Применение мыши Партеногенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки в качестве замены спермы

Краткое содержание

Эта статья призвана продемонстрировать использование партеногенетических гаплоидных эмбриональных стволовых клеток в качестве замены спермы для строительства полу клонированных эмбрионов.

Аннотация

В организмах с половым размножением зародышевые клетки являются источником тотипотентных клеток, которые развиваются в новых особей. У мышей оплодотворение яйцеклетки сперматозоидом создает тотипотентную зиготу. Недавно несколько изданий сообщили, что гаплоидные эмбриональные стволовые клетки (гЕУ) могут заменить гетические геномы и способствовать эмбрионам, которые развиваются в мышей. Здесь мы представляем протокол применения партеногенетических гЕУ в качестве замены спермы для построения эмбрионов путем внутрицитоплазмической инъекции в яйцеклетки. Этот протокол состоит из шагов по подготовке гЕСК в качестве замены спермы, для инъекций хромосом геСК в яйцеклетки, а также для культуры полу клонированных эмбрионов. Эмбрионы могут дать плодородных полу клонированных мышей после переноса эмбриона. Использование гЕУ в качестве замены спермы облегчает редактирование генома в зародышевой линии, исследования эмбрионального развития и исследование геномного отпечатка.

Введение

У млекопитающих, gametes являются единственными клетками, которые передают генетическую информацию следующему поколению. Слияние яйцеклетки и сперматозоида образует диплоидную зиготу, которая переодейтся во взрослое животное. Мутации в игровых геномах, таким образом, наследуются потомством и управляют генетическими вариациями в^{видах 1.} Введение мутаций в зародышевой линии было применено для производства генетически модифицированных животных для различных биологических исследований, включая характеристику функции генов и моделирование заболеваний. Оба яйцеклетки и сперматозоиды являются неизлечимо дифференцированными и высокоспециализированными клетками, которые прекратили пролиферацию. Поэтому прямое модификация готе технически затруднена, разработаны специализированные подходы. Генетические модификации могут быть введены в зародыше мыши путем инъекции генетически модифицированных ESCs в бластоцисты, где они интегрируются в развивающийся эмбрион и колонизировать зародыши. Кроме того, широко распространена генетическая модификация зигот с использованием подходов к редактированию генома, включая систему CRISPR/Cas9.

Недавно был зарегистрирован выдающийся подход, который применяет haESCs в качестве замены для gametic^{генома 3,4,5,6,7,8}. HaESCs являются линиями стволовых клеток, полученных из внутренней клеточной массы партеногенетических или андрогенетических гаплоидных бластоцист^{и обладают одним набором хромосом 4,7,9,10}. Было продемонстрировано, что как партеногенетические, так и андрогенетические гЕУ могут способствовать геному полу клонированных мышей после интрацитоплазмической инъекции в яйцеклетки. В отличие от других подходов, геномы гЕУ могут быть непосредственно изменены в культуре из-за их способности к самооб обновлению. Внедрение генетических модификаций в зародышевую линию путем замены спермы геУКС является важным методом биологических исследований. Он предусматривает возможность отдельной культуры и манипулирования геномом матери или отцовской линии, которые получены из партеногенетических или андрогенетических гЕУ, соответственно. HaESCs могут быть использованы в качестве замены гегетического генома, что особенно выгодно для исследований геномного отпечатка, аллель-специфического выражения и родительских специфических процессов.

У мышей, как материнской, так и отцовской геномной информации требуется для нормального развития^{эмбриона 11}. Таким образом, полносрочные щенки не могут быть получены, когда дикий тип партеногенетических haESCs (phaESCs) были введены для замены^{генома спермы 5,8}. Чтобы преодолеть блок развития, геномный отпечаток материнского генома партеногенетических гЕШЕК необходимо скорректировать в отцовскую конфигурацию. Этого можно добиться путем манипулирования дифференциально метилированными регионами (ДМР). На сегодняшний день, целевые удаления H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR, и Rasgrf1-DMR были изучены для подавления матерински выраженных генов в phaESCs^3,5,8,12. Эти исследования показали, что удаления как H19-DMR,так и IG-DMRдостаточны для преобразования матери в конфигурацию отцовского отпечатка, которая может заменить хромосомы спермы. Интрацитоплазмическая инъекция фазексов, которые переносят два удаления ПМР в яйцеклетки, дает полу клонированных щенков с частотой от 5,1% до 15,5% перенесенных 2-клеточных эмбрионов.

Этот протокол основан на применении фаЭСКО с удалениями как H19-DMR, так и IG-DMR, которые мы термин дважды нокаутом phaESCs (DKO-phaESCs). Мы предоставляем подробные инструкции по модификации геномного отпечатка в фазах для создания линий DKO-phaESC, для инъекций DKO-фазесков в яйцеклетки в качестве замены генома спермы, для культуры полу клонированных эмбрионов для бластоцист, и для получения полу-клонированных мышей. Этот протокол является ссылкой для исследователей, которые требуют точных и прямых манипуляций отцовского генома и генерации полу клонированных эмбрионов и мышей.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились по лицензии No152/17 в соответствии со стандартами и правилами Кантональной комиссии по этике Цюриха и животноводческого комплекса EPIC в Институте молекулярных медицинских наук, ETH Цюрих.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол начинается с удаления H19- и IG-DMRsв phaESCs. Для получения подробной информации о том, как установить линии phaESC, пожалуйста, обратитесь к опубликованным^{отчетам 10,13}. Обзор и временные рамки этого протокола (шаги 1–14) представлены на рисунке 1A; мультимедиа, решения и буферы перечислены в таблице 1. Процедура создания линий DKO-phaESC (шаги 1-6) показана на рисунке 1B,а стратегия построения полу клонированных эмбрионов (шаги 7–14) изображена на рисунке 1C.

1. Трансфекция плазмидов для удаления H19-DMR и IG-DMR в phaESCs

1. Подготовь плазмиды CRISPR/Cas9 для совместного выражения нуклеаз Cas9 и наведи РНК для целевых удалений H19-DMR и IG-DMR. Ligate четыре пары направляющий РНК-олиго (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R, перечисленные в таблице 2) в плазмиды pX330.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к опубликованному протоколу о подробной процедуре подготовки этих 4 плазмидов CRISPR/Cas9¹⁴. Кроме того, плазмиды, доступные для общих штаммов мыши, также доступны через репозиторий(Таблица материалов).
2. Покрыть поверхность одной колодец 6-хорошо пластины с 1 мл 0,2% желатина раствора инкубации при 37 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
3. Плита 2 × 10⁵ фалесков дикого типа на желатиновом покрытом хорошо в среде haESC без антибиотиков, и инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO₂ в течение 1 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики опущены из среды для повышения эффективности последующей липофеции. Мы использовали фаЭКС дикого типа при прохождении 10. Мы рекомендуем использовать ранние фазы прохода, но различные номера прохода были успешно использованы⁸. Корреляция между числом проходов и эффективностью получения полу клонированных эмбрионов и мышей в настоящее время неизвестна.
4. Трансфект phaESCs в колодец 6-хорошо пластины (от шага 1,3) с 6 плазмидов одновременно с использованием реагента липофеции: 50 нг piggyBac плазмид проведения CAG-EGFP трансгена, 50 ng piggyBac транспозазы плазмид, и 600 нг каждого из 4 CRISPR/Cas9 плазмидов (от шага 1.1). Обратитесь к протоколу производителя о детальной процедуре трансфекции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Два piggyBac плазмиды используются для интеграции транспосона для повсеместного выражения расширенного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в геном фазек. Если маркировка клеток GFP не требуется, эти две плазмиды могут быть заменены плазмидой CRISPR/Cas9 для преходящей экспрессии белков флуоресценции (например, плазмиды pX458) вместо одной из плазмидов pX330. Переходное выражение EGFP может быть использовано для сортировки трансфицированных клеток.
5. Через два дня после трансфекции, аспирировать среды, и добавить 800 йл трипсина.
6. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO₂ в течение 5 минут. Затем добавьте 2 мл буфера для мытья, чтобы утолить трипсин, и пипетку несколько раз, чтобы получить одну подвеску ячейки.
7. Перенесите подвеску клетки в трубку 15 мл.
8. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин, и удалить супернатант.
9. Переусердуйте клеточные гранулы в 400 МКЛ буфера обслуживания haESC, дополненного 15 мкг/мл Hoechst 33342.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения потенциальной токсичности Hoechst 33342, 1 мкг/мл Hoechst 33342 и 50 МК Верапамил были использованы вместо 15 мкг / мл Hoechst 33342¹⁵.
10. Инкубировать подвеску клетки при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO₂ в течение 15 минут. После инкубации перенесите подвеску клетки в трубку 5 мл через крышку клеточного ситечко и держите трубку на уровне 4 градусов по Цельсию до готовности к использованию на следующем этапе (раздел 2).

