ, полученных из ягодичных и абдоминальных адипоцитов, из надосадочной жидкости клеточных культур и определяем их размер и концентрацию с помощью NTA 7,14,15. Мы показываем, что культивируемые адипоциты человека продуцируют и выделяют ВВ в среду для культивирования клеток, которые впоследствии могут быть выделены с помощью фильтрации и ультрацентрифугирования. Мы определили размер и профиль концентрации выделенных ВВ, полученных из адипоцитов, и показали, что ультрацентрифугирование, вероятно, соизолировало загрязняющие вещества из среды для культивирования клеток и что промывка изолированных гранул ВВ в PBS значительно снижает их концентрацию при повторном измерении NTA. Кроме того, мы определили чистоту изолированных ягодичных и абдоминальных ВВ с помощью вестерн-блоттинга для TSG101, маркера ВВ. Препараты ВВ ягодичного и абдоминального происхождения были положительными на TSG101, но, что важно, он отсутствовал в контрольных средах, которые не подвергались воздействию клеток. В представленных экспериментах в качестве родительской клетки, генерирующей ВВ, использовались адипоциты человека, но описанный метод подходит для других типов клеток, включая эндотелиальные клетки, гладкие мышцы сосудов, скелетные мышцы, иммунные клетки, а также для выделения ВВ из бедной тромбоцитами плазмы или сыворотки крови пациента.

Полученные из адипоцитов ВВ повышены при метаболических заболеваниях, и определение изменений в размере и количестве ВВ адипоцитов in vivo является сложной задачей, поскольку биологические жидкости, такие как кровь, содержат ВВ из ряда клеточных источников, которые также участвуют в патогенезе метаболических заболеваний, включая ВВ из эндотелиальных клеток, скелетных мышц, эритроцитов и иммунных клеток. Описанный здесь метод позволяет определить ВВ адипоцитов человека, что может обеспечить полезную модель для механистических исследований, изучающих факторы, которые приводят к биогенезу ВВ в адипоцитах, который в настоящее время неизвестен. Важно отметить, что определение биогенеза ЭВ адипоцитов и того, как происходит загрузка определенных РНК, белков и метаболитов в ВВ адипоцитов, может выявить новые терапевтические возможности для нарушения передачи сигналов ЭВ патогенных адипоцитов при метаболической дисфункции. Детальные исследования позволят лучше понять, как размер, количество, путь биогенеза и EV-груз (РНК, белки и метаболиты) изменяются в ответ на болезнь или стимулы, такие как нарушения кислорода, глюкозы, липидов и инсулина. Информация о роли факторов окружающей среды в передаче сигналов ВВ адипоцитов при метаболических заболеваниях и о том, как ВВ, полученные из адипоцитов, способствуют воспалению жировой ткани, может выявить новые терапевтические мишени при метаболических заболеваниях.

Ограничения
Генерация ВВ, полученных из адипоцитов, in vitro
Использование человеческих преадипоцитов in vitro обеспечивает модельную систему для изучения высвобождения и генерации ВВ, полученных из адипоцитов, после дифференцировки адипоцитов in vitro, но существует ряд ограничений. В частности, ВВ адипоцитов, полученные in vitro, вероятно, будут отличаться от ВВ, полученных из жировой ткани, полученных из биожидкостей, таких как плазма14 , по размеру, концентрации, белку EV, -РНК, -метаболитам и функции. Эти различия в EV могут быть подвержены влиянию других неадипоцитарных клеток, которые являются резидентами в жировой ткани in vivo, таких как стволовые клетки, полученные из жировой ткани, эндотелиальные клетки и макрофаги, которые тесно связаны с физиологией жировой ткани и показали свою роль в патологии жировой ткани, включая воспаление жировой ткани.

