Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямое перепрограммирование фибробластов человека в миобласты для исследования терапии нервно-мышечных расстройств

6.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61991

⸱

3 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает преобразование фибробластов кожи в миобласты и их дифференциацию в миотрубы. Клеточные линии получены от пациентов с нервно-мышечными расстройствами и могут быть использованы для исследования патологических механизмов и для проверки терапевтических стратегий.

Аннотация

Исследования как патофизиологии, так и терапевтических целей в мышечной дистрофии были затруднены ограниченной пролиферативной способностью миобластов человека. Несколько моделей мыши были созданы, но они либо действительно не представляют человека физиопатологии болезни или не являются репрезентативными широкого спектра мутаций, найденных в организме человека. Увековечение первичных миобластов человека является альтернативой этому ограничению; однако, он по-прежнему зависит от биопсии мышц, которые являются инвазивными и не легко доступны. В отличие от этого, биопсия кожи легче получить и менее инвазивными для пациентов. Фибробласты, полученные из биопсии кожи, могут быть увековечены и трансдифференцированы в миобласты, обеспечивая источник клеток с отличным миогенным потенциалом. Здесь мы описываем быстрый и прямой метод перепрограммирования фибробласта в миогенную линию. Фибробласты трансдуцируются двумя лентивирусами: hTERT, чтобы увековечить первичную культуру и тет-индуцируемых MYOD, который при добавлении доксициклина, вызывает преобразование фибробластов в миобласты, а затем зрелые миотрубы, которые выражают конце дифференциации маркеров. Этот быстрый протокол трансдифференцирования представляет собой мощный инструмент для исследования патологических механизмов и исследования инновационных генных или фармакологических биотерапии нервно-мышечных расстройств.

Введение

Клеточные модели, полученные непосредственно из тканей человека, полезны для моделирования многих генетических нарушений человека, с преимуществом наличия оригинального геномного контекста и, во многих случаях, воспроизведения тех же молекулярных и клеточных признаков, наблюдаемых у пациентов. В области нервно-мышечных расстройств, биопсия мышц были отличным источником миобластов человека и помогли в выяснении патологических механизмов. Кроме того, они являются важным инструментом для in vivo тестирования препаратов и генной терапии. С одной стороны, вывод миобластов из фрагментов мышц относительно прост. С другой стороны, культура и поддержание первичных миобластов являются сложными, из-за их ограниченной скорости распространения и репликации сенесценции в пробирке1. Альтернативой этим ограничениям является увековечение миобластов с вставкой человеческой теломеразы(HTERT)и/или циклин-зависимой киназы 4 (CDK4)генов 2,3, с сохранением скелетных мышечных особенностей4. Тем не менее, убаюка первичных миобластов по-прежнему зависит от биопсии мышц, хирургической процедуры с недостатками для пациентов, которые, во многих случаях, имеют свои мышцы в продвинутой дегенерации. Таким образом, мышцы этих пациентов состоят из значительной доли фиброзной и/или жировой ткани и дают меньше мышечных клеток, требующих очищения клеток ранее к увековечению.

В отличие от биопсии мышц, биопсия кожи более доступна и менее вредна для пациентов. Первичные фибробласты могут быть получены из фрагментов кожи в пробирке. Хотя фибробласты в первую очередь не страдают от мутаций, вызывающих нервно-мышечные расстройства, они могут быть трансдифференцированы в миобласты. Это может быть достигнуто путем вставки гена Myod, миогенного регулятивного транскрипции фактора5. В этой рукописи мы описываем протокол для получения трансдифференцированных миобластов, от создания фибробластов культур до одержимости дифференцированных миотрубов (репрезентативное резюме метода изображено на рисунке 1).

Доклиническое тестирование терапевтических стратегий зависит от клеточных и животных моделей, несущих мутации, аналогичные мутациям, обнаруженным у пациентов. Хотя разработка моделей животных стала более осуществимой с развитием технологий редактирования генов, таких как CRISPR/Cas96,она по-прежнему является сложной и дорогостоящей. Таким образом, клеточные линии, полученные пациентом, являются доступным вариантом для моделей, охватывающих большой спектр мутаций таких заболеваний, как мышечная дистрофия Дюшенна (DMD). Использование и создание клеточных моделей имеют решающее значение для разработки персонализированной терапии таких патологий.