2. Одноклеточное покрытие трансфицированных фазек с использованием цитометра потока

1. За день до сортировки трансфицированных фаЭСК, пластины облученных мышью эмбриональных фибробластов (MEFs) на желатин покрытием 96-хорошо пластин при плотности 4 × 10^{4 клеток} /^{см 2} в среде MEF. Как правило, 6 пластин готовы установить линию phaESC с целевыми удалениями. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Облученые МЕФ являются коммерчески доступными. Мы используем МЕФ, полученные из эмбрионов E12.5 мышей DR4. Несмотря на то, что гЕУ могут расти на пластинах с желатиновым покрытием без МЕФ, мы рекомендуем МЕФ для повышения жизнеспособности отсортированных одиночных гЕУ.
2. В день сортировки, аспирировать MEF среды из 96-хорошо пластин, и добавить 120 йл свежей среды haESC на колодец. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
3. Настройка сортера ячеев с соплом на 100 мкм в соответствии с инструкциями производителя. 355 нм УФ-лазер и 488 нм синий лазер используются для возбуждения Hoechst 33342 и EGFP флуоресценции, соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, Hoechst 33342 может быть обнаружен путем возбуждения с 405 нм.
4. Сортировать трансфицированных фазек в 5 мл трубки (от шага 1.10) с помощью ворот для сбора гаплоидных клеток в фазе G1/S, которые показывают выражение EGFP. Депозит одной ячейки в каждый колодец из 96-хорошо пластин из шага 2.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение Hoechst 33342 окрашивания обычно отличает 3 пики клеток с 1n, 2n, и 4n содержание ДНК, которые соответствуют гаплоидных клеток в фазе G1, смесь гаплоидных клеток в фазе G2/M и диплоидных клеток в фазе G1, и диплоидных клеток в фазе G2/M, соответственно. Гаплоидные клетки на фазе G1/S определены как пик с более низкой интенсивностью флуоресценции Hoechst 33342. Репрезентативный результат и ворота сортировки показаны на рисунке 2A.
5. После покрытия инкубировать 96-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.

3. Суб клонирование трансфицированных фазК

1. Через три дня после одноклеточного покрытия колонии можно наблюдать в нескольких колодцах 96-х пластин под микроскопом. Отметь колодцы, в которых растут только одиночные колонии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, одиночные колонии наблюдались в 20%-40% скважин 96-колодцев.
2. На 4-й день после одноклеточного покрытия замените половину среды новой средой haESC в скважинах на одиночные колонии.
3. За день до прохода (на 4-й или 5-й день после одноклеточного покрытия) пластины облучали МЭФ на пластинах с желатиновым покрытием 96-колодец при плотности 4 × 10⁴ клетки/см² в среде МЭФ. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
4. После 5 или 6 дней одноклеточного покрытия, выберите колодцы из 96-колодцев, содержащих одиночные колонии диаметром более 150 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно выбрать около 100 скважин для создания линии phaESC с целевыми удалениями DMR.
5. Аспирировать среду в выбранных скважинах и добавить 30 йл трипсина. Инкубировать 96-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в 5% CO_{2 атмосферу} в течение 5 мин. Затем добавьте 30 йл буфера для мытья к каждому хорошо, чтобы утолить трипсин.
6. Добавьте 140 МКЛ среды haESC в каждую колодец, и пипетку несколько раз, чтобы получить одиночные клетки.
7. Аспирировать носитель MEF из скважин 96-колодцев, подготовленных в шаге 3.3.
8. Перенесите фазы из каждой системы из шага 3.6 в свежую колодец новой пластины из 96-х из шага 3.7.
9. Инкубировать 96-хорошо пластин, содержащих подклионы фазк при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
10. На следующий день, аспирировать все среды из каждой хорошо, и добавить 120 йл новой среды haESC. Инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
11. За день до того, как клетки станут стеченными для прохода, пластина облученных МЭФ на желатин покрытием 24-хорошо пластин при плотности 4 × 10^{4 клеток} /^{см 2} в среде MEF. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
12. Когда фазы стали сотки для прохода, аспирировать среды и добавить 30 йл трипсина. Инкубировать 96-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
13. Добавьте 90 мкл буфера мытья в каждый колодец, чтобы утолить трипсин. Pipette несколько раз, чтобы получить одиночные клетки.
14. Аспирировать среду MEF из скважин 24-колодцев из шага 3.11 и добавить 600 МКЛ свежей среды haESC.
15. Передача 60 МКЛ суспензии подклалонов phaESC из каждой хорошо в шаге 3.13 в новую колодец 24-хорошо пластин из шага 3.14. Держите оставшуюся суспензию каждого подклана фазеса для извлечения ДНК и генотипирования в шаге 4.
16. Инкубировать 24-хорошо пластин с подклалонами phaESC при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
17. За день до того, как клеточные культуры достигнут плотности для прохожего, пластины облученных MEFs на желатин покрытием 6-хорошо пластин при плотности 4 × 10⁴ клеток /^{см 2} в среде MEF. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
18. Когда фазы становятся достаточно стеченными для прохода, аспирировать среды и добавить 250 йл трипсина. Инкубировать 24-хорошо пластин при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После генотипирования в шаге 4.9, только линии phaESC с удалениями как H19-DMR, так и IG-DMRдолжны быть протечены.
19. Добавьте 750 МКЛ буфера мытья в каждый колодец, чтобы утолить трипсин. Pipette несколько раз, чтобы получить одну подвеску ячейки. Перенесите подвеску клетки в трубку 15 мл.
20. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин, удалить супернатант, и повторно клеточной гранулы в 2 мл гаЭСК среды.
21. Аспирировать среду MEF из скважин 6-колодных пластин от шага 3.17. Перенесите подвеску phaESC с каждой трубки из шага 3.20 в новую колодец. Держите пластины на уровне 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
22. Расширьте клеточные клоны, повторяя шаги от 3,17 до 3,21 и увеличивая размер пластины и объемы трипсина, буфера стирки и среды haESC. Подготовьте колбу T25 для каждой суб клонированной линии PHAESC MEF для шага 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем заморозить алицит каждой суб клонированной линии phaESC в 300 МКЛ замораживания среды и поддержания криостока в жидком хранении азота, прежде чем приступить к шагу 5.