Следует отметить, что описанный здесь протокол дифференцировки in vitro за 2 недели может быть недостаточным для получения полностью зрелых адипоцитов, эквивалентных тем, которые наблюдаются in vivo; Дифференцированные адипоциты in vitro, выращенные в двумерном (2D) формате, имеют морфологию, отличную от той, что клетки in vivo, и не развивают однокамерные липидные капли. Кроме того, преадипоциты, описанные в этом протоколе, получены из жировой стромально-васкулярной фракции, и мы не оценивали вклад в пул ВВ других типов клеток, которые не были полностью элиминированы во время выделения клеток.

Потеря важных межклеточных взаимодействий адипоцитов с другими неадипоцитами в жировой ткани может влиять на генерацию EV адипоцитов, высвобождение EV-белка и EV-РНК из адипоцитов и стволовых клеток, полученных из жировой ткани16. Тем не менее, исчерпывающая оценка того, как ВВ адипоцитов, полученных in vitro, отличается от полученных in vivo, не проводилась.

Первичные биопсии тканей содержат кровь, поэтому полученные клеточные культуры могут содержать эритроциты и полученные из эритроцитов ВВ, независимо от многократных промывок и изменений среды, выделенных в нашем протоколе. Для устранения влияния эритроцитов на адипоциты может потребоваться дополнительный этап лизиса эритроцитов после выделения стромально-васкулярной фракции. Это важно, поскольку ВВ, полученные из эритроцитов, могут влиять на клеточную функцию других клеток17, а ВВ, полученные из эритроцитов, повышены в присутствии окислительного стресса18 и у пациентов с метаболическим синдромом19,20. Таким образом, жировая ткань, полученная от пациентов с метаболическими заболеваниями, может содержать повышенные уровни ВВ, полученных из эритроцитов, что может влиять на фенотип адипоцитов in vitro.

Элиминация FBS
В описанном протоколе использовали FBS в питательных средах во время адипогенной дифференцировки, но впоследствии адипоциты подвергались множественным изменениям среды перед окончательным сбором среды для выделения ВВ, полученных из адипоцитов. Таким образом, мы предположили, что общий риск контаминации ВВ, полученных из FBS, в препаратах ВВ был низким, и впоследствии подтвердили, что остаточные ВВ не присутствуют в средах клеточных культур с помощью вестерн-блоттинга для TSG101. Для выделения культивируемых в клетках ВВ из клеточных источников, требующих FBS, необходимо использовать обедненный EV FBS или обедненный бычий EV с помощью ультрацентрифугирования для предотвращения смешивания концентраций EV в адипоцитах и анализ груза EV адипоцитов. Известно, что истощение сыворотки из адипоцитов изменяет их клеточныйответ21 , и поэтому исследование должно гарантировать, что истощение сыворотки или EV-истощение из сыворотки делает их культуры адипоцитов действительно репрезентативными для биологии адипоцитов.

Технические ограничения изоляции электромобилей с помощью фильтрации и ультрацентрифугирования
Мы описываем метод ультрацентрифугирования с использованием одноразовых пластиковых трубок, которые требуют герметизации перед ультрацентрифугированием для изоляции электромобилей. Мы признаем, что эти одноразовые герметичные пробирки могут быть неэкономичным вариантом для многих людей, и предлагаем изучить аналогичные пробирки, которые не требуют герметизации и пригодны для повторного использования. Тем не менее, исследователи должны убедиться в том, что промывка многоразовых трубок является адекватной и не приводит к постепенному накоплению белков, липидов и РНК с течением времени, что может повлиять на последующие исследования грузов, связанных с ВВ, или повлиять на исследования клеточной функции.

Описанный здесь протокол фильтрации и ультрацентрифугирования использовался в течение многих лет, и многочисленные исследования выявили недостатки этого метода, включая неспецифические выделения загрязняющих клеточных компонентов, таких как клеточные митохондрии, присутствие ядерных фрагментов и составляющих клеточной мембраны. Кроме того, описанный здесь метод будет ко-изолировать липопротеины, присутствующие в FBS с обедненным EV. Данный метод может быть доработан путем использования ультрацентрифугирования по плотности и эксклюзионной хроматографии (SEC) для устранения загрязняющих растворимых белков и некоторых липопротеинов. В сочетании с промывкой PBS изолированных электромобилей и SEC можно ограничить, но не полностью устранить соизолированные загрязнители. Таким образом, пользователи должны обеспечить включение соответствующих контрольных материалов, включая фиктивную среду, которая не контактировала с клетками, чтобы учесть растворимые белки и липопротеины в питательных средах, и контрольную жидкость, обедненную ВВ, чтобы продемонстрировать успешное выделение ВВ из кондиционированной среды, которая все еще содержит растворимые белки и липопротеины.