Среди персонализированных методов лечения, которые были исследованы, exon пропуская стратегии является одним из перспективных для различных мышечныхдистрофий 7,8. Эта стратегия состоит из производства более короткого, но функционального белка. Это выполняется путем сокрытия определения exon к сплайсоме, поэтому исключает мутировавшего экзона из конечного посланника. Это очень перспективная технология, которая была одобрена FDA для DMD. Таким образом, мы также описываем в этом протоколе, методы трансфект миобластов с двумя различными эксон пропуска соответствующих технологий: антисенс олигонуклеотиды (AON) и U7snRNA-адено-ассоциированных вирусов (AAV). AON transfection является хорошим инструментом для первоначального скрининга нескольких последовательностей, предназначенных для содействия exon пропуск9. Тем не менее, деятельность AONs является преходящим. Чтобы получить устойчивое выражение антисенсных последовательностей, мы также исследовали небольшие ядерные РНК (snRNAs) в сочетании с AAV, что позволяет ядерной локализации и включения в сращиваниямашины 10. U7 является snRNA, участвующих в обработке гистона мРНК, которые могут быть разработаны, чтобы связать белки, которые будут перенаправлять его в сплайсеосомы и доставить антисенспоследовательности 11. Использование модифицированных SNRNAs U7 в сочетании с векторами AAV преодолевает ограничения AONs в результате продолжающегося выражения AONs и лучшей трансдукции тканей, представляющихинтерес 12. Мы используем клетки, полученные от пациентов DMD для этого протокола, чтобы проиллюстрировать экзон-пропуск стратегии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты и биопсия проводились в соответствии с этическими нормами учреждений, участвующих в утверждении Национального совета по институциональному обзору детских больниц.

1. Инициирование дермальной культуры фибробластов

  1. Создание культуры фибробластов
    1. Aliquot 10 мл фибробластовой среды(таблица 1) в 15 мл конических труб. Биопсия кожи должна быть помещена и транспортирована в этой среде. Биопсия может храниться при 4 градусах Цельсия до тех пор, пока она не будет обработана, преимущественно в тот же день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте биопсию кожи в течение 24-36 часов, чтобы избежать потенциального роста загрязнения.
    2. Аспирировать средства массовой информации из трубки и промыть биопсию с 10 мл 1X PBS (комнатная температура) в три раза. После третьей стирки оставьте PBS в трубке.
    3. Вылейте PBS и кожу на 10 см2 блюдо.
    4. Используя стерильные скальпели, разрежьте биопсию на как можно меньше фрагментов.
    5. Используя пипетки, перенесите отдельный фрагмент кожи и опустите его в чистое 10 см2 блюда. Поместите от 10 до 12 фрагментов на блюдо.
    6. Аспирировать избыток PBS со всего каждого фрагмента. Будьте осторожны, чтобы не аспирировать фрагмент.
    7. Накройте посуду частично крышкой и дайте фрагментам кожи высохнуть в течение 5-20 мин. Не позволяйте фрагментам высыхать чрезмерно.
    8. Как только фрагменты высохнут, наклоните блюдо на 45 градусов и медленно добавьте 12 мл фибробластовой среды в угол. Опустите блюдо, тщательно распространяя средства массовой информации, чтобы фрагменты не поднимались средствами массовой информации.
    9. Поместите посуду в инкубатор (37 градусов по Цельсию, 5% CO2). Замените средства массовой информации через 5-7 дней, и один раз в неделю после.
    10. Наблюдайте за фибробластами, выходящимииз фрагмента (рисунок 2)и, после слияния, проход клеток в 75см 2 колбы. Удалите носитель, промойте клетки PBS и добавьте 1 мл 0,25% трипсина. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут или до тех пор, пока все клетки не будут сняты. Добавьте 10 мл фибробластовой среды роста, чтобы ингибировать трипсин и перенести клетки в новую колбу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для номенклатуры номера прохода, P1 устанавливается, когда первые фибробласты, которые вышли из биопсии кожи передаются в новую колбу для пролиферации.
  2. Криоконсервация первичных фибробластных линий
    1. После того, как 75см 2 колбы стечены, промойте его 10 мл 1X PBS и аспирировать PBS.
    2. Добавьте 3 мл 0,25% трипсина на поверхность клетки. Поместите колбу в инкубатор на 5 мин. Проверьте колбы под микроскопом, чтобы увидеть, если клетки подняты. Если нет, поместите колбу обратно в инкубатор еще на 5 минут.
    3. После того, как клетки отделены, добавить 7 мл фибробластового средства массовой информации в колбу и пипетку вверх и вниз, чтобы повторно использовать клетки. Соберите клетки в коническую трубку 50 мл.
    4. Подготовьте 100 йл алицит трипан синий, и удалить 100 йл из образца криоконсервированных, смешать с trypan синий. Загрузите смесь на гемоцитометр, чтобы посчитать. Подсчитайте клетки в четырех различных областях гемоцитометра под микроскопом. Для расчета общего количества ячеек используйте формулу: (подсчитанные ячейки/100) - объем культуры.
    5. Спин конические трубки при температуре 300 х г в течение 10 минут при комнатной температуре или 4 градусов по Цельсию.
    6. Аспирировать от среды и повторного перерасхода клеток в адекватном объеме замораживания среды: 1 мл на каждый 1 миллион клеток / флакон. Pipette вверх и вниз, чтобы гомогенизировать и распространять 1 мл для каждого помечены криовиальной.
    7. Поместите флаконы в морозильную коробку и дайте флаконам замерзнуть со скоростью 1 градус по Цельсию/мин при -80 градусов по Цельсию на ночь.
    8. На следующий день перенесите флаконы в резервуар с жидким азотом или морозильную камеру .150 градусов по Цельсию.