4. Первый генотипирование суб клонированных линий phaESC с ПОМОЩЬю МЭФ

1. Чтобы извлечь геномную ДНК из оставшейся клеточной суспензии из шага 3.15, добавьте 200 МКЛ буфера лиза к каждой колодец из 96-хорошо пластин. Перенесите подвеску клетки в трубку 1,5 мл. Промыть каждый колодец с дополнительным 200 йл буфера лиза, чтобы восстановить все оставшиеся клетки и собирать в той же трубке 1,5 мл.
2. Инкубировать трубку 1,5 мл при 55 градусов по Цельсию в течение 3 ч с смешиванием.
3. После инкубации добавьте 460 МКЛ изопропанола в каждую трубку 1,5 мл и аккуратно перемешайте до тех пор, пока не станет виден осадок ДНК.
4. Центрифуга труб при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Вымойте гранулы ДНК 200 л 70% этанола.
5. Центрифуга труб при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант.
6. Высушите трубки в воздухе в течение 10 минут, а затем повторно потешите ДНК в 20 мл воды.
7. Выполняйте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с помощью термостабийной полимеразы ДНК в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Грунтовые пары для ПЦР перечислены в таблице 2 и используются следующим образом: H19-DMR-P1 и P3 (407 bp для удаленного H19-DMR); H19-DMR-P2 и P3 (623 bp для wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 и P3 (319 bp для удаленного IG-DMR); IG-DMR-P2 и P3 (492 bp для wildtype IG-DMR). Температурный профиль ПЦР для всех праймерных пар таков: 30 с 98 градусов по Цельсию, 35 х (10 с 98 градусов по Цельсию, 20 с 56 градусов по Цельсию, 30 с 72 градусов по Цельсию), 5 мин 72 градусов по Цельсию. Длина усиленных фрагментов ДНК для удалений H19-DMR и IG-DMR показывает некоторые изменения из-за неомологичный конец присоединения, связанные с CRISPR / Cas9-опосредованного редактирования. Фазы были отрастили с MEFs, которые содержат wildtype H19-DMRи ДНКIG-DMR. Таким образом, грунтовое пары H19-DMR-P2/P3 и IG-DMR-P2/P3, которые усиливают фрагменты ДНК дикого типа, не являются информативными. Тем не менее, эти грунтовки пары включены в качестве элементов управления и должны дать полосу во всех реакциях.
8. Проанализируйте фрагменты ПЦР с помощью электрофорезов агарозного геля. Обратитесь к опубликованному протоколу о подробной процедуре электрофореза¹⁶.
9. Определите клеточные линии с удалением как H19-DMR, так и IG-DMR. Репрезентативное изображение электрофорезы показано на рисунке 2B.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае, восемь клеточных линий с удалениями как H19-DMR и IG-DMR были определены среди 135 суб-клонированных линий phaESC.

5. Очистка гаплоидных клеток суб клонированных линий phaESC

1. Когда суб клонированные культуры phaESC в колбах T25 от шага 3.22 становятся достаточно плотными для прохода, аспирируют среду и добавляют 1,5 мл трипсина. Инкубировать колбу при 37 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Затем добавьте 4,5 мл буфера стирки и пипетки несколько раз, чтобы получить одноклеточную подвеску.
2. Передача каждой клеточной суспензии в трубку 15 мл и центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно посовестите клеточные гранулы в 400 МКЛ буфера обслуживания haESC, дополненного 15 мкг/мл Hoechst 33342.
3. Инкубировать подвески клетки при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут. После инкубации перенесите подвески клетки в трубку 5 мл через крышку клеточного ситечко. Промыть крышку ситечко клетки с дополнительным 400 йл буфера обслуживания haESC, и собрать оставшиеся клетки в той же трубке 5 мл. Держите трубку при 4 градусов по Цельсию, пока не будет готова к сортировке.
4. Настройка цитометра потока с соплом 100 мкм в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 может быть обнаружен путем возбуждения на 405 нм. Здесь для обнаружения Hoechst 33342 используется УФ-лазер 355 нм.
5. Настройка клеточной подвески (от шага 5.3) и новой трубки 15 мл, содержащей 2 мл буфера обслуживания haESC для сбора отсортированных клеток в цитометре потока.
6. Начните анализ и установите ворота сортировки для сбора гаплоидных клеток в фазе G1/S. Обратитесь к гистограмме на рисунке 2A для определения фазовой фазы G1/S фазы PHAESC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые суб-клонированные линии phaESC не могут содержать гаплоидных клеток из-за полной диплоидизации или ошибочного покрытия диплоидных клеток в шаге 2. Если гаплоидные клетки не наблюдаются в фазе G1/S, перейти к другому образцу без сортировки. В нашем случае 5 клеточных линий содержали гаплоидные клетки и 3 клеточные линии содержали только диплоидные клетки из 8 суб клонированных линий фазЕСК.
7. После сортировки клеток добавьте 5 мл буфера для мытья вдоль стенки трубки сбора 15 мл. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант.
8. Выберите тарелку подходящего размера для культивирования в зависимости от количества отсортированных ячеек. Используйте один колодец из 96-хорошо пластины, 24-хорошо пластины, и 12-хорошо пластины культуры 1000-40000 клеток, 40000-200000 клеток, и 200000-400000 клеток, соответственно. Переусердуйте клеточные гранулы в 120 МКЛ, 600 йл и 1,2 мл гаЕСК среды, соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плита клеток при высокой плотности, потому что низкое слияние может привести к гибели клеток после сортировки. С этого момента, phaESCs культурированы на желатин покрытием скважин без MEFs для облегчения генотипирования в шаге 6 и последующее применение для интрацитоплазмической инъекции от шага 9.
9. После переноса клеточной суспензии в колодец с желатиновым покрытием соответствующего размера, инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
10. Продолжить расширение культур phaESC, повторяя шаги 3,18 до 3,21 с увеличением размеров пластин и увеличение объемов трипсина, мыть буфер, и haESC среды. Клетки обуасваются на колодцах с желатиновым покрытием без МЕФ.
11. Для каждой суб клонированной линии phaESC подготовьем культуру в одном колодец из 24-хорошо пластины и один колодец 6-хорошо пластины для шагов 6 и 9, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клетки каждой суб клонированной линии phaESC должны быть заморожены в 300 МКЛ замораживания среды в качестве криостока в резервуаре для хранения жидкого азота, прежде чем приступить к шагу 9.

6. Второй генотипирование суб клонированных линий phaESC без MEFs

ПРИМЕЧАНИЕ: Второй раунд генотипирования выполняется, чтобы подтвердить, что суб-клонированные линии phaESC обладают удалениями как H19- и IG-DMRs, и что аллели дикого типа отсутствуют после удаления MEFs.

1. Подтвердите под микроскопом, что культуры в колодцах 24-колодцев из шага 5.11 свободны от МЕФ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если МЕФ наблюдаются, необходимо продолжать передавать культуры до тех пор, пока МЕФ не исчезнут, чтобы избежать загрязнения ПЦР ДНК дикого типа из МЕФ.
2. Аспирировать среду из стеченных культур и добавить 400 МКЛ буфера лиза на колодец 24-хорошо пластины. После трубки несколько раз, перенесите подвеску клетки в трубку 1,5 мл.
3. Инкубировать трубку 1,5 мл при 55 градусов по Цельсию в течение 3 ч с смешиванием.
4. После инкубации добавьте 400 МКЛ изопропанола в трубку 1,5 мл и аккуратно перемешайте до тех пор, пока не станет виден осадок ДНК.
5. Центрифуга трубки при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант. Вымойте гранулы ДНК 200 л 70% этанола.
6. Центрифуга трубки при ≥ 10000 х г в течение 5 мин и удалить супернатант.
7. Высушите трубку в воздухе в течение 10 минут, а затем повторно почистите ДНК в 50 мкл воды.
8. Выполните генотипирование ПЦР следующим шагом 4.7 и гель электрофорез в шаге 4.8 для идентификации клеточных линий, которые обладают удалениями как H19- и IG-DMRsи свободны от аллелей дикого типа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение типичного второго генотипирования анализа показано на рисунке 2B для справки. В нашем случае все 5 клеточных линий, выбранных после очистки гаплоидных клеток (шаг 5), были свободны от аллелей дикого типа и обладали только аллелей удаления H19- и IG-DMRs.
9. Используйте суб клонированные линии phaESC, выбранные после этого второго генотипирования в качестве линий DKO-phaESC.

7. Суперовуляция мышей

1. Для производства MII oocytes, инициировать суперовуляцию путем внутриперитонеальной инъекции 5 МЕ беременной кобылы сыворотки гонадотропина (PMSG) раствор в каждой B6D2F1 женской мыши (4-5 недель) 63-65 ч до сбора яйцеклеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм мыши B6D2F1 рекомендуется для этого протокола, потому что Ооциты B6D2F1 хорошо переносят интрацитоплазмическую инъекцию и показывают высокий потенциал развития^{после процедуры 17}.
2. Сорок восемь часов после инъекции PMSG, интраперитонально вводить 5 МЕ человека хорионического раствора гонадотропина в каждой мыши.

8. Сбор яйцеклеток

1. Подготовь 4-хорошо пластины, содержащие 700 йл гиалуронидазы среды в одной скважине и 700 мл M2 среды в оставшихся 3 скважин. Кроме того, приготовьте 6-сантиметровое блюдо с 7 мл среды M2 и блюдом по центру с 900 мл среды M16. Предварительно разогреть тарелку и блюда при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
2. В день интрацитоплазмической инъекции, усыплять суперовулированных женщин (от шага 7,2) либо вывих шейки матки или CO_{2 ингаляции} около 8 утра. Рассекают яйцеклетки с помощью пинцета и ножниц. Поместите яйцеклетки в 6-сантиметровое блюдо со средой M2.
3. Отпустите комплексы кумуляционных яйцеклеток (КОК), разрывая ампулу овидуков иглой 30 Г. Передача COCs в предварительно разогретой среде гиалуронидазы и держать при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
4. Через 2-3 мин, собирать ооциты без кумулятива с ртом пипетки и мыть ооциты 3 раза, передавая их в свежей среде M2 в других 3 скважин 4-хорошо пластины.
5. Соберите метафазы II (MII) ооцитов, которые обладают первыми полярными телами, в центре хорошо блюдо с M16 среды и держать пластину на 37 градусов по Цельсию в 5% CO_{2 атмосферу до} использования для интрацитоплазмы инъекции в шаге 12.

9. Лечение и сбор DKO-фаЭСКО

1. Подготовь культуру DKO-phaESC в колодец из 6-колодец пластины без MEFs на 60-80% слияния за день до интрацитоплазмической инъекции (от шага 5.11).
2. Чтобы вызвать арест клеточного цикла в M-фазе, аспирировать средний полностью и добавить 2 мл гЕСК среды, содержащей 0,05 мг/мл демекольцина.
3. После 8 ч демекольцина лечения, аспирировать среды и добавить 800 йл трипсина.
4. Инкубировать пластину при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO₂ в течение 5 минут, затем добавить 2 мл буфера мытья, чтобы утолить трипсин, и пипетку несколько раз, чтобы получить одноклеточную подвеску.
5. Перенесите подвеску клетки в трубку 15 мл. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин и удалить супернатант.
6. Переусердуйте клеточные гранулы в 400 МКЛ буфера обслуживания haESC, содержащего 15 мкг/мл Hoechst 33342.
7. Инкубировать подвеску клетки при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO₂ в течение 15 минут. После инкубации перенесите подвеску клетки в трубку 5 мл через крышку клеточного ситечко и держите трубку на уровне 4 градусов по Цельсию до сортировки клеток в шаге 10.

10. Очистка М-фазы арестованных DKO-phaESCs

1. Настройка цитометра потока с соплом 100 мкм в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst 33342 может быть обнаружен путем возбуждения на 405 нм. Здесь для обнаружения Hoechst 33342 используется УФ-лазер 355 нм.
2. Настройка M-фазы арестованных DKO-phaESCs от шага 9.7 и начать анализ. Выберите подходящие ворота сортировки для сбора гаплоидных клеток M-фазы (2n) из образца, обработанного демекольцином.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После лечения демекольцином, 2 популяции клеток, как ожидается, соответствующие гаплоидных и диплоидных M-фазы арестованных клеток, как показано на рисунке 3B. Арест клеточного цикла после лечения демекольцином завершен, таким образом, не наблюдается пик гаплоидной ДНК 1n. Это важно, поскольку гаплоидные M-фазные клетки и клетки диплоидной G1 обладают одинаковым содержанием ДНК (2n) и производят перекрывающиеся пики.
3. Настройка 15 мл трубки, содержащей 2 мл буфера обслуживания haESC для сбора отсортированных клеток в цитометре потока. Начните сортировку клеток.
4. После сортировки клеток добавьте 5 мл буфера стирки вдоль стенки коллектора. Центрифуга трубки на 160 х г в течение 5 мин и удалить супернатант.
5. Переусердствуй с клетками в соответствующем объеме буфера обслуживания haESC, чтобы получить окончательную концентрацию 5 х 10⁵ клеток/мл.
6. Перенесите подвеску клетки в трубку 1,5 мл. Держите трубку на льду до готовности к интрацитоплазмической инъекции в шаге 12.

11. Подготовка труб холдинга и микроинъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения интрацитоплазмической инъекции (шаг 12) требуется несколько пипеток холдинга и микроинъекции(рисунок 4A). Эти пипетки можно приобрести по индивидуальному заказу у коммерческого поставщика или сделать из подходящих стеклянных капилляров с помощью шкива микропипта и микрофорза.

1. Потяните борозиликатные стеклянные капилляры на шкив микропипта. Чтобы вытащить борозиликатные стеклянные капилляры без нити (0,78 х 1,00 х 80 мм) для пылающего горизонтального шкива(таблицаматериалов) в качестве эталона, но будет отличаться для других инструментов и типов стеклянных капилляров: Heat 510 (Ramp test 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 и Pressure 200 для проведения пипеток; Тепло 510 (Ramp test 480), Pull 90, Скорость 140, Время 125 и Давление 200 для микроинъекции пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные параметры должны быть определены индивидуально, потому что несколько факторов, включая влажность, модель шкив микропипта и много стеклянных капилляров может повлиять на форму инъекций пипетки. Удлиненная форма с постепенным конусом должна быть направлена на.
2. Подготовка проведения пипеток
   1. Установите один вытащил капилляр подготовлен в шаге 11,1 к микрофорге. Поместите капилляр над стеклянной шариком на нить и опустите капилляр, чтобы установить контакт со стеклянной шариком при нагревании нити.
   2. Разбейте капилляр, выключив отопление и отсоединив от стеклянного шарика так, чтобы его внешний диаметр составляет 60–100 мкм.
   3. Распоистите кончик капилляра горизонтально, чтобы лицом к стеклянной шарику на нити.
   4. Нагрейте нить, чтобы позволить внутреннему диаметру кончика капилляров расплавиться до диаметра 10-20 мкм.
   5. Перемести капилляр так, чтобы стеклянный шарик позиции в точке 1 мм от капиллярного кончика без контакта. Нагрейте нить, чтобы капилляры согнуть под углом 20 градусов. Смонтировать капилляр, называют проведение пипетки, от микрофоржа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения размера капилляра, окулярная решетка предпочтительно установлена в микрофорге.
3. Приготовление микроинъекции пипеток
   1. Установите один вытащил капилляр подготовлен в шаге 11,1 к микрофорге. Поместите капилляр над стеклянной шариком на нить и опустите капилляр, чтобы установить контакт со стеклянной шариком при нагревании нити.
   2. Разбейте капилляр, выключив отопление и отсоединив от стеклянной шарика в положении, что его внешний диаметр составляет 6 мкм.
   3. Перемести капилляр так, чтобы стеклянный шарик позиции в точке 1 мм от капиллярного кончика без контакта. Нагрейте нить, чтобы капилляры согнуть вверх под углом 20 градусов. Смонтировать микроинъекцию пипетки из микрофорги и хранить в безопасной коробке для более длительного использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: микроинъекции пипетки готовятся со следующими спецификациями: внешний диаметр, 6 мкм; внутренний диаметр, 4,5-5 мкм; угол наклона, 20 градусов. Определение оптимальной конструкции микроинъекции пипетки имеет важное значение для успеха интрацитоплазмической инъекции. Слишком большой внутренний диаметр может предотвратить разрыв плазменной мембраны донора DKO-phESCs (см. раздел обсуждения). Если внутренний диаметр слишком узкий, он может препятствовать гладкой трубе донора DKO-phESCs. Угол изгиба «lt; 30» предпочтительнее, так как высокий угол изгиба препятствует эффекту импульсов пьезо.

12. Интрацитоплазмическая инъекция DKO-фаЭСКО

1. Перед интрацитоплазмической инъекцией (от шага 12.2), подготовить раствор поливинилпирролидон (PVP), добавив 5 мл M2 среды в 50 мл трубки, содержащей 0,6 г PVP и агитации трубки на рокер при 4 градусов по Цельсию в течение 2 дней. После полного растворения PVP растворяется, раствор фильтруется и хранится при 4 градусах Цельсия.
2. В день интрацитоплазмической инъекции приготовьте блюдо в центре города с 900 МКЛ средней KSOM и предварительно разогреете блюдо при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO_2.
3. Приготовьте блюдо из микроманипуляции, выровняв капли 5 МКЛ раствора PVP и 20 МКЛ среды M2 на крышке 10-сантиметрового блюда, которое помещается вверх дном. Обложка капель с минеральным маслом, и поместите блюдо на стадии инъекционного микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое расположение микроманипуляции блюдо показано на рисунке 4B.
4. Установите удерживаемую пипету на микроманипулятор. Заполните микроинъекции пипетки с фторуглеродного масла с помощью микрозагрузчика отзыв, и установить его на piezo привода.
5. Погрузите микроинъекцию пипетки в каплю с PVP раствором и пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы покрыть стекло PVP и сделать его менее липким. Загрузите небольшой объем PVP раствора в микроинъекции пипетки, и переместить пипетку в каплю со средним M2.
6. Погрузите удерживаемую пипетут в среду M2 и сосредоточьтесь на пипетки в нижней части капли.
7. Передача примерно 2 мл подвески DKO-phaESC из шага 10,6 в среднее падение M2.
8. Передача 10 MII oocytes от шага 8.5 в том же M2 средней капли с помощью рот пипетки.
9. Для инъекции поверните яйцеклетку в средней капле M2 так, чтобы перивильное пространство столкнулось с микроинъекцией пипетки, а пластина MII не расположена на пути микроинъекции пипетки(рисунок 4A). Держите яйцеклетки, применяя отрицательное давление через удерживающих пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина MII визуально идентифицируется как выступ ооплазмы, которая называется "горб" и часто находится рядом с первым полярным телом. Пластина MII содержит мейотический шпиндель с прикрепленными хромосомами. Прикосновение к микроинъекции пипетки и пластины MII следует избегать, как механическое повреждение шпинделя и хромосом может нарушить развитие эмбриона.
10. Загрузите один DKO-phaESC в кончик микроинъекции пипетки, применяя мягкое отрицательное давление. Разрыв плазменной мембраны DKO-phaESC путем трубопроводов, чтобы избежать инъекции нетронутой DKO-phaESC(рисунок 3C; см. обсуждение).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если плазменная мембрана DKO-phaESC не разрывается путем трубопроводов, отбросьте DKO-phaESC и загрузите другой DKO-phaESC.
11. Поместите микроинъекцию пипетки в контакт с zona pellucida яйцеклетки, и применить небольшое количество отрицательного давления в микроинъекции пипетки.
12. Нанесите пьезо импульсы (интенсивность, 20; частота, 4), чтобы прорваться через зону, толкая кончик пипетки микроинъекции к перивителлиновому пространству. Подтвердите, что пластина MII, содержащая шпиндель и хромосомы, не находится на пути микроинъекции пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически настроить настройки на самые низкие импульсы пьезо для бурения через зону, чтобы свести к минимуму возможность повреждения oolemma.
13. Отбросьте фрагмент zona pellucida из микроинъекции пипетки и распоимите DKO-phaESC на краю пипетки.
14. Проникают в яйцеклетку с помощью микроинъекции пипетки так, что oolemma достигает противоположной стороны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к пластине MII, чтобы предотвратить повреждение шпинделя и хромосом.
15. Нанесите пульс пьезо (интенсивность, 6; частота, 1), чтобы пробить oolemma. Убедитесь, что oolemma расслабляется вдоль вала микроинъекции пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмпирически определить самый низкий параметр пульса пьезо для нарушения oolemma свести к минимуму ущерб яйцеклетки.
16. Ввимите DKO-phaESC с минимальным объемом среды в ооплазму и свяжете микроинъекцию пипетки плавно из яйцеклетки.
17. Освободите вводимый яйцеклетку из удерживающих пипеток и поместите ее на сторону микропропа для более поздней коллекции.
18. Повторите процедуру инъекции с ступеней 12,9 до 12,17 для других яйцеклеток MII в средней капле M2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте хранения яйцеклеток из инкубатора в течение более 20 минут. По нашему опыту, партия из 10 яйцеклеток можно манипулировать комфортно в течение 15 минут после соответствующей подготовки.
19. Перенесите партию инъекционных яйцеклеток из среднего падения M2 в предварительно разогретое блюдо в центре с помощью среды KSOM.
20. Держите блюдо в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
21. Повторите манипуляции ооцитов из шагов 12,5 и 12,20 с дополнительными группами Ооцитов МИИ, чтобы получить достаточное количество инъекционных яйцеклеток.

13. Активация построенных полу клонированных эмбрионов

1. Приготовьте два блюда из центра и 900 йл каждый из среды KSOM и среды активации. Подготовь 4-хорошо пластины с 700 йл KSOM среды в каждой хорошо. Предварительно разогреть посуду и тарелку при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO_2.
2. После 1 ч в среде KSOM, передача вводили яйцеклетки из шага 12,21 в предварительно разогретый центр хорошо блюдо с активацией среды.
3. Держите блюдо в течение 6 ч при 37 градусов по Цельсию в атмосфере 5% CO₂ для активации.
4. После активации, наблюдать некоторые полу-клонированных эмбрионов образуют три полярных тела, которые являются первым и вторым полярных тел яйцеклетки, и псевдо полярного тела из DKO-phaESC (Рисунок 3E).
5. Вымойте эмбрионы 3 раза, переведя их в новые скважины со средой KSOM в 4-хорошо пластины.
6. Передача эмбрионов в центр хорошо блюдо с KSOM среды, и держать блюдо при 37 градусов по Цельсию в 5% CO_{2 атмосферу} для дальнейшего развития.

14. Разработка построенных полу клонированных эмбрионов

1. После 1 дня культуры в среде KSOM от шага 13.6, несколько полу-клонированных зародышей достигают 2-клеточной стадии(рисунок 5A).
2. Для дальнейшего развития предимплантационной эмбрионов в пробирке продолжайте культивирование полу клонированных эмбрионов в среде KSOM при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% CO_2. Перенесите полу клонированные эмбрионы в свежую среду KSOM на второй день. На 4-й день несколько эмбрионов достигнут стадии бластоцистки(рисунок 5A).
3. Для производных полу клонированных мышей, перенос 2-клеточных эмбрионов из шага 14.1 в яйцеклетки псевдо-беременных самок-реципиентов. Определите псевдо-беременных самок путем спаривания с вазэктомизированных самцов за день до переноса эмбриона и выберите их на основе наличия четко видимой вилки утром дня для переноса эмбриона (0,5 дней после койтума (dpc)). Около 19.5 dpc, полный срок щенков, естественно, доставлены от женщин-получателей(рисунок 5B).

Результаты

Цель этого протокола заключается в применении haESCs в качестве замены спермы для получения полу клонированных эмбрионов и мышей. Для этого была создана и использована линия DKO-phaESC с трансгеном CAG-EGFP для внутрикитоплазмической инъекции в яйцеклетки МИИ. Чтобы получить подходящую линию phaESC с конфигурацией отцовского отпечатка, мы выполнили генную инженерию с помощью ядер Cas9. Гаплоидная линия ESC содержит гаплоидные и диплоидные клетки, которые возникают из-за присущей гаплоидной ЭСК для диплоидизации¹⁰. Набор гаплоидной хромосомы является необходимым условием для успешной замены генома спермы. Анализ содержания ДНК по цитометрии потока показывает распределение гаплоидных и диплоидных клеток на G0/G1-, S-, и G2/M-фазы(рисунок 2A).

Для создания линий DKO-phaESC линии wildtype phaESC были трансфицированы конструкциями piggyBac transposon для стабильного трансгенного выражения EGFP и плазмидами CRISPR/Cas9 для получения удалений H19- и IG-DMR. Чтобы исключить диплоидные ESCs и изолировать только гаплоидных ESCs, выражающие EGFP, определенный вид ворот был определен(рисунок 2A). Одногаплоидные EGFP-положительные клетки затем покрывались в отдельные скважины из 96-колодцев для получения суб-клонов. Кормушки MEF использовались для повышения эффективности покрытия и выживания трансфицированных фазек. После расширения культур, первоначальный раунд генотипирования был проведен PCR для выявления суб-клонов, которые несут удаления обоих DMRs. После того, как фидеры MEF были удалены из культур, был проведен второй генотипирование, чтобы подтвердить отсутствие аллелей дикоготипа в H19- и IG-DMRs(рисунок 2B). Из в общей сложности 135 суб-клонов, мы получили 5 гаплоидных DKO-phESC линий, которые несли удаленные аллели и были свободны от аллелей дикоготипа как H19-DMR,так и IG-DMR.

CaG-EGFP трансген был введен в DKO-phaESCs для изучения их вклада в полу-клонированных эмбрионов путем визуализации зеленой флуоресценции под микроскопом(рисунок 3A). Для интрацитоплазмической инъекции, DKO-фазы были обработаны демиколцином, чтобы арестовать их в M-фазе. Таким образом, клеточный цикл DKO-фаеско был синхронизирован с циклом миИ-ооцитов. Анализ цитометрии потока показал 2 популяции, соответствующие фазе G2/M, арестованной гаплоидой (2n) и диплоидными клетками (4n) после лечения демекольцином(рисунок 3B). Отсутствие 1n гаплоидного пика указывает на то, что арест клеточного цикла был в значительной степени завершен. M-фазные гаплоидные ЭЦП затем сортируются и вводятся в яйцеклетки. Для этого один DKO-phaESC был загружен в микроинъекцию пипетки и введен в цитоплазму яйцеклетки МИИ(рисунок 3C). Плазменная мембрана DKO-phaESC была разорвана трубой в кончик микроинъекции пипетки.

После инъекции экспрессия EGFP редко обнаруживалась в построенных полу клонированных эмбрионах, так как цитоплазма DKO-фаэско рассеялась в большой цитоплазме яйцеклетки(рисунок 3D). В редких случаях в ооплазме можно наблюдать круглое пятно интенсивного выражения EGFP. Это наблюдение, вероятно, было вызвано непреднамеренной инъекцией нетронутых DKO-фаЭСКО. Неспособность разорвать мембрану клеток DKO-phaESC, вероятно, не совместима с дальнейшим развитием эмбриона и следует избегать. Через час после инъекции эмбрионы были активированы путем лечения хлоридом стронция^18. Через шесть часов после начала активации под микроскопом (рисунок 3E) наблюдалось до3 полярных тел. Эти полярные тела соответствуют первому и второму полярным телам яйцеклетки и псевдополярного тела из DKO-phaESC^7. Кроме того, два пронуклея наблюдались под дифференциальным интерференционным контрастным микроскопом, который напоминал пронуклеарную стадию зигот после нормального оплодотворения спермой.

Чтобы продемонстрировать компетентность в развитии, полу клонированные эмбрионы были выучались до стадии бластоцистки(рисунок 5A). Кроме того, полномасштабная мышь была получена после передачи полу клонированных 2-клеточных эмбрионов стадии в яйцеклетки женщины-получателя(рисунок 5B). Как и ожидалось, мышь, полученная из полу клонированного эмбриона, была самкой, так как ни яйцеклетки, ни фалешки, полученные из яйцеклеток, не имеют Y-хромосомы. Полу клонированная мышь была совершенно нормальной и производила здоровое потомство, когда спаривалась с самцом wildtype Swiss Webster. До сих пор полу клонированная мышь была жива более 600 дней без каких-либо видимых проблем со здоровьем.

Рисунок 1: Обзор применения DKO-фазы в качестве замены спермы. (A)Сроки процедур протокола. (B)Схема показывает шаги по созданию линий DKO-phaESC (шаги 1-6). (C)Схема показывает шаги по строительству полу клонированных эмбрионов путем интрацитоплазмической инъекции DKO-phaESC в яйцеклетку MII (шаги 7-14). Аббревиатуры: DKO и двойной нокаут; phaESC - партагогенетическая гаплоидная эмбриональная стволовая клетка; FACS - сортировка клеток с флуоресценцией; MEF - эмбриональный фибробласт мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Создание линий DKO-phaESC при посредничестве CRISPR/Cas9 при посредничестве удаления H19- и IG-DMR. (A) Цитометрический анализ фазек после трансфекции с пемпер-плазмидами для стабильного экспрессии EGFP и с 4 плазмидами CRISPR/Cas9. Не трансфектированная фаЭКС отображается в качестве контроля. Профиль ДНК (вверху) показывает распределение клеточного цикла гаплоидных и диплоидных клеток. Гаплоидные клетки G1/S-фазы, выражают EGFP, обозначены зелеными воротами (внизу, справа). (B) Генотипирование суб-клонов фазК, которые были выращены на МЭФ (первый генотипирование) и после удаления МЭФ (второй генотипирование). Суб клонированные линии phaESC 1, 2, 3 и 4 представляют клетки дикого типа, клетки с удалением H19-DMR, с удалениемIG-DMR, и с комбинированными удалениями H19и IG-DMR, соответственно. Линии DKO-phaESC 5-8 обладают как удалениями H19-DMR,так и IG-DMRи свободны от аллелей дикоготипа. Аббревиатуры: DKO и двойной нокаут; phaESC - партагогенетическая гаплоидная эмбриональная стволовая клетка; DMR - дифференциально метилированная область; MEF - эмбриональный фибробласт мыши; EGFP - улучшенный зеленый флуоресцентный белок; WT и дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Инъекция митотически арестованных DKO-фаЭСКО в яйцеклетки МИИ. a)Морфология культуры DKO-phaESC, которая несет трансген CAG-EGFP и удаления H19- и IG-DMRs; шкала бар No 50 мкм . (B) Представитель потока цитометрии анализ DKO-фаЭСКО после ареста с демеколцином для 8 ч. DKO-фазы без демекольцина лечения показаны в качестве контроля. (C)Морфология DKO-фазы в микроинъекции пипетки. Показан один нетронутый DKO-phaESC до (слева) и после (справа) разрыва плазменной мембраны путем пипетки; шкала бар 20 мкм. ( D )Построенныеэмбрионы на 1 ч после инъекции DKO-фаЭСКО в MII oocytes. Показано объединенное изображение флуоресценции EGFP и яркого поля. Черные наконечники стрел указывают на круглые пятна интенсивного выражения EGFP после инъекции нетронутых DKO-фаЭСКО, которых следует избегать; шкала бар 50 мкм. (E) Дифференциальное интерференционное контрастное изображение полу клонированных эмбрионов 6 ч после начала активации хлорида стронция показано. Белые наконечники стрел указывают на эмбрионы с 3 полярными телами, включая одно псевдополярное тело от инъекционной DKO-phaESC; шкала бар 50 мкм. Аббревиатуры: DKO и двойной нокаут; phaESC - партагогенетическая гаплоидная эмбриональная стволовая клетка; EGFP - улучшенный зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Схема установки интрацитоплазмической инъекции DKO-фаЭСКО в яйцеклетки. (A)Показано расположение инъекционной пипетки, удерживаемой пипетки и яйцеклетки в инъекционной камере. α, изгиб угол микроинъекции пипетки. (B)Расположение капель в микроманипуляции блюдо для интрацитоплазмической инъекции. Аббревиатуры: DKO и двойной нокаут; phaESC - партагогенетическая гаплоидная эмбриональная стволовая клетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Разработка полу клонированных эмбрионов. (A)Развитие преимплантации полу клонированных эмбрионов в пробирке. Выражение EGFP первоначально наблюдается в четырехклеточных эмбрионах на второй день после интрацитоплазмической инъекции. В 4-й день интенсивное выражение EGFP наблюдается в бластоцистах; шкала бар 100 мкм. (B) полу-клонированной мыши, полученные после 2-клеточного эмбриона передачи получателя женщины. В 74 dpp, полу-клонированная мышь (наконечник стрелы) доставила своих первых щенков (звездочка) естественным рождением после спаривания с диким типом швейцарского самца Вебстера. Полу клонированные эмбрионы и полу клонированная мышь, показанные на этой цифре, идентичны эмбрионам, зарегистрированным в Aizawa et al.^3. Аббревиатуры: EGFP - улучшенный зеленый флуоресцентный белок; .dpp, дни после части. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Решение для желатина
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
Вода	-	500 мл	-
желатин	-	1 г	0.2%
Гаплоидная эмбриональная стволовая клетка (HaESC) среднего
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
Н Дифф 227	-	10 мл	-
CHIR 99021	10 мМ	3 йл	3 МКМ
PD 0325901	10 мМ	1 йл	1 МКМ
ЛИФ	1 x 106 МЕ/мл	10 йл	1000 МЕ/мл
Пенициллин-Стрептомицин	100x	100 мкл	1x
Буфер обслуживания HaESC
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
HaESC средний	-	1 мл	-
Решение HEPES	1 М	20 мкл	20 мМ
Буфер мытья
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
DMEM / F-12	-	100 мл	-
Фракция BSA	7.5%	7,1 мл	0.5%
СРЕДА MEF
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
ДМЭМ	-	500 мл	-
FBS	-	56 мл	10%
β-Меркаптоэтанол	14.3 mol/L	3,9 МЛ	100 МКМ
Пенициллин-Стрептомицин	100x	5,6 мл	1x
Буфер лиза
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
Вода	-	8,25 мл	-
Трис-HCl (рН 8,5)	1 М	1 мл	100 мМ
Эдта	0,5 м	100 мкл	5 мМ
Решение SDS	10%	200 мкл	0.2%
NaCl	5 М	400 МКЛ	200 мМ
Протеиназа K	20 мг/мл	50 мкл	100 мкг/мл
Среда активации
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
КСОМ	-	1 мл	-
Хлорид стронция	1 М	5 мкл	5 мМ
EGTA	0,5 М, рН 8,0	4 йл	2 мМ
Решение PVP
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
M2 средний	-	5 мл	-
PVP	-	0,6 г	12%
Решение PMSG
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
PBS	-	450 МКЛ	-
ПМСГ	500 МЕ/мл	50 мкл	50 МЕ/мл
решение для ХГЧ
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
PBS	-	450 МКЛ	-
ХГЧ	500 МЕ/мл	50 мкл	50 МЕ/мл
Гиалуронидаза среднего
компонент	Концентрация запасов	Объем / вес	Окончательная концентрация
M2 средний	-	380 мкл	-
Гиалуронидаза	10 мг/мл	20 мкл	0,5 мг/мл
Аббревиатуры: LIF и ингибиторный фактор лейкемии; MEF - эмбриональный фибробласт мыши;
FBS - сыворотка крупного рогатого скота плода; DMEM - Модифицированный орлиный средний Dulbecco; BSA - бычий альбумин сыворотки;
ЭДТА - этилендиаминтетраатетическая кислота; SDS - додекилульфат натрия; ЭГТА - этилен-бис (оксиэтиленнитрило) тетраацетическая кислота;
PBS - фосфатный буферный солевой раствор; PVP - поливинилпирролидон; ХГЧ - хорионический гонадотропин человека;
ПМСГ и беременная кобыла сыворотки гонадотропин.

Таблица 1: Рецепт среды, буфера и решения.

имя	Последовательность (от 5' до 3')		приложение
H19-DMR-P1	GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG		Генотипирование
H19-DMR-P2	АГА TGG GGT CAT TCT TTT CC		Генотипирование
H19-DMR-P3	TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT		Генотипирование
IG-DMR-P1	TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG		Генотипирование
IG-DMR-P2	CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA		Генотипирование
IG-DMR-P3	АТА CGA TAC GGC AAC CAA CG		Генотипирование
H19-DMR-gRNA1-F	CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG		гРНК
H19-DMR-gRNA1-R	AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG		гРНК
H19-DMR-gRNA2-F	CAC CAG GTG АГА АКК АКТ GCT КЛЯП		гРНК
H19-DMR-gRNA2-R	AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT		гРНК
IG-DMR-gRNA1-F	CAC CCG TAC АГА GCT CCA TGG CAC		гРНК
IG-DMR-gRNA1-R	AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG		гРНК
IG-DMR-gRNA2-F	CAC CCT GCT ТЕГ AGG TAC TAC GCT		гРНК
IG-DMR-gRNA2-R	AAA CAG CGT AGT АКК TCT AAG CAG		гРНК

Таблица 2: Список олигонуклеотидов.

Обсуждение

Клонирование млекопитающих с помощью соматических клеток ядерной передачи (SCNT) был впервые в 1990-х^{годов 19,20,21}. Эти разработки последовали за исследованиями клонирования, проведенными 30 лет назад в^{земноводных 22}. Значительная задержка отражает сложность эмбриологии и геномного отпечатка у млекопитающих. Развитие млекопитающих SCNT является основой для применения haESC для замены спермы, которая подробно описана в этом протоколе.

Синхронизация клеточного цикла является важным фактором успеха SCNT^23. Это также имеет место для инъекций haESC в этом протоколе. Внедрение генома донора в реципиент требует, чтобы фазы клеточного цикла соответствовали, чтобы избежать хромосомных разрывов или анеуплоидов, которые бы сфабрикования эмбриона. Полу клонирование имеет дополнительную сложность, что два генома и цитопласт должны быть совместимы. Предыдущий доклад показал, что инъекция M-фазы арестованных андрогенетических гЕУ дали лучшие темпы развития полу клонированных эмбрионов, чем инъекция G1-фазы haESCs в яйцеклетки⁷. В настоящем докладе предлагается M-фаза в качестве подходящей точки синхронизации для полу клонирования. Соответственно, фазы были митотично арестованы в метафазе с демиколцином и введены в ооплазму ооцитов МИИ, которые естественным образом были арестованы в метафазе II мейоза. Важно отметить, что M-фазный арест может быть достигнут в мышиных ESCs с высокой эффективностью, обеспечивая отличную синхронизацию между циклами доноров и реципиентных клеток.

Во время митоза ядерная мембрана разрушается и образуется шпиндель, к которым прикрепляются реплицированные хромосомы. После инъекции M-фазы DKO-фазы, сестры хроматиды разделены на псевдополярное тело и^{зиготу 7} (рисунок 3E). Следовательно, один набор хромосом из DKO-phaESC вносит свой вклад в полу клонированный эмбрион. Очень важно, чтобы сестрины хроматиды хромосом DKO-phaESC могли быть правильно разделены после инъекции. Плазменная мембрана нетронутого DKO-phaESC предотвращает сегрегацию в псевдополярном теле. Мы действительно наблюдали редкие случаи, когда плазменная мембрана DKO-phaESCs не была разорвана, а эмбрионы выставлялись нетронутыми DKO-фазами в ооплазме после инъекции(рисунок 3D). Поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы удалить плазменную мембрану DKO-phaESCs путем трубопроводов. Во время инъекции, не менее важно, чтобы избежать нарушения мейотической шпиндель яйцеклетки, что может привести к хромосомной сегрегации дефектов и вызвать аневплоидию, а также.