Изоляция электромобилей с помощью фильтрации и ультрацентрифугирования зависит от того, что оператор следит за тем, чтобы на надосадочную жидкость клеточной культуры не оказывалось чрезмерное давление во время ее пропускания через отверстие фильтра или отверстие иглы/шприца. Применение чрезмерной силы на этом этапе описанного протокола может привести к разрыву ВВ, влиянию на конечные концентрации ВВ и образованию свободных РНК, белков и метаболитов, которые когда-то были заключены в ВВ. Мы описали здесь метод, который не требует цилиндра шприца и, следовательно, приложения силы к электромобилям в кондиционированной среде, когда они проходят через фильтр или иглу в их сборные резервуары и ультрацентрифужные трубки. Тем не менее, необходимо соблюдать дополнительную осторожность при повторной суспензии EV в PBS. Необходимо использовать только кратковременный вихрь, так как энергичный вихрь может нарушить мембраны EV.

После ультрацентрифугирования операторы должны быть осторожны с ультрацентрифугирующими трубками, чтобы не повредить гранулу EV. Этого можно достичь, осторожно обращаясь с пробирками и медленно перемещая их между ротором ультрацентрифугирования и штативом для пробирок. Необходимо соблюдать дополнительную осторожность при прокалывании отверстия в верхней части ультрацентрифугирующей трубки для аспирации истощенных EV надосадочных жидкостей. Введение иглы в верхнюю часть трубки и быстрая аспирация надосадочной жидкости создаст вакуум в цилиндре шприца, который может сильно вытолкнуть надосадочную жидкость обратно в ультрацентрифугирующую трубку и нарушить работу гранулы EV. После разрезания ультрацентрифугирующей трубки для слива остатков надосадочной жидкости необходимо соблюдать осторожность, так как гранула EV может стать рыхлой, и при заливке она будет отброшена. В качестве альтернативы можно использовать шприц и иглу для медленного удаления оставшейся надосадочной жидкости без заливки или переворачивания трубки.

Фильтрация и ультрацентрифугирование надосадочной жидкости для изоляции электромобилей является полезным и эффективным методом. Но он подвержен совместной изоляции липопротеинов и растворимых белков. Их можно смягчить, промыв электромобили PBS (как описано), но это не устранит все загрязнения. Растворимые белки могут быть элюированы из фракции EV с использованием SEC, однако этот метод не делает различий между липопротеинами и EV. SEC-элюции, содержащие EV, можно комбинировать с ультрацентрифугированием для гранулирования EV. Фильтрация и дифференциальное ультрацентрифугирование являются предпочтительным методом выделения EV по сравнению с методами осаждения, в которых используется полиэтиленгликоль, поскольку эти методы осаждения совместно изолируют большие количества растворимых белков и липопротеинов в надосадочной жидкости клеточных культур и других биологических жидкостях. Ультрацентрифугирование, вероятно, останется наиболее доступной формой изоляции электромобилей для многих, потому что большинство лабораторий оснащены ультрацентрифугами, что снижает первоначальные затраты на запуск. Но для многих ультрацентрифугирование для выделения электромобилей затруднено объемом ультрацентрифугирующих пробирок и начальным объемом материала. Несколько сотен миллилитров супернатантов культур могут потребоваться для получения достаточного количества EV для последующей протеомики или секвенирования РНК. Тем не менее, вполне вероятно, что методы ультрацентрифугирования для выделения ВВ будут сопровождаться другими методами, такими как SEC и иммуноаффинный захват с использованием тетраспанинов CD9, CD63 и CD81 для улучшения чистоты изолированных ВВ. Другие методы, такие как коммерчески доступные растворы для осаждения и проточная цитометрия, могут быть в некоторой степени полезны в конкретных исследованиях.

