Здесь мы описываем использование Grafix (Gradient Fixation), центрифугирования градиента глицерина в присутствии сшивающего фактора, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование Grafix для обнаружения переходных интеракторов Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сплайсинг премрнК является очень динамичным процессом, который включает в себя множество молекулярных перестроек подкомплексов сплайсеосом во время сборки, обработки РНК и высвобождения сложных компонентов. Градиентное центрифугирование глицерина было использовано для разделения белковых или RNP (RiboNucleoProtein) комплексов для функциональных и структурных исследований. Здесь мы описываем использование Grafix (Градиентная фиксация), который был впервые разработан для очистки и стабилизации макромолекулярных комплексов для криоэлектроно-микроскопии одиночных частиц, для выявления взаимодействий между факторами сплайсинга, которые временно связываются со сплайсеосомным комплексом. Этот метод основан на центрифугирование образцов в возрастающую концентрацию фиксирующим реагентом для стабилизации комплексов. После центрифугирования дрожжевых общих экстрактов, нагруженных на градиенты глицерина, восстановленные фракции анализируют точечным пятном для выявления подкомплексов сплайсеосом и определения наличия отдельных факторов сплайсинга.
Введение
Сплайсинг является очень динамичным процессом, который требует скоординированного связывания и высвобождения множества факторов. Эти сплайсинговые факторы включают РНК-связывающие белки, АТФазы, геликазы, протеинкиназы и фосфатазы, убиквитиновые лигазы, среди прочих1,2,3; и чтобы обеспечить молекулярные перестройки, некоторые из этих факторов очень временно связываются с подкомплексами сплайсеосом, что делает выделение и идентификацию этих промежуточных комплексов RNP очень сложной.
Здесь мы использовали методGrafix 4,5 для стабилизации взаимодействия фактора сращивания дрожжей Cwc24 с комплексом 6акта B, чтобы позволитьидентифицировать другие факторы, связанные одновременно с этим подкомплексом, и определить, играет ли убиквитин-лигаза Prp19 какую-либо роль в связывании или высвобождении Cwc24 с комплексом Nineteen (NTC) и с 5' концом интрона до активации и первой реакции трансетерификации место. Преимущество воздействия макромолекул на возрастающую концентрацию сшивки вдоль градиента глицерина заключается в том, что оно позволяет избежать межкомплексных сшивок4,5,а значит, и образования агрегатов.
Этот метод был использован в качестве дополнения к белкам коиммунопреципитации и вытягивания анализов, которые, несмотря на возможность выделения крупных комплексов, могут быть ненадежными для поддержания переходных взаимодействий в больших динамических комплексах7,8. Применение реагентов фиксации в градиенте глицерина стабилизирует связывание таких факторов, позволяя подтвердить взаимодействие специфических белков со сплайсинговыми подкомплексами. Поскольку выбранный сшиватель был химически необратимым, белки, присутствующие в восстановленных фракциях, анализировали методом точечного пятна после градиентного центрифугирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Общий экстракт дрожжей
- Выращивают дрожжевые клетки, экспрессирующие один из сплайсинговых факторов, слитых с меткой TAP9 в 1 л YNB-клеевой среде (дрожжевая азотная основа, дополненная 2% м/об глюкозы) с соответствующими аминокислотами или нуклеиновыми основаниями, в данном случае аденин (20 мкг/мл), лейцин (30 мкг/мл), триптофан (30 мкг/мл), до ОД 600=1,0.
- Соберите клетки из культуры 1 л путем центрифугирования в трех бутылках центрифуги по 500 мл при 17 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и дважды промыть 10 мл холодной стерильной водой.
- Повторно суспендировали собранные дрожжевые клетки в 1/10 клеточного объема холодного буфера А (10 ммольL-1 HEPES pH = 7,9, 1,5 ммоль L-1 MgCl2, 50 ммоль L-1 KCl, 5% v/v глицерина, 0,5 ммоль L-1 DTT, коктейль ингибитора протеазы без ЭДТА).
- Заморозить небольшие капли клеточной суспензии в жидком азоте. Небольшие капли могут быть получены путем пипетирования повторно суспендированного клеточного раствора и капли 50 мкл непосредственно в жидкий азот.
ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать травмы при контакте с кожей или глазами. Управление с использованием соответствующего защитного оборудования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Замороженные капли клеточной суспензии можно хранить при -80 °C. - Приготовьте лизаты дрожжевых клеток путем измельчения в шаровом устройстве через шесть циклов при частоте 20 Гц/с в течение 3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого цикла погружайте контейнер с замороженными клетками в жидкий азот, чтобы избежать плавления. Здесь протокол можно приостановить. Замороженные экстракты могут храниться при -80 °C. Дрожжевые сращивающие экстракты также могут быть приготовлены с использованием гомогенизаторов для лизута сферопластов10или с использованием ступки ипестиков 11,12. - Расплавьте экстракт, поместив содержащие их трубки в воду комнатной температуры, периодически встряхивая.
- Центрифужные экстракты при 45 000 х г в течение 1 ч при 4 °C.
- Количественно оценить содержание белка в очищенном супернатанте методом13BCA.
- Приготовьте аликвоты экстрактов, быстро заморозьте их в жидком азоте и храните при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
2. Подготовка градиента глицерина
- Приготовьте два раствора глицерина в буфере А, один из которых содержит 10% v/v, а другой содержит 30% v/v глицерина.
- Добавляют сшивающий агент глутаровый альдегид до 0,1% v/v в 30% v/v растворе глицерина и смешивают для гомогенизации.
ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте глутаровый альдегид внутри вытяжного капота, используя соответствующее защитное оборудование. - Добавьте 6 мл холодного 10% v/v раствора глицерина в нижнюю часть 12 мл центрифужной трубки (14 x 89 мм).
- Добавьте 6 мл холодного 30% v/v раствора глицерина, дополненного глутаральным альдегидом, шприцем, прикрепленным к длинной игле, снабженной устройством Gradient Master в нижней части трубки, чуть ниже 10% v/v раствора глицерина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, 10% v/v раствор глицерина может быть тщательно пипетирован поверх 30% v/v раствора глицерина/глутаральдегида. - Используйте устройство Gradient Master для создания непрерывного градиента плотности.
ПРИМЕЧАНИЕ: В устройстве Gradient Master трубки помещаются в соответствующую стойку и поворачиваются кратковременно, следуя рекомендациям завода-изготовителя по определению параметров (время/угол/скорость). В этой работе мы использовали: 2:25 мин/81,5°/11 об/мин. - Осторожно добавьте 200 мкл 7% v/v глицерина/буфера подушки A сверху непосредственно перед добавлением клеточных экстрактов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация глицерина в подушке должна быть ниже, чем в менее концентрированном растворе глицерина, используемом для создания линейного градиента.
3. Центрифугирование экстрактов
- Загрузите примерно 2 мг общего белка поверх каждого 12 мл линейного градиента глицерина 10%-30% глутарового альдегида с подушкой.
- Поместите трубы в предварительно охлажденный ротор с поворотным ковшом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обрабатывайте трубки, чтобы избежать смешивания перед ультрацентрифугированием. - Центрифуга при 194 000 х г в течение 16 ч при 4 °C.
- Aliquot каждая трубка 12 мл в двадцати четырех фракциях 500 мкл с использованием адаптированной системы EconoSystem или путем тщательного пипетирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптированная система EconoSystem состоит из перистальтического насоса, УФ-детектора и дробного коллектора, подключенного к трубчато-перфораторному устройству. Профиль осаждения можно контролировать путем измерения поглощения при 280 нм. - Используйте 40% v/v раствор глицерина через перистальтический насос, чтобы протолкнуть 10-30% градиент глицерина из трубки в коллектор фракции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить фракции при -80 °C до использования. - Загрузите 50 мкл каждой фракции непосредственно на нитроцеллюлозные мембраны на устройстве точечного пятна или щелевого пятна. Обнаруживать белок иммуноблотом с использованием антител против CBP (1: 6000, для обнаружения cbP-части метки TAP) и анти-кроликов IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (1: 15 000) в качестве вторичного антитела.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы проанализировать профиль седиментации Cwc24-TAP и определить, был ли метод Grafix эффективен для стабилизации его связывания со сплайсинг-подкомплексами, мы разделили общие дрожжевые экстракты клеток, экспрессирующих Cwc24-TAP, путем центрифугирования на градиентах глицерина, в присутствии или отсутствии глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. Образцы двадцати четырех фракций 500 мкл затем анализировали путем прослойки с антителом против части CBP метки TAP. Результаты показывают, что при отсутствии сши...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Взаимодействие белка с белком и рибонуклеиновой кислотой и белком может быть стабилизировано с помощью сшивающих агентов. Важно, чтобы полученный комплекс был стабилен, чтобы выдерживать ультрацентрифугирование на градиенте глицерина. Кроме того, условия буфера должны допускать взаимодействие, но быть достаточно строгими, чтобы избежать неспецифического связывания. В экспериментах, показанных здесь, мы использовали буферный раствор, уже установленный для реакций сплайсинга in vitro15.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом FAPESP (15/06477-9).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антикальмодулин-связывающий белок Эпитоп | Millipore | 07-482 | |
| ECL анти-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Используемые части EconoSystem: перистальтический насос, УФ-детектор и сборник фракций |
| Коктейль ингибиторов протеазы без ЭДТА | Roche | 11873580001 | |
| Система рекуперации фракции | Beckman Coulter | 270-331580 | Трубчато-перфорационное устройство, которое было соединено с частями EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Смесительная мельница MM 200 | Retsch | 207460001 | Шаровая мельница Ротор |
| F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Центрифуга | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Ротор с качающимся ковшом P40ST | Hitachi | ||
| CP 80 NX | Ультрапрозрачные | ||
| (14 x 89 мм) | Beckman Coulter | 344059 |
Ссылки
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409(2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