У млекопитающих геномный отпечаток ограничивает применение фазек в качестве замены спермы. Партеногенетические гЕУ обладают материнской конфигурацией геномных отпечатков, в то время как сперматозоиды обладают отцовской конфигурацией. Таким образом, генерация полносрочных щенков не произошло после инъекции фаэской фазы дикого типа в качестве замены спермы. Чтобы преодолеть это ограничение, удаления IG- и H19-DMRs разработаны в phaESCs. Модификация отпечатаемого выражения на материнских локусах Igf2-H19 и Gtl2-Dlk1 достаточна для изменения конфигурации геномных отпечатков, позволяющих генерации полу клонированных мышей с частотой более 5,1% на основе перенесенных 2-клеточных эмбрионов. Эти наблюдения показывают, что ориентация на два отпечатанных гена переключает геном фазек в функциональную отцовскую конфигурацию, которая может заменить сперму у мышей. Тем не менее для этой стратегии необходима постоянная генетическая модификация фаЭКС. В качестве альтернативной стратегии можно рассматривать андрогенетический haESC. Андрогенетические гЕУ происходят из генома спермы и обладают отцовскими отпечатками. Там были сообщения о том, что дикий тип андрогенетических haESCs способствовали в качестве замены спермы для создания полный срок щенков на частоте между 1,3% и 1,9%^{переданных эмбрионов 4,7,24}. Полноценные щенки также были получены путем инъекций андрогенетических гЕУ с удалением IG- и H19-DMRs с частотой 20,2% перенесенных 2-клеточных эмбрионов²⁴. Повышение эффективности полу клонирования с использованием модифицированных андрогенетических гЕУ, вероятно, потому, что отпечатки могут стать нестабильными в культуре. Отпечатки дефектов исправляются генетическими удалениями критических DMRs.

Учитывая трудности в внедрении генетических модификаций непосредственно в геномы яйцеклеток или сперматозоидов, haESCs являются ценным инструментом для манипулирования родительских геномов отдельно. Использование haESCs в качестве замены спермы обеспечивает замечательное преимущество для редактирования генома в зародыше мыши. Недавнее исследование объединило РЕДАКТИРОВАНИЕ генома на основе CRISPR/Cas9 с применением гЕУ для характеристики отпечаток регионов, которые имеют решающее значение для эмбрионального^{развития 12}. В этом исследовании проанализирована роль Rasgrf1-DMR в сочетании с H19 -иIG-DMRs в развитии биматернальных мышей, и функция 7 различных DMRs в развитии бипатернальных мышей. Метод замены гЕУ на сперму лег в основу генетического скрининга подходов к выявлению ключевых аминокислот в белке DND1 при развитии зародышевых клеток и для выявления генов^{в развитии костей 24,25,26.} Исследования геномного отпечатка и генетического скрининга для выявления ключевых факторов эмбрионального развития являются значительными подходами к применению гЕУ в качестве гетических геномов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1,5 mLTube	Eppendorf	0030 125.150	haESC культура
15 мл Пробирка	Greiner Bio-One	188271
12-луночный планшет	Thermo Scientific	150628	планшет для культуры haESC
	Thermo Scientific	142475	для 6-луночной культуры haESC
	Thermo Scientific	140675	для культуры haESC
96-луночный планшет	Thermo Scientific	167008	культуре haESC &
beta;-меркаптоэтанол	Merck	M6250	haESC культура
BSA фракция	Gibco	15260-037	haESC культура
CHIR 99021	аксон	1386	haESC
культура демеколцина раствор	Merck	D1925	haESC культура
DMEM	Gibco	41965-039	haESC культура
DMEM / F-12	Gibco	11320-033	haESC культура
DR4 мышь	Лаборатория Джексона	3208	haESC культура
EDTA	Merck	E5134	haESC культура
FBS	biowest	S1810-500	haESC культура
Замораживающая среда	amsbio	11897	haESC культура
Желатин Merck		G1890	haESC культура
Hepes раствор	Gibco	15630-056	haESC культура
облученный MEF	Gibco	A34966	haESC культура
LIF (фактор ингибирования лейкемии)	(Домашний)	-	haESC культура
липофекция реагент	Invitrogen	11668019	культура
NDiff 227	Takara	Y40002	haESC культура
PD 0325901	Axon	1408	haESC культура
Pen Strep	Gibco	15140-122	haESC культура
piggyBac плазмида, несущая CAG-EGFP трансген	Addgene	#40973	haESC культура
свиньи Bac транспозаза плазмида	система Biosciences	PB210PA-1	haESC культура
pX330 плазмида	Addgene	#42230	haESC культура
pX458 плазмида	Addgene	#48138	haESC культура
Trypsin	Gibco	15090-046	haESC культура
ДНК-полимераза	Thermo Scientific	F549S	Генотипирование
dNTP Mix	Thermo Scientific	R0192	Генотипирование
этанола	Merck	100983	Генотипирование
Соляная кислота	Merck	100317	Генотипирование
изопропанол	Merck	109634	Генотипирование
Протеиназа K	Axon	A3830	Генотипирование
SDS	Merck	71729	Генотипирование
хлорида натрия	Merck	106404	Генотипирование
ThermoMixer	Epeendorf	5384000012	Генотипирование
Tris	Merck	T1503	Генотипирование
5 мл Пробирка	Falcon	352063	Проточная цитометрия
5 мл Пробирка с колпачком клеточного фильтра	Falcon	352235	Проточная цитометрия
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Проточная цитометрия
MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	Проточная цитометрия
1 мл шприц	Codan	62.1640	Суперовуляция
30-го калибра 1/2 дюймовая игла	Merck	Z192362-100EA	Суперовуляция
B6D2F1 мышь	Лаборатория Джексона	100006	Суперовуляция
hCG	MSD здоровье животных	49451	Суперовуляция
PBS	Gibco	10010015	Суперовуляция
PMSG	Avivasysbio	OPPA1037 5000 МЕ	Суперовуляция
10-см чашка	Thermo Scientific	150350	Манипуляция с эмбрионами
4-луночная пластина	Thermo Scientific	179830	Манипуляция с эмбрионами
50 мл пробирка	Greiner Bio-One	227261	Манипуляция с эмбрионами
6 см чашка	Thermo Scientific	150288	Манипуляция
Центрально-луночная чашка	Corning	3260	Манипуляция с эмбрионами
Цифровая качалка	Thermo Scientific	88880020	Манипуляция с эмбрионами
EGTA	AppliChem	A0878	Манипуляция с эмбрионами
Гиалуронидаза Merck		H4272	Манипуляция с эмбрионами
KSOM	Merck	MR-020P-5F	Манипуляция с эмбрионами
M16 средний	Merck	M7292	Манипуляция с эмбрионами
M2 средний	Merck	M7167	Манипуляция с эмбрионами
Минеральное масло	Merck	M8410	Манипуляция с эмбрионами
Стеклянный капилляр	Merck	P1049-1PAK	Манипуляция с эмбрионами
Стереомикроскоп	Nikon	SMZ745	Манипуляция с эмбрионами
Хлорид стронция	Merck	13909	Манипуляция с эмбрионами
5мл шприц	Codan	62.5607	Микроинъекция
Боросиликатное стекло каппилар	Научный продукт	GB100T-8P	Микроинъекция
CellTram 4r Масло	Eppendorf	5196000030	Микроинъекция
Фторинерт FC-770	Merck	F3556	Микроинъекция
Держатель пипетки	Биомедицинские		инструменты-Микроинъекция
Инвертированный микроскоп	Nikon	Eclipse Ti-U	Микроинъекция
	Narishige	MF-900	Микроинъекция
Микроинъекция пипетка	BioMedical		Instruments-Микроинъекция
Микролаодеры	наконечники Eppendorf	5252 956.003	Микроинъекция
Микроманипуляторы	Narishige	NT-88-V3	Микроинъекция
Микропипетка Пуллер	Sutter Instrument	P-1000	Микроинъекция
PiezoXpert	Eppendorf	5194000016	Микроинъекция
PVP (поливинилпирролидин)	Merck	PVP360	Микроинъекция
Шприцевой фильтр	SARSTEDT	83.1826.001	Микроинъекция