Чистота препаратов EV
Мы подтвердили выделение ВВ, полученных из адипоцитов, с помощью вестерн-блоттинга для TSG101, но этот единственный вестерн-блот не соответствует рекомендациям, опубликованным Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV). Дальнейшая характеристика этих ВВ, полученных из адипоцитов, была бы идеальной с использованием тетраспанинов CD9, CD63 и CD81 для идентификации экзосом и маркеров клеточного загрязнения, таких как гистон H3, альбумин и аполипопротеин A1.

Представленный здесь протокол позволяет выделять ВВ из надосадочной жидкости клеточных культур из ряда клеточных источников, включая адипоциты, для определения размера, концентрации, маркеров ВВ методом вестерн-блоттинга, а также для использования в технологиях, основанных на омиксах, таких как протеомика и секвенирование РНК.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Н.А. и Р.К. выражают признательность за поддержку в виде исследовательских грантов от Британского фонда сердца, Центра передового опыта в области исследований, Оксфорд (Н.А. и Р.К.; RE/13/1/30181 и RE/18/3/34214), грант на проект Британского фонда сердца (N.A. and R.C.; PG/18/53/33895), Трехсторонний консорциум по иммунометаболизму, Фонд Novo Nordisk (NNF15CC0018486), Национальный институт исследований в области здравоохранения (NIHR), Оксфордский центр биомедицинских исследований (BRC), Nuffield Benefaction for Medicine и Фонд институциональной стратегической поддержки Wellcome (ISSF). Выраженные мнения принадлежат автору (авторам) и не обязательно совпадают с мнением Национальной службы здравоохранения, NIHR или Департамента здравоохранения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 &микро; m сеткаSefar03-250/50
15 мл Коническая трубкаSarstedt62.554.002
250 &; м сеткаСефар03-100/44 
50 мл Коническая трубкаSarstedt62.547.004
Beckman Coulter, Optima MAX-XP УльтрацентрифугаBeckman Coulter393315
анализа бицинхониновой кислоты (BCA)Thermo Scientific23225
BiotinSigmaB4639
BSA (практически без жирных кислот)SigmaA7030
Коллагеназа HSigma11074032001
ДексаметазонSigmaD2915
Модифицированная Eagle's Medium/Смесь питательных веществ Ham's F12 SigmaD6421
Фетальная бычья сывороткаLabtechFCS-SA
Фактор роста фибробластовBio-Techne233-FB-025
ГлутаминThermoFisher25030024
сбалансированный раствор соли Хэнкса SigmaH9394
Человеческий инсулинThermoFisher12585-014
Иглы для подкожных инъекций, Microlance 16GVWR613-3897
IBMXSigmaI7018
Анализ отслеживания наночастиц, ZetaviewParticle Metrix  БАЗОВЫЙ PMX-120 
Набор NEFARandoxFA115
ПантотенатSigmaP5710
Пенициллин и стрептомицинThermoFisher15140122
фосфатный буферный физиологический растворThermoFisher Scientific10010056
PluriStrainer 200 &; mCambridge Bioscience43-50200-03
Polyallomer Quick-Seal ультрапрозрачный 16 мм & 76 мм тубыBeckman Coulter342413
одноразовые шприцы, 2 штуки, Injekt SoloVWR20-2520
Линолеат натрияSigmaL8134
Олеат натрияSigmaO7501
ПальмитатнатрияSigmaP9767
ПаяльникZacro7.14954E+11
Фильтр для шприца 0.2 & микро; М Sarstedt83.1826.001
Шприцевой фильтр 0.45 & микро М ThermoFisher195-2545
T175 см2 колбы для культуры тканейSarstedt83.3912.002
T25 см2 колбы для культуры тканейSarstedt83.3910.002
T75 см2 колбы для культуры тканейSarstedt83.3911.002
Transferrin SigmaT8158
Трийодо-L-тиронинSigmaT5516
ТроглитазонSigmaT2573
Фермент TrypLE ExpressFisher Scientific 
12604021

