Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Комплементация сплайсинговой активности комплексом Галектин-3 - U1 snRNP на бусинах

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61990

⸱

9 декабря 2020 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описаны экспериментальные процедуры для (а) истощения U1 snRNP из ядерных экстрактов с сопутствующей потерей сплайсинговой активности; и (b) восстановление сплайсинговой активности в U1-обедненном экстракте частицами snRNP галектина-3-U1, связанными с ковалентно связанными с анти-галектин-3 антителами.

Аннотация

Классические эксперименты по истощению-восстановлению показывают, что галектин-3 является обязательным фактором сплайсинга в ядерных экстрактах. Механизм включения галектина-3 в сплайсинговый путь рассматривается в данной работе. Осаждение клеточных ядерных экстрактов HeLa на 12%-32% градиентах глицерина дает фракции, обогащенные эндогенной частицей ~10S, содержащей галектин-3 и U1 snRNP. Теперь мы описываем протокол для истощения ядерных экстрактов U1 snRNP с сопутствующей потерей сплайсинговой активности. Сплайсинговая активность в U1-истощенном экстракте может быть восстановлена частицей snRNP галектина-3 - U1, захваченной на бусинах агарозы, ковалентно связанной с антителами против галектина-3. Результаты показывают, что троичный комплекс галектин-3 - U1 snRNP - пре-мРНК является функциональным комплексом Е, приводящим к промежуточным продуктам и продуктам реакции сплайсинга, и что галектин-3 попадает в путь сплайсинга через его ассоциацию с U1 snRNP. Схема использования комплексов аффинно- или иммуно-, выбранных на шариках, для восстановления сплайсинговой активности в экстрактах, обедненных специфическим фактором сплайсинга, может быть в целом применима к другим системам.

Введение

Производство большинства эукариотических мессенджерных РНК (мРНК) включает удаление интронов и лигирование экзонов в ядерном процессе, называемом сплайсингом премрнК1. Два класса РНК-белковых комплексов (RNP) направляют обработку пре-мессенджерной РНК в зрелую мРНК через сплайсеосомальные комплексы. Один класс, зарождающиеся предмаршированные RNP, образуется котранскрипционно путем связывания гетерогенных ядерных белков RNP и других РНК-связывающих белков, включая некоторых членов семейства SR, давая комплексы hnRNP2. Второй класс, богатый урацилом малые ядерные RNP (U snRNP с U1, U2, U4, U5 и U6 snRNAs) связан с U-специфическими и основными белками3,4. U snRNP взаимодействуют упорядоченным образом с определенными областями предмарш-мессенджерных RNP в динамическом пути ремоделирования, поскольку интроны иссекаются, а экзоны лигируются для получения зрелых mRNPs5. Многие дополнительные ядерные белки участвуют в этих событиях обработки6.

Галектин-1 (Gal1) и галектин-3 (Gal3) являются двумя белками, которые являются необходимыми факторами в пути сплайсинга, как показано исследованиями истощения-восстановления7,8. Удаление обоих галектинов из сращивания компетентных ядерных экстрактов (NE) отменяет сплайсеосомную сборку и сплайсинговую деятельность на ранней стадии. Добавление любого галектина к такому вдвойне истощенному NE восстанавливает обе активности. Gal1 и Gal3 являются компонентами активных сплайсеосом, о чем свидетельствует специфическая иммунопреципитация пре-мРНК, сплайсинговых промежуточных продуктов и зрелой мРНК антисывороткой, специфичной для Gal1 или Gal39. Важно отметить, что Gal3 ассоциируется с эндогенной U snRNA, содержащей частицы в NE вне пути сплайсинга, как показано осаждением snRNP анти-Gal3 antisera10. Наконец, глушение Gal3 в клетках HeLa изменяет паттерны сплайсинга многочисленных генов11.

В NE, предварительно инкубированном для разборки предварительно сформированных сплайсеосом12, snRNP обнаруживаются в нескольких комплексах, осажденных в градиентах глицерина от 7S до более 60S. Хотя фракционирование градиента глицерина является распространенным методом выделения сплайсеосомальных комплексов и компонентов (см., например, ссылки13,14,15), мы расширили этот метод, охарактеризовав специфические фракции с использованием иммунопреципитаций антител. SnRNP осадок при 10S содержит только U1 snRNA вместе с Gal3. Иммунопреципитация фракции 10S с антисыворотки, специфичной для Gal3 или U1 snRNP, осаждает как U1, так и Gal3, указывая на то, что некоторые из моночастиц U1 snRNP связаны с Gal310. Поскольку U1 snRNP является первым комплексом, который связывается с pre-mRNP в сплайсеосомальной сборке1,5, этот шаг представляет собой потенциальный входной участок для Gal3 в путь сплайсинга. На этой основе мы показали, что моночастицы 10S Gal3-U1 snRNP, связанные с бусинами, содержащими анти-Gal3, восстанавливают активность сплайсинга к U1 snRNP истощенной NE, устанавливая этот комплекс как один механизм, с помощью которого Gal3 набирается в сплайсеосомальный путь16. Это контрастирует с попытками выделения сплайсеосом на определенных этапах реакции сплайсинга и каталогизации связанных с ними факторов17,18. В таких исследованиях констатируется наличие определенных факторов в какой-то момент времени, но не механизм, с помощью которого они были загружены.

Ранее мы подробно описали подготовку NE, сплайсинговую подложку, сборку реакционной смеси сплайсинга и анализ продуктов в нашей документации о роли галектинов в сплайсинге премрнК19. Теперь описаны экспериментальные процедуры фракционирования ядерных экстрактов для получения фракции, обогащенной комплексом SnRNP Gal3 - U1, и иммуноотбора последнего комплекса для восстановления сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая дополнение сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1 snRNP комплексом Gal3-U1 snRNP на шариках. (A) NE в буфере C (NE(C)) инкубируют с белком A-Sepharose бусинами, ковалентно связанными с анти-U1 snRNP (бусины αU1). Несвязанная фракция обедняется U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE в буфере D (NE(D)) фракционируют по 12%-32% градиенту глицерина путем ультрацентрифугирования. Фракции, соответствующие области 10S (фракции 3-5), объединяют и смешивают с бусинами, ковалентно связанными с антителами против Gal3 (шарики αGal3). Материал, связанный с шариками, содержит моночастицу Gal3-U1 snRNP. (C) Комплекс SnRNP Gal3-U1 из части (B) смешивают с U1ΔNE из части (A) в сплайсинговом анализе с использованием 32P-меченого субстрата MINX pre-mRNA, а промежуточные продукты и продукты реакции сплайсинга анализируют с помощью гелевого электрофореза и ауторадиографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Примечания по общим процедурам

  1. Убедитесь, что все химические вещества (буферные компоненты, ферменты и т. д.) не содержат рибонуклеазы (РНКазы). Изолируйте все коммерчески приобретенные бутылки с реагентами от общего лабораторного использования. Надевайте перчатки на все этапы экспериментальной процедуры. Используйте только стеклянную посуду и посуду, которые были запечены (см. шаг 1.2 ниже) и растворы, которые были предварительно обработаны (см. шаг 1.3 ниже).
  2. Выпекайте всю стеклянную посуду (стаканы, колбы, бутылки, пипетки и т.д.) не менее 4 ч при 177 °C. Заверните другую посуду (шпатели, перемешиватели и т.д.) в алюминиевую фольгу перед выпечкой в тех же условиях.
  3. Готовят 0,1% (об./об.) раствор диэтилпирокарбоната (DEPC) в двухдистиллированной воде (ddH2O). Используя магнитный перемешиватель, перемешайте этот раствор в течение ночи, а затем автоклав. Используйте этот обработанный DEPC H2O для приготовления всех растворов, содержащих Tris; затем фильтр стерилизуют с помощью вакуумного фильтра для бутылок. Используйте обычный ddH2O для приготовления всех остальных растворов (без Tris); затем обрабатывают DEPC (0,1%, об/об) и автоклавом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы, используемые в следующем наборе экспериментальных процедур, перечислены в алфавитном порядке в таблице 1.
Имя буфераСостав
Боратный буфер0,2 М бората натрия, рН 9
Буфер C20 мМ HEPES, рН 7,9, 25% (об./об.) глицерин, 0,42 М NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 0,5 мМ дитиотрейтол (DTT)
Буфер D10 мМ HEPES, рН 7,9, 20% (об./об.) глицерин, 0,1 М KCl, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ PMSF, 0,5 мМ DTT
60%Д60% буфер D и 40% H2O
Этаноламин0,2 М этаноламина, рН 8
Буфер связывания HEPES20 мМ HEPES, рН 7,9
Буфер для промывки HEPES20 мМ HEPES, рН 7,9, 0,5 М NaCl
Буфер загрузки РНК90% формамид, 20 мМ ЭДТА, рН 8, 0,05% (мас./об.) бромфенола синего
Буфер SDS-PAGE25 мМ Tris, глицин 169 мМ, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), рН 8,8
Буфер образцов SDS62,5 мМ Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол, 0,1% (мас./об.) бромфенол-синий
Буфер TBE для РНК-гелей89 мМ Tris, борная кислота 89 мМ, ЭДТА 2,5 мМ, рН 8,3
Буфер TE10 мМ Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА
Буфер передачи25 мМ Tris, 1,92 М глицина, 20% метанола, рН 8,3
Буфер T-TBS10 мМ Tris, 0,5 М NaCl, 0,05% анимации 20, рН 7,5
TX буфер промывки0,05% Тритон X-100 (TX) в 60% D

Таблица 1: Название и состав буферов

2. Препарат NE истощен U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Препарат шариков против U1 для иммуносансорбции
    1. Предварительно набухайте 50 мг бусин белка A-Sepharose CL-4B в избытке H2O, обработанном DEPC, чтобы произвести приблизительно 200 мкл набухших шариков, а затем промыть в буфере для промывки HEPES.
    2. Для этой промывки и всех последующих промывок гранулируют шарики центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ведра при 4 °C в течение 10-15 с) и удаляют несвязанную промывку с помощью микропипеттера и выбрасывают.
    3. Смешать 150 мкл промытых шариков со 150 мкл аутоиммунной сыворотки человека, специфичной для U1 snRNP (объем антитела к объему шариков в соотношении 1:1).
    4. Отрегулируйте, исходя из общего объема (~300 мкл из шага 2.1.3 выше), смесь до 20 мМ HEPES, рН 7,9, соответствующего условиям буфера связывания HEPES; инкубируют эту смесь с непрерывным раскачиванием при комнатной температуре в течение 60 мин.
    5. Промыть шарики, связанные антителами, 1 мл боратного буфера (0,2 М бората натрия, рН 9) и повторно суспендировать в 1 мл того же боратного буфера.
    6. Чтобы ковалентно соединить антитело, связанное с белком А-сефарозные шарики, добавляют диметилпимелимидат до конечной концентрации 20 мМ и инкубируют при комнатной температуре с раскачиванием в течение 60 мин.
    7. Вымойте шарики 1 мл боратного буфера.
    8. Чтобы заблокировать любой непрореагировавший сшивающий реагент, добавляют 1 мл 0,2 М этаноламина (рН 8) и инкубируют при комнатной температуре с раскачиванием в течение 60 мин.
    9. Промывайте бусины, связанные с антителами, в дальнейшем обозначаемые как бусины против U1, дважды с 0,5 мл буфера промывки TX (0,05% Triton X-100 в 60% D).
  2. Истощение U1 snRNP из NE (см. Рисунок 1A)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура получения NE из клеток HeLa была первоначально разработана Dignam et al.20. Мы описали материалы и подробные методы подготовки NE к анализу сращивания19 (см. шаги 2.1 и 3.1 этой ссылки). NE, как первоначально подготовлено, находится в буфере C и в дальнейшем будет обозначен как NE(C). NE(C), диализованный по отношению к буферу D и уравновешенный буфером D, будет обозначен как NE(D).
    1. Инкубировать 200 мкл NE(C) со 100 мкл шариков против U1 со стадии 2.1.9 выше.
    2. Добавьте в смесь 5 мкл РНАзина.
    3. Поверните микротрубку головой над хвостом при 4 °C в течение 1 ч.
    4. Гранулируйте смесь центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с) и собирайте несвязанный материал (U1ΔNE) с помощью шприца Гамильтона.
    5. Диализуйте весь объем U1ΔNE вместе с отдельной 50-мкл аликвотой исходного неображенного NE(C) в отдельных отсеках микродиализатора, с перемешиванием, в течение 75 мин против 60% D с использованием диализной мембраны с отсечкой молекулярной массы 8 К.
    6. Сразу после диализа разделить эти препараты (U1ΔNE и NE в 60% D) на 20 мкл аликвот; затем заморозить в ванне с сухим льдом/этанолом и хранить при -80 °C.
  3. Анализ содержания РНК и белка в U1ΔNE и материала, связанного на бусинах против U1
    1. После удаления несвязанного материала (U1ΔNE) (этап 2.2.4) промыть материал, связанный с шариками против U1, добавив 0,5 мл буфера промывки TX. Гранулируйте смесь центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с) и удаляйте супернатант с помощью микропипеттера и выбрасывайте.
    2. Повторите шаги стирки 2.3.1 дважды.
    3. Удалите материал, связанный с шариками против U1, добавив 100 мкл 2x буфера образцов SDS к 100 мкл шариков и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре.
    4. Гранулирование смеси центрифугированием (1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °С в течение 10-15 с); удалить супернатант шприцем Гамильтона и заморозить в ванне с сухим льдом / этанолом. Хранить при температуре -80 °C.
    5. Сравните неразрушенный NE, истощенный NE (U1ΔNE) и материал, связанный с шариками (удаленный из бусин буфером образцов SDS, как описано в шагах 2.3.3 и 2.3.4 выше). Выполните шаги 2.3.6-2.3.8 для анализа РНК или шаги 2.3.9-2.3.10 для анализа белка.
    6. Для каждого образца экстрагируют РНК с 200 мкл фенол-хлороформа (50:50, v/v); затем снова экстрагировать 180 мкл хлороформ-изоамилового спирта (25:1, v/v). После экстракции добавляют 300 мкл холодного 200-стойкого этанола, инвертируют для смешивания и хранят осажденную РНК в течение ночи при -20 °C.
    7. Центрифугируют осажденную этанолом РНК (12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C). Промыть гранулы 150 мкл холодного 70% этанола. Центрифуга снова (12 000 х г) при 4 °C в течение 15 мин. Удалите супернатант с помощью микропипеттера и высушите гранулы в вакууме со скоростью в течение 10-15 мин без нагрева.
    8. Повторно суспендируют высушенную РНК-гранулу в 10 мкл РНК-нагрузочного буфера, осторожно вихрь, нагревают до 75-85 °С в течение 90 с, а затем инкубируют на льду в течение 2 мин. Разделяют snRNAs гелевым электрофорезом (2 ч при 16 мА) через 13% полиакриламид - 8,3 М гелей мочевины и затем либо окрашивают бромидом этидия, либо подвергают северному блоттингу10,16.
    9. Загрузите образцы белка в буфере образцов SDS со стадии 2.3.5 на 12,5% полиакриламидные гели и электрофорез при 200 В в течение приблизительно 45-50 мин в буфере SDS-PAGE (электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия).
    10. Перенос отделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану при 400 мА в течение 2 ч в трансферном буфере. После переноса блокируют мембрану путем инкубации на ночь в T-TBS, содержащем 10% обезжиренного сухого молока. Затем иммуноблотируют мембрану, чтобы выявить специфические белки8,21.

3. Иммунопреципитация 10S фракций градиентов глицерина анти-Gal3

  1. Препарат шариков анти-Gal3 для иммуносансорбции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Происхождение и характеристика поликлональной антисыворотки кролика против Gal3 для кролика #2421 и для кролика #4910 были описаны ранее.
    1. Используйте преиммунную сыворотку от кролика No49 в качестве контроля.
    2. Для приготовления бусин анти-Gal3 следуйте процедуре, ранее описанной для приготовления бусин anti-U1 (этап 2.1), за исключением того, что, соответствующее шагу 2.1.3, отношение антисыворотки (например, анти-Gal3, #49) к бусинам составляет 3:1.
    3. Непосредственно перед использованием промывайте бусины, связанные с антителами, в дальнейшем обозначаемые как бусины против Gal3, дважды с 0,5 мл буфера промывки TX. Удалите супернатант, сначала с помощью микропипеттера, чтобы получить большую часть жидкости, а затем с помощью шприца Гамильтона, чтобы получить жидкость из шариков; отбрасывать.
  2. Иммунопреципитатон фракций градиента глицерина анти-Gal3 (см. Рисунок 1B)
    1. Фракционировать NE(D) более 12%-32% градиента глицерина10. Смешайте и смешайте фракции градиента глицерина 3, 4 и 5 (пронумерованные из верхней части градиента), которые находятся вблизи области 10S градиента.
    2. Подготовьте два образца, каждый со 150 мкл аликвотой комбинированных фракций градиента 3-5 (стадия 3.2.1), и поместите в 50 мкл шариков анти-Gal3.
    3. Параллельно готовят два образца по 150 мкл фракции 1 (содержащие Gal3, не в комплексе с U1 snRNP10; стадия 3.2.1) и помещают в 50 мкл бусины против Gal3.
    4. В качестве контроля поместите 150 мкл 60% D в другую микропробирку из 50 мкл анти-Gal3 шариков.
    5. Осторожно перемешайте, постукивая по трубке, затем поверните микротрубку головой над хвостом при 4°C в течение 1 ч.
    6. Гранулирование смеси путем щадящей центрифугации (1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с).
    7. Удалите супернатант (несвязанный материал) с помощью шприца Гамильтона. Не мойте шарики и используйте сразу для добавления реакций сращивания (раздел 4.2).
  3. Анализ содержания РНК и белка в несвязанном и связанном материале из осаждения анти-Gal3 фракций градиента 10S
    1. Для анализа компонентов связанного и несвязанного материала из осаждения анти-Gal3 фракций градиента 10S собирают несвязанный материал (супернатант после стадии 3.2.6), переносят в свежую микропробирку и замораживают при -20 °C.
    2. Промыть осажденные шарики с этапа 3.2.6 (содержащего материал, связанный с анти-Gal3), добавив 0,5 мл буфера промывки TX.
    3. Гранулирование смеси путем щадящего центрифугирования (1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с); удалить супернатант с помощью микропипеттера и выбросить. Повторите шаги стирки еще дважды.
    4. Добавьте 50 мкл буфера образцов 2X SDS в промытые и гранулированные шарики против Gal3.
    5. Аккуратно перемешайте шарики и высиживайте в течение 10 минут при комнатной температуре.
    6. Гранулируйте смесь щадящим центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ведра при 4 °C в течение 10-15 с), соберите супернатант шприцем Гамильтона и храните в свежей микротрубке при -20 °C.
    7. Сравните несвязанный материал (раздел 3.3.1) и связанный материал (этап 3.3.6) осаждения анти-Gal3 в терминах РНК и белковых компонентов, используя процедуры, описанные в шагах 2.3.6. до пункта 2.3.10, соответственно.

4. Сборка реакции сращивания и анализ продуктов

  1. Подготовка сращивающей подложки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Субстрат пре-мРНК, обозначенный MINX, содержит две последовательности экзонов и одну интронную последовательность из Аденовируса22. Последовательность ДНК MINX в плазмиде находится под контролем промоторов РНК-полимеразы T3, T7 или SP6. Материалы и подробные способы линеаризации плазмидной ДНК MINX эндонуклеазой рестрикции BamHI, транскрипции полимеразой РНК SP6 в присутствии α-32P[GTP] и очистки меченой 32P MINX для сплайсинговых анализов описаны ранее19 (см. шаги 2.2 и 3.2 этой ссылки).
    1. Хранить радиомеченный MINX в виде этанолового осадка при -20 °C; использовать меченый сращивающий субстрат в течение 4-6 недель после транскрипции.
    2. Непосредственно перед использованием центрифугируйте осажденный этанолом 32P-меченый MINX при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C; удалить супернатант с помощью микропипеттера и выбросить.
    3. Добавьте 150 мкл 70% этанола и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и высушите гранулы в вакууме без нагрева в течение 15 мин.
    4. Регидратируйте гранулы в 50 мкл воды DEPC. Пятно 2 мкл на каждом из двух фильтров GF/C; погрузить фильтры в холодную 5% трихлоруксусную кислоту (ТЦА) на 10 мин. Промыть холодным 5% TCA, а затем 180-стойким этанолом на вакуумной колбе. Воздух сушит фильтры и подвергает сцинтилляционному подсчету в 4 мл Safety-Solve.
    5. Разбавляйте 32P-меченый MINX в 60% D до 104 cpm/μL для анализа сплайсинга.
  2. Сборка реакции сращивания (см. рисунок 1С)
    1. Собирают на льду реакции сращивания в общем объеме 24 мкл (8 мкл U1ΔNE (со стадии 2.2.6), 3,5 мМ MgCl2, 1,5 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0,5 мМ DTT, 20 единиц РНКазина, 4 мкл 32P-меченого сварочного субстрата MINX (104 cpm/μL), 60% D) и добавляют в каждую трубку шарики из секции 3.2.7. Соберите идентичный набор реакций сплайсинга в общем объеме 24 мкл, но без U1ΔNE, и добавьте в каждую трубку шарики из стадии 3.2.7.
    2. Готовят контрольную реакцию сплайсинга в общем объеме 12 мкл (4 мкл NE(D), 3,5 мМ MgCl2, 1,5 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0,5 мМ DTT, 20 единиц РНКазина, 2 мкл 32P-меченого сращивающего субстрата MINX (104 ч/мкл), 60% D).
    3. Осторожно перемешайте трубки, постукивая и поворачивая торец над хвостом при 30°C в течение 90 минут. Гранулируйте смесь щадящей центрифугированием при 1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °С в течение 10-15 с.
    4. Остановите реакцию и элюируйте белки из шариков, добавив 24 мкл 2x буфера образцов SDS к пробиркам, содержащим шарики, и 12 мкл 2x буфера образцов SDS в контрольную трубку, содержащую NE, но без шариков. Нагревайте трубки при 100 °C в течение 7 мин.
    5. Осторожно центрифугируйте трубы при 1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с.
    6. Перенос супернатантов (элюций) в свежие микротрубки: приблизительно 48 мкл из шариковых пробирок и 24 мкл из контрольной трубки NE.
    7. Добавьте протеиназу K (20 мг/мл) для переваривания и солюбилизации белков: добавьте 5 мкл к элюированию 48 мкл из шариков и добавьте 2,5 мкл к контроле NE 24 мкл.
    8. Инкубировать пробирки при 37°C в течение 40 мин.
    9. Осторожно центрифугируйте трубы при 1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10 с.
    10. Разбавить шариковые элюи с 39,5 мкл TE и 10 мкл 3 М ацетата натрия. Разбавить контроль NE 63,5 мкл TE и 10 мкл 3 М ацетата натрия.
    11. Извлеките и проанализируйте РНК, как описано ниже (раздел 4.3).
  3. Анализ продуктов реакции сращивания
    1. Экстрагировать РНК в каждом образце фенол-хлороформом, а затем хлороформом-изоамильным спиртом; осаждение РНК этанолом, центрифуга, промывка гранул, удаление супернатанта и сушка гранул в соответствии с той же процедурой, которая описана на этапах 2.3.6 и 2.3.7.
    2. Повторно суспендируют высушенную РНК-гранулу в 10 мкл РНК-нагрузочного буфера, осторожно вихрь, нагревают до 75-85 °С в течение 90 с, а затем инкубируют на льду в течение 2 мин.
    3. Готовят 20 мл раствора, содержащего 13% полиакриламид (бисакриламид:акриламид, 1,9:50 [мас./мас.]) в 8,3 М мочевины; литые гели длиной 15 см с использованием этого раствора.
    4. После того, как гель отлит, электрофоризируйте его (без загрузки образцов) при 400 В в течение 20 мин, используя TBE в качестве рабочего буфера. После этого шага промывайте скважины с помощью рабочего буфера TBE.
    5. Загрузите образцы РНК в буфер загрузки РНК и электрофорез с работающим буфером TBE при 400 В в течение 3,5-4 ч. После электрофореза удаляют мочевину, погружая и вращая гель в дистиллированную воду в течение 10 мин.
    6. Вакуумная сушка геля на фильтровальной бумаге 3 M, сначала в течение 2 ч 15 мин при 80 °C, а затем в течение 30 мин без нагрева, чтобы медленно охладить его. Подвергнуте высушенный гель ауторадиографии на пленке для выявления положений миграции радиоактивных компонентов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

NE, обедненные комплексами U1 snRNP (U1ΔNE из раздела 2.2.6) и Gal3 - U1 snRNP из области 10S градиента глицерина, иммунопреципитированного анти-Gal3 (стадия 3.2.7), смешивали в реакции сплайсинга. Эта реакционная смесь содержала u1 snRNA (рисунок 2A, полоса 3), а также U1-специфический белок U1-70K (рисунок 2B, полоса 3). Как и ожидалось, анти-Gal3 выпал в осадок Gal3 (рисунок 2B, полоса 3). Эти ком...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом отчете представлены экспериментальные детали, которые документируют комплекс Gal3 - U1 snRNP, захваченный на бусинах, покрытых анти-Gal3, может связываться с субстратом пре-мРНК, и этот троичный комплекс может восстанавливать активность сплайсинга к обедненному U1 snRNP NE. Gal3 является одним из членов семейства белков, первоначально выделенных на основе его галактозно-специфической углеводсвязывающей активности23 . Ранние исследования иммунофлуоресценции и субклеточного фракционирования д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда MCB-0092919 и грантом Мичиганского государственного университета 09-CDFP-2001 (для RJP) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM-38740 и Мичиганским agBioResearch Project MICL02455 (для JLW).

Субстрат MINX пре-мРНК, используемый в анализах сплайсинга, был добрым подарком от доктора Сьюзан Бергет (Медицинский колледж Бейлора, Хьюстон, Техас, США).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
anti-U1 snRNPСайт связыванияHu ENA-RNP #33471человеческая аутоиммунная сыворотка, специфичная для U1 snRNP
бутылочный вакуумный фильтрFisher ScientificCorning 431153 (0,22 μ m; PES 150 мл)для фильтрации растворов, содержащих трис
центрифугуInternational Equipment CompanyIEC Model PR-6для гранулирования сефарозы в иммунопреципитации
диэтилпирокарбоната (DEPC)Sigma-Aldrich159220-5Gдля очистки воды, используемой при приготовлении всех растворов
диметилпимелимидата (DMP)Sigma-Aldrich80490-5Gдля сшивки антител к сефарозным гранулам
электрофорез ячейкиBioRad Laboratories, IncMini-Protean IIдля SDS-PAGE разделения белков
этаноламинSigma-Aldrich411000-100млдля блокирования после сшивки реакции
гель электрофорезсистема Hoefer, IncHSI SE 500 Seriesдля разделения нРНК гелевым электрофорезом
гелевой пластиной сушилкаBioRadModel 224для сушки гелевых пластин для авторадиографии
мембраны Hybond ECL GEHealthcareRPN3032D (0,2 μ m; 30 см х 3 м)для иммуноблоттинга белков на мембранном
микродиализаторе (12 х 100; PierceMicrodialyzer System 100для замены буфера ядерного экстракта   
мембраны для микродиализеров (отсечка 8К)Pierce66310для замены буфера ядерного экстракта 
обезжиренное сухое молокоSpartan StoresSpartan Instant обезжиренное сухое молочное
белок A Sepharose CL-4BMillipore-SigmaGE 17-0780-01для связывания антител с гранулами
Proteinase KMillipore-SigmaP2308-5mgдля остановки реакции сплайсинга для выделения РНК
РНКазинPromegaN2111для ингибирования активности
рибонуклеазыРокер/ротаторLab Industries, Inc Labquake Shaker 400-110для смешивания белковых растворов в реакциях сопряжения и в иммунопреципитации
Safety-SolveResearch Products International Corp.No 111177сцинтилляционный счетный коктейль для определения радиоактивности в
сцинтилляционном счетчике сращиванияBeckman InstrumentsLS6000SCсцинтилляционный счетчик для определения радиоактивности 
скоростной вакуумный концентраторSavantSVC 100Hдля сушки гранул РНК, осажденных этанолом
Установка для электрофорезаHoefer, IncHoefer серии TE Transphorдля переноса белка с SDS-PAGE на блоттинговую мембрану
субстрата

Ссылки

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932(1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Реконституция активности сплайсингаистощение U1 snRNPфракционирование в глицериновом градиентебусины с антителами к галектину-3диализ ядерного экстрактапротокол реакции сплайсингаанализ РНК-субстратаобработка протеиназой Kбуфер для образцов с SDS
Комплементация сплайсинговой активности комплексом Галектин-3 - U1 snRNP на бусинах
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.