2. Создание сотовой линии FibroMyoblasts (FM)

  1. Семя первичных фибробластов примерно на 30% от слияния в двух скважинах 12-хорошо пластины (2 х 104 клеток / хорошо), с тем чтобы иметь около 50% слияния на следующий день.
  2. Для лентивирусной трансдукции добавьте от 2 до 5х 10 9 вг (вирусные частицы генома) вируса hTERT-пуромицина в 400 МКл фибробластовой среды. К второй хорошо, добавить только 400 йл фибробластовой среды. Добавьте 1 мл мультимедиа на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмиды для производства лентивируса были получены из группы, которая опубликовала Chaouch и др.,2009 бумаги. Они также описаны индивидуально в Aure et al, 200713 для hTERT плазмид и Барде и др.,200614 для системы Tet-on, используемой для проектирования плазмиды MyoD. Они были получены благодаря соглашению о передаче материалов с Genethon, Франция (пожалуйста, свяжитесь с доктором Винсентом Мули, чтобы получить эти плазмиды- vincent.mouly@upmc.fr ). Короче говоря, hTERT состоит из HTERT вариант 1 управляется промоутер CMV в то время как пуромицин управляется промоутер PGK. Плазмида MyoD содержит myoD вариант 1, управляемый промоутером CMV под контролем репрессора rtTA2. Эта плазмида также содержит гигромицин выбор выражается благодаря промоутер SV40.
    Лентивирусы были произведены с использованием регулярного лентивирусного производства (см. протокол Ван и МакМанус JoVe15). Кратко, MDL-помощник, Rev-Helper, SVS-G-помощник были transfected через осадки хлорида кальция также или hTERT или плазмиды MyoD. После 48 ч, супернатант был собран, а затем в течение дополнительных трех дней. Все супернатанты были затем сосредоточены ультрацентрифугации. Затем гранулы были повторно использованы в буфер Tris-HCL-NaCl-EDTA. Оценка Titer была оценена стандартным анализом лентивируса qPCR.
  3. Один или два дня спустя, передать клетки в 6-хорошо пластины и расти их до достижения 60-70% слияния.
  4. Дополните фибробластовую среду 1 мкг/мл пуромицина и добавьте по 2 мл в каждую хорошо.
  5. Держите клетки под отбором до тех пор, пока все клетки в управлении хорошо мертвы (до 12 дней), меняя средства массовой информации каждые 2-3 дня. Прохождение клеток из 6-хорошо пластины в два 10 см2 блюда для дальнейшего распространения.
  6. Заморозить флаконы фибробластов после отбора. Этикетка как F(hTer).
  7. Семена hTERT-экспрессии фибробластов (F(hTer)) около 30% слияния в фибробластовой среде, в двух скважинах 12-хорошо пластины, чтобы иметь около 50% слияния на следующий день.
  8. Для трансдукции лентивируса смешайте от 2 до 5 х10 9 вг миоД-гигромицина В лентивируса в 400 мкл фибробластовой среды и добавьте к соответствующим скважинам; к третьей хорошо добавить 400 йл фибробластовой среды. Добавьте 1 мл среды на следующий день.
  9. Через один-два дня перенесите клетки в 6-хорошо пластины и расти до 60-70% слияния.
  10. Дополните фибробластовую среду роста гигромицином B (400 мкг/мл) и добавьте по 2 мл в каждую колодец.
  11. Держите клетки под отбором до тех пор, пока все клетки в управлении хорошо мертвы (до 12 дней), меняя средства массовой информации каждые 2-3 дня.
  12. Заморозить флаконы фибробластов после отбора. Этикетка как FM с последующим идентификационным номером/именем ячейки.

3. Протокол трансдифференцирования

  1. Семя трансфуцируется FM на 10см 2 блюда с 30-40% слияния. В пластине из 12 колодец семя 6 х 104 клеток (это зависит от индивидуальной клеточной линии).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммуностеинирования, семенные клетки на стеклянные крышки или камерные слайды покрыты Matrigel. Разбавить Matrigel в 1:10 в среде DMEM, добавить объем достаточно, чтобы покрыть поверхность, и пусть слайды сидеть при комнатной температуре в течение одного часа. Аспирировать прямо перед посевом клеток.
  2. Для индукции миобластов, когда фибробласты достигли 70% слияния(рисунок 3A ), промыть поверхность клеткис PBS и добавить свежие средства массовой информации миобласт дополняется свежим 8 мкг / мл доксициклина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успех дифференциации скомпрометирован мимо 80% слияния.
  3. Через два-три дня клетки на 90-95% стекут, и их морфология изменится(рисунок 3B). Промыть поверхность клетки с PBS и добавить свежие средства дифференциации дополняется свежим 8 мкг / мл доксициклина.
  4. Продолжайте менять средства массовой информации каждые 2-3 дня, не пропуская до тех пор, пока миотрубы не будут установлены (подтвердите с помощьюморфологии) (рисунок 3C).
  5. Через семь-десять дней после начала дифференциации миотрубов клетки должны быть полностью дифференцированы и могут начать отделяться или умирать. Прежде чем это произойдет, урожай myotubes для дальнейшего анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время формирования миотруба зависит от клеточной линии. Мутации в мышечных белках могут вмешиваться в миогенный потенциал. Когда миотрубы начинают появляться яркими и выглядеть белыми на границах это сигнал, который они начинают отделять(рисунок 4).
  6. Чтобы собрать миотрубы, соберите мультимедиа и перенесите его в коническую трубку 50 мл. Среда может содержать myotubes, которые отделились.
  7. Промыть миотрубы с 5 мл PBS и передачи PBS на 50 мл трубки.
  8. Добавьте 3 мл 0,25% трипсина на поверхность клетки. Поместите блюдо в инкубатор на 5 минут. Проверьте блюдо под микроскопом, чтобы увидеть, если клетки подняты. Если нет, поместите его обратно в инкубатор еще на 5 минут.
  9. После того, как клетки отделены, добавить 7 мл фибробластового средства массовой информации в блюдо и пипетки вверх и вниз, чтобы повторно использовать клетки. Соберите клетки до конической трубки 50 мл.
  10. Центрифуга при 1200 х г в течение 7 мин при 4 градусах Цельсия.
  11. Тщательно аспирировать жидкость, не нарушая гранулы. Храните гранулы при -80 градусов по Цельсию до дальнейшей обработки.

4. Иммуностиминг дифференцированных миотрубов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для иммуностеинирования, расти клетки в стеклянных coverslips или камеры слайды, как отмечалось выше.

  1. После того, как myotubes полностью дифференцированы, аспирировать от средств массовой информации и тщательно промыть слайды с PBS. Аспирировать PBS прочь.
  2. Добавить свежие 4% PFA (500 йл на колодец 12-хорошо пластины) и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Аспирировать PFA прочь.
  3. Промыть 1 мл PBS.
  4. Инкубировать 0,2 М глицина при комнатной температуре, в течение 10 мин. Аспират глицин выключен.
  5. Пермякость с PBS 0,5% TritonX-100 (300 йл/колодец пластины 12-хорошо), в течение 10 мин с нежным возбуждением.
  6. Блок с 300 йл/колодец блокирующего раствора, в течение 10 мин с нежным возбуждением.
  7. Инкубировать первичным антителом разбавленным 1:50 в 300 МЛ блокирующего раствора, в течение 2 часов при комнатной температуре, с нежной тряской.
  8. Промыть три раза с 1 мл / хорошо PBS в течение 5 минут, с нежной тряски.
  9. Инкубировать вторичными антителами, разбавленными 1:500 в 300 МЛ блокирующего раствора, в течение 1 часа, при комнатной температуре, с нежной тряской. Накройте тарелку алюминиевой фольгой.
  10. Промыть три раза с 1 мл / хорошо PBS в течение 5 минут, с нежной тряски.
  11. Инкубировать с DAPI разбавленной в PBS в течение 10 минут. Промыть три раза с 1 мл / хорошо PBS.
  12. Добавьте каплю монтажной среды в стеклянную горку. Снимите крышку с хлипами и поместите его лицом вниз на падение монтажной среды.
  13. Инвертировать слайд на бумажное полотенце и осторожно нажмите, чтобы удалить пузырьки и избыток монтажа среды.
  14. Печать слайдов с лаком для ногтей и хранить при 4 градусов по Цельсию до изображения.

5. Антисенсовая олигонуклеотидная трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол ниже для трансфекции 6-хорошо пластины. Отрегулируйте объемы соответственно для более малых или более больших плит. Трансфекция осуществляется в 100% стеченных миобластов, когда клетки готовы к этапу дифференциации.

  1. Аспирировать миобласт роста средств массовой информации и промыть клетки с 1 мл PBS.
  2. Добавьте 500 мкл/колодец средств массовой информации OptiMEM и инкубировать при 37 градусах цельсия в течение 1 часа.
  3. Разбавить антисенсовый олигонуклеотид (AON) в 100 МЛ OptiMEM до желаемой конечной концентрации (т.е. 50 нм, 100 нм, 200 нм, 500 нм). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для 2'omethyl-фосфоротиоат AONs.
  4. Смешайте липофектамин с OptiMEM (окончательный объем 100 МКЛ), чтобы дать окончательное соотношение 1:1 (МКГ ДНК: липофектамин). Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
  5. Смешайте разбавленный липофектамин с разбавленным AON. Смешайте осторожно pipetting и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить сложное образование. Избегайте пузырьков воздуха.
  6. Добавьте 200 МЛ липофектамина и смеси AON в соответствующие скважины. Инкубировать клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
  7. На следующий день удалите смесь трансфекции и добавьте 2 мл теплого средства дифференциации, дополненное доксициклином.
  8. Соберите клетки по крайней мере через три дня для извлечения РНК или от семи до 21 дней в случае анализа белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дни дифференциации, необходимые для обнаружения экспрессии РНК и/или белка, могут варьироваться соответственно к гену интереса или клеточной линии. В случае DMD, можнообнаружить его мРНК в течение трех дней. Обнаружение белка дистрофина требует не менее семи дней. Это будет варьироваться в зависимости от линии ячейки. Высокие концентрации АОН и трансинфекционного реагента могут повлиять на трансдифференцирование.

6. Трансдукция AAV1-U7

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован для 6-хорошо пластин. Отрегулируйте объемы пропорционально площади поверхности культуры. Трансдукция осуществляется в 100% стеченных миобластов, когда клетки готовы к этапу дифференциации. AAV1 является серотипом AAV с лучшей трансдуктивной способностью культурных миобластов.

  1. Аспирировать от миобластной среды роста и промыть клетки с 1 мл PBS.
  2. Разбавить 0,5-1 х10 11 вирусных частиц AAV1-U7 в 700 МКЛ теплой дифференциации средств массовой информации дополняется доксициклина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем qPCR для определения вирусной концентрации. Количество вируса, который будет использоваться может варьироваться в зависимости от метода количественной оценки и должны быть определены ранее с помощью анализа репортера.
  3. Добавить вирусную смесь в колодец, сбросив его однородно.
  4. На следующий день добавьте 1,3 мл теплого средства дифференциации, дополненное доксициклиным.
  5. Соберите клетки по крайней мере через три дня для извлечения РНК или от семи до 21 дней в случае анализа белка.

7. Добыча РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, используемые во время этого шага должны быть RNase бесплатно.

  1. Добавьте 500 мкл TRIzol на гранулы и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что клетки однородно лизированы.
  2. Перенесите лизат клетки в трубку 1,5 мл и инкубируется в течение 5 минут при комнатной температуре.
  3. Добавьте 100 МКЛ хлороформа и встряхните вручную в течение 15 с. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Центрифуга при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите aqueous фазу (верхняя) и перенесите ее в новую трубку 1,5 мл.
  5. Для 1 тома aqueous фазы, добавить 1 том этанола 100% и перемешать с помощью пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем очистку столбца и концентрацию.
  6. Перенесите образец в колонку ИК «Зимо-Спин» в коллекторной трубке и центрифуге по 12 000 х г на 30 с. Отбросьте поток через.
  7. Для в колонке DNase я пищеварения, предварительно мыть колонку с 400 йл РНК мыть буфера. Центрифуга при 12 000 х г на 30 с. Отбросьте поток через.
  8. Подготовь 40 МКЛ смеси реакции DNase на образец. Смешайте 5 МКЛ DNase I с 35 йл ДНК пищеварения буфера.
  9. Добавьте смесь непосредственно в матрицу столбца. Инкубация при комнатной температуре в течение 15 мин.
  10. Добавьте 400 йл РНК Prep Buffer к колонке и центрифуге на 12000 х г для 30 с. Отбросьте поток через.
  11. Добавьте к колонке буфер РНК для промывки 700 МКЛ и центрифугу на уровне 12 000 х г на 30 с. Отбросьте поток через.
  12. Добавьте 400 йл РНК Wash Buffer к столбец и центрифугу на 12000 х г в течение 2 минут, чтобы обеспечить полное удаление буфера стирки. Перенесите колонку тщательно в RNase-бесплатно 1.5mL трубки.
  13. Добавьте 15 нуклеазных нуклеазных вод непосредственно к матрице столбца. Инкубировать в течение 5 минут и центрифугу при 12000 х г в течение 1 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите элевую РНК и применить его снова к столбец для увеличения урожайности. Центрифуга при 12 000 х г в течение 1 минуты.
  14. Поместите образцы на лед и количественно образцы в Nanodrop.
  15. Храните образцы при -80 градусов по Цельсию.

8. Анализ RT-PCR

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мы представляем предложение реагентов для обнаружения экспрессии дистрофина мРНК, но он может быть легко адаптирован к другим реагентам выбора.

  1. Обратная транскрипция
    1. Оттепель все реагенты и держать их на льду.
    2. Подготовьте смесь с 4 МКЛ 5x буфера реакции, 2 МКЛ dNTP Mix (10 мМ), 1 йл ингибитора RiboLock RNase и 1 МЛ RevertAid RT.
    3. Смешайте трубку осторожно и центрифугу кратко.
    4. В 0,2 мл ПЦР труб, добавить достаточный объем РНК для того, чтобы иметь 1 мкг на реакцию. Добавьте безнуклеазную воду q.s.p 12 ЗЛ. Включите одну трубку без обратной транскриптазы в качестве отрицательного контроля и одну трубку с безнуклеазной водой вместо РНК.
    5. Распределите 8 мкл реакционной смеси на трубку. Общий объем составляет 20 мл.
    6. Поместите трубки в термоциклер и инкубировать в течение 5 минут при 25 градусов по Цельсию, а затем 60 мин при 42 градусов по Цельсию. Остановите реакцию, нагревая при 70 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
    7. Поместите трубки на лед или при -20 градусов по Цельсию для более длительного хранения.
  2. ПЦР
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн грунтовки на exons соединения предпочтительно.
    1. Вихревые реагенты и спина вниз перед использованием.
    2. Подготовь мастер-микс с использованием форварда грунтовка 0,5 МКЛ (25 МКМ), 0,5 МКЛ обратной грунтовой (25 МКМ), 12,5 йл 2x PCR Master Mix, и 8,5 мл нуклеазной воды на образец.
    3. Aliquot 22 МКЛ мастер смеси в трубку для каждого образца.
    4. Добавьте 3 МКЛ кДНА (150 нг) к соответствующей трубке ПЦР. Добавьте 3 МКЛ воды без нуклеазы в ПЦР-негативную контрольную трубку.
    5. Вихрь и спина вниз ПЦР труб.
    6. Инкубировать трубки в термоциклере при 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин, 95 градусов по Цельсию на 30 с, (Tm-5) КК на 30 с, 72 градусов по Цельсию для (1 мин/кб) 34 раза, 72 КК в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная температура аннеаля может быть определена эмпирически. Для предложенной мастер-микст вычитаете 5 градусов по Цельсию от температуры плавления грунтовки.
    7. Загрузите 12 МКЛ реакции ПЦР на агарозный гель и заморозьте образцы при -20 градусов по Цельсию.

9. Обнаружение экспрессии дистрофина западным Blotting

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для дистрофина, большого мембранного белка. Специфические условия могут быть необходимы для различных белков.

  1. Извлечение белка
    1. После 7-21 дней дифференциации, собирать клетки с 5 мл PBS с 100 йл 0,5 М ЭДТА, и 50 ингибиторов протеазы. Инкубация при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока клетки не отсоединятся. Центрифуга при 1200 х г в течение 5 мин при 4 градусах Цельсия. Заморозить гранулы, окунув трубку в жидкий азот. Храните гранулы при -80 градусов по Цельсию или приступайте к этапу лиза.
    2. Подготовь буфер лиза, добавив 1% дигонина, 1% ингибитор протеазы, 10% ингибитора фосфатазы и базовый буфер к общему объему (60 мкл на клеточные гранулы).
    3. Добавьте 60 МКЛ буфера лиза в клеточные гранулы, на льду. Соникат за 5 с. Пусть сидят на льду в течение 8 с. Повторите звуковые и остальные шаги дважды.
    4. Инкубировать образцы на льду в течение 30 мин.
    5. Центрифуга при 14 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия.
    6. Перенесите супернатант в чистые трубки.
    7. Количественная оценка образцов бицинхониновой кислоты (BCA) анализ, следуя инструкциям производителя.
    8. Смешайте белковый раствор с соответствующим объемом буфера Laemmli. Сделайте алициты по 100 мкг. При необходимости отрегулируйте громкость до 25 мкл с помощью буфера базовоголиза. Храните образцы при -80 градусов по Цельсию.
  2. Западный blotting
    1. Образцы оттепели на льду.
    2. Денатура образцов при 100 градусов по Цельсию в течение 5 минут, а затем охладить их во льду, спина вниз.
    3. Разбавить 20X Tris-ацетат SDS работает буфер в 200 млdH 2O и добавить 500 МКЛ антиоксидант.
    4. Подготовка 3-8% Трис-ацетат полиакриламид гель, удалив гребень и полоскания с dH2O. Соберите гель в аппарате электрофорез. Заполните внутреннюю камеру бегущим буфером.
    5. Загрузите 5 МКЛ белковой лестницы и 25 МКЛ образца в геле. Заполните внешнюю камеру бегущим буфером.
    6. Запуск на 80 V для 1 ч при 4 градусов по Цельсию. Затем при 120 V для 2 ч при 4 градусах Цельсия.
    7. Подготовь 3 л буфера передачи 1X с 150 мл метанола 20X, 150 мл буфера передачи 20X и 2700 мл dH2O. Охлади его до 4 градусов по Цельсию.
    8. Вырезать 4 куска фильтровальной бумаги и один кусок нитроцеллюлозы мембраны. Замочите бумажный фильтр и мембрану в лоток с буфером передачи.
    9. Аккуратно удалите гель из корпуса и соберите его в переносной аппарат с фильтровальной бумагой, мембраной и губками. Гель помещается на отрицательной стороне и мембраны на положительной стороне.
    10. Вы запустите передачу на 300 мА, помешивая, при 4 градусов по Цельсию, на ночь.
    11. Заблокировыв мембрану в 10 мл блокирующего буфера на 1 ч с нежным возбуждением, при комнатной температуре.
    12. Приготовьте первичный раствор антитела с 10 мл блокирующего буфера и 50 МЛ дистрофиных антител (1:200).
    13. Отбросьте блокирующий буфер и добавьте основной раствор антитела. Инкубировать с нежным возбуждением, по крайней мере 2 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
    14. Промыть мембрану три раза с 0,1% Tween PBS, в течение 5 мин с нежным возбуждением.
    15. Подготовь вторичный раствор антитела, используя 10 мл блокирующего раствора, 2 МКЛ антиплихиных антител (1:5000) и 20 мл 0,2% Tween.
    16. Добавьте вторичный раствор антитела к мембране. Инкубировать в течение 1 ч с нежным возбуждением, покрытые алюминиевой фольгой для защиты от света.
    17. Откажитесь от раствора антитела и промойте мембрану 3 раза при 0,1% Tween PBS, в течение 5 мин с нежным возбуждением, защищенным от света.
    18. Воздействие и изображение мембраны на устройстве визуализации.
    19. Пятно мембраны для общего белка с Revert 700 Всего белка пятно, следуя инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение дистрофина западным blotting зависит от возраста / мутации пациента и способность клетки предохранитель и оставаться прилагается достаточно времени, чтобы накопить достаточно дистрофина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол показывает, как установить человека кожи полученных фибробластов культур и преобразовать их в миобласты, а затем в дифференцированных миотрубов. Этот тип клеточной линии чрезвычайно полезен для изучения нервно-мышечных расстройств и в пробирке тестирования потенциальных методов лечения.

Схематическое представление преобразования фибробластов показано на рисунке 1. На рисунке 2A показан фрагмент кожи и фибробласт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для получения FM-клеток линий с хорошим качеством, некоторые шаги имеют решающее значение. Чем раньше будет обработана биопсия кожи, тем больше шансов получить здоровые фибробласты. Прохождение числа фибробластов культур также имеет важное значение. Первичные клетки имеют ограниченную пролиферативную способность и после многих проходов, они входят в репликациольной сенесценции. Таким образом, лучше иметь запас фибробластов при низком количестве прохода и трансформировать клетки при самом раннем прохождении, насколько это...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Национальная детская больница лицензировала exon 2 пропуск программы, описанной в настоящее время Audentes терапии. K.M.F. и N.W. получили выплаты роялти в результате этой лицензии.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Винсента Мули за то, что он поделился своими знаниями в прошлом в отношении этой модели. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США Национальный институт неврологических расстройств и инсульта (R01 NS043264 (K.M.F., и Р.B.В.)), Национальный институт здравоохранения США Национальный институт артрита и опорно-двигательного и кожных заболеваний (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., и N.W.). N.W. получил стипендианую поддержку от Университета штата Огайо/Национальной детской больницы Muscle Group и Фонда Филиппа. Эта работа была также поддержана внутренними дискреционными фондами, и часть exon 2 пропуск работы была поддержана также CureDuchenne (K.M.F.) и Ассоциация Франсез Контре Les Myopathies. Номер IRB: IRB: IRB10-00358/ CR00005138 и IBCSC: IBS00000123.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка 100 мм Corning430167
0,25% Трипсин-ЭДТА, фенол красныйThermo Fisher2500056
10X Фосфатный буферный раствор (PBS)Fisher ScientificBP3994
12-луночная пластинаCorning3513
20X Трансферный буферThermo FisherNP00061
20X Трис-ацетат SDS буфер для бегаThermo FisherLA0041
3-8% гель с трис-ацетатомThermo FisherEA0378BOX
75 см2 колбаCorning430641U
Антибиотик-антимикотик 100XThermo Fisher15240062
Анти-миозин тяжелая цепь, саркомер антителаИсследования развития Hybridome BankMF20 супернатантРазведение 1:50
АнтиоксидантThermo FisherNP0005
BCA Protein AssayThermo Fisher23227
ХлороформSigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571Разбавление 1:1000
ДигитонинМиллипоры Sigma300410250MG
ДиметилсульфоксидSigma-AldrichD2438
DMEM, Добавка с высоким содержанием глюкозы, GlutaMAX, пируватThermo Fisher10569044
набор ДНК I (250U)Zymo Research CorporationE1010
Доксициклина гидрохлоридFisher ScientificBP2653-5
Dup2 человеческие праймерыFw_5' GCTGCTGAAGTTTTTTGG
TTTCTC 3'Rv_5		' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'Дистрофин
антителаAbcamab15277Разведение 1:200
Фетальная бычья сывороткаThermo Fisher16000
ГлицинSigma-AldrichG8898
Козья антимышь, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001Разведение 1:1000
Коктейль ингибиторов протеазы Halt 100XThermo Fisher78430
ГемоцитометрHausser Scientific3100
Гигромицин BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD козий анти-Rabbit IgG (H+L)Li-Cor926-68071Разведение 1:5000
Lab-Tek II CC2 камерная скользящая системаThermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Липофектамин 3000 Реагент для трансфекцииThermo FisherL3000008
Matrigel GFR мембранная матрицаCorning354230
МетанолFisher ScientificA412P-4
Mr. Frosty Морозильный контейнерThermo Fisher51000001
Нитроцеллюлозная мембрана 0,45 &; mGE Healthcare Life Sciences10600002
Нормальная козья сыворотка для контроляThermo Fisher10000C
Odyssey Блокирующий буфер (PBS)Li-Cor927-40003Блокирующий буфер для вестерн-блоттинга
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher11058021
параформальдегидSigma-Aldrich158127
Мастер-смесь для ПЦРThermo FisherK0172
Ингибитор фосфатазыThermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio Rad1610374
PuromycinThermo FisherA1113803
Revert 700 Total Protein Stain для нормализации вестерн-блоттингаLi-Cor926-11021
RevertAid наборThermo FisherK1691
RNA Clean & Концентратор-25Zymo Research CorporationR1018
СкальпелиОсина Хирургическая372611
Среда для дифференцировки клеток скелетных мышцPromocellC23061
Среда для роста клеток скелетных мышцPromocellC23060
Triton X-100Acros Organics215682500
реагентTRIzolThermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
Морозильная камера для ультранизких температурThermo Scientific7402
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher15575020
Vectashield монтажная среда для защиты от выцветанияVector LabsH1000

Ссылки

  1. Bigot, A., et al. Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts. Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).
  2. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).
  3. Pantic, B., et al. Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts. Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).
  4. Thorley, M., et al. Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines. Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).
  5. Chaouch, S., et al. Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen. Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).
  6. Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
  7. Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy. Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).
  8. Hwang, J., Yokota, T. Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies. Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).
  9. Wein, N., et al. Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).
  10. De Angelis, F. G., et al. Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).
  11. Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).
  12. Wein, N., et al. Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice. Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).
  13. Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene. Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).
  14. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  15. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).
  16. Amack, J. D., Mahadevan, M. S. Myogenic defects in myotonic dystrophy. Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

hTERTMYOD
Прямое перепрограммирование фибробластов человека в миобласты для исследования терапии нервно-мышечных расстройств
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.