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Akbar, N., et al. Endothelium-derived extracellular vesicles promote splenic monocyte mobilization in myocardial infarction. JCI Insight. 2 (17), (2017).
  3. Xiao, Y., et al. Extracellular vesicles in type 2 diabetes mellitus: key roles in pathogenesis, complications, and therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1625677(2019).
  4. Akbar, N., Azzimato, V., Choudhury, R. P., Aouadi, M. Extracellular vesicles in metabolic disease. Diabetologia. 62 (12), 2179-2187 (2019).
  5. Kobayashi, Y., et al. Circulating extracellular vesicles are associated with lipid and insulin metabolism. The American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 315 (4), 574-582 (2018).
  6. Eguchi, A., et al. Circulating adipocyte-derived extracellular vesicles are novel markers of metabolic stress. Journal of Molecular Medicine. 94 (11), Berlin, Germany. 1241-1253 (2016).
  7. Crewe, C., et al. An Endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708 (2018).
  8. Flaherty, S. E., et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  9. Deng, Z. B., et al. Adipose tissue exosome-like vesicles mediate activation of macrophage-induced insulin resistance. Diabetes. 58 (11), 2498-2505 (2009).
  10. Kranendonk, M. E., et al. Human adipocyte extracellular vesicles in reciprocal signaling between adipocytes and macrophages. Obesity. 22 (5), Silver Spring. 1296-1308 (2014).
  11. Song, M., et al. Adipocyte-derived exosomes carrying sonic hedgehog mediate M1 macrophage polarization-induced insulin resistance via Ptch and PI3K pathways. Cellular Physiology and Biochemistry. 48 (4), 1416-1432 (2018).
  12. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
  13. Mehdiani, A., et al. An innovative method for exosome quantification and size measurement. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50974(2015).
  14. Connolly, K. D., et al. Evidence for adipocyte-derived extracellular vesicles in the human circulation. Endocrinology. 159 (9), 3259-3267 (2018).
  15. Camino, T., et al. Vesicles shed by pathological murine adipocytes spread pathology: characterization and functional role of insulin resistant/hypertrophied adiposomes. International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2252(2020).
  16. Zhu, Y., et al. Extracellular vesicles derived from human adipose-derived stem cells promote the exogenous angiogenesis of fat grafts via the let-7/AGO1/VEGF signalling pathway. Scientific Reports. 10 (1), 5313(2020).
  17. Sadallah, S., Eken, C., Schifferli, J. A. Erythrocyte-derived ectosomes have immunosuppressive properties. Journal of Leukocyte Biology. 84 (5), 1316-1325 (2008).
  18. Sudnitsyna, J., et al. Microvesicle formation induced by oxidative stress in human erythrocytes. Antioxidants. 9 (10), Basel. (2020).
  19. Helal, O., et al. Increased levels of microparticles originating from endothelial cells, platelets and erythrocytes in subjects with metabolic syndrome: relationship with oxidative stress. Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases. 21 (9), 665-671 (2011).
  20. Agouni, A., et al. Endothelial dysfunction caused by circulating microparticles from patients with metabolic syndrome. The American Journal of Pathology. 173 (4), 1210-1219 (2008).
  21. Park, J., Park, J., Nahm, S. -S., Choi, I., Kim, J. Identification of anti-adipogenic proteins in adult bovine serum suppressing 3T3-L1 preadipocyte differentiation. BMB Reports. 46 (12), 582-587 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesFiltration UltracentrifugationNanoparticle Tracking AnalysisTSG101 ProteinTransmission Electron MicroscopyProteomics MetabolomicsSmall RNA SequencingFunctional StudiesCell Culture Media
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи