Методическая статья

CRISPR/Cas9 Редактирование гена C. elegans rbm-3.2 с использованием скринингового маркера dpy-10 Co-CRISPR и собранных рибонуклеопротеиновых комплексов.

DOI:

10.3791/62001

⸱

11 декабря 2020 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Tulsa

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью этого протокола является обеспечение бесшовного редактирования генома C. elegans в формате CRISPR/Cas9 с использованием собранных рибонуклеопротеиновых комплексов и маркера dpy-10 co-CRISPR для скрининга. Этот протокол может быть использован для создания различных генетических модификаций у C. elegans, включая вставки, делеции, замены генов и замены кодонов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактериальная система Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) /Streptococcus pyogenes CRISPR-ассоциированный белок (Cas) была использована исследователями для изучения важных биологически значимых проблем. Непревзойденная сила метода редактирования генома CRISPR / Cas позволяет исследователям точно редактировать любой локус по своему выбору, тем самым способствуя более глубокому пониманию функции генов. Несколько методов редактирования генома C. elegans с помощью CRISPR/Cas9 были описаны ранее. Здесь мы обсуждаем и демонстрируем метод, который использует собранные in vitro рибонуклеопротеиновые комплексы и маркер dpy-10 co-CRISPR для скрининга. В частности, в этой статье мы рассмотрим пошаговый процесс введения преждевременных стоп-кодонов в ген C. elegans rbm-3.2 путем гомологического репарации с использованием этого метода редактирования CRISPR / Cas9. Этот относительно простой метод редактирования может быть использован для изучения функции любого гена, представляющий интерес, и позволяет генерацию гомозиготно отредактированных C. elegans путем редактирования CRISPR / Cas9 менее чем за две недели.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Технология Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) / Streptococcus pyogenes CRISPR-ассоциированный белок (Cas) обеспечивает эффективное целенаправленное редактирование генома в широком спектре организмов1,2,3,4. Система CRISPR была впервые обнаружена как часть прокариотического противовирусного иммунного ответа5,6,7. Система CRISPR типа II использует эндонуклеазу, такую как Cas9, трансактивирующую РНК (тракрРНК) и короткую, специфическую для ДНК-мишени 20-нуклеотидную длиннонаправленную CRISPR-РНК (crРНК) для распознавания «NGG» протоспейсера смежный мотив (PAM) и совершения двухцепочечного разрыва в целевой ДНК5,6,7,8,9,10,11,12. Этот двухцепочечный разрыв распознается как поражение клеточным механизмом восстановления ДНК. Следовательно, сгенерированный двухцепочечный разрыв может быть восстановлен одним из двух путей- i) Немумологичным конечным соединением (NHEJ) или ii) Гомологически направленным восстановлением (HDR)13. NHEJ часто подвержен ошибкам, и поэтому, когда этот путь используется для восстановления двухцепочечного разрыва в целевой ДНК, он часто вызывает инактивирующие мутации (вставки, делеции) в интересуемом гене. С другой стороны, поставляя экзогенный шаблон восстановления с гомологией по обе стороны от двухцепочечного разрыва, механизм восстановления клеточной ДНК может быть направлен на использование HDR для восстановления разрыва13. Таким образом, метод HDR позволяет точно редактировать любой интересующие локусы.

Различные протоколы редактирования генов CRISPR/Cas9 были описаны для C. elegans14,15,16,17,18,19,20. Наиболее часто используемые методы редактирования CRISPR/Cas9 в C. elegans включают как протоколы на основе клонирования, так и протоколы без клонирования для создания шаблонов восстановления для редактирования CRISPR/Cas914,15,16,17,18,19,20. В этом протоколе подробно обсуждается протокол редактирования CRISPR/Cas9 без клонирования, основанный на использовании dpy-10 в качестве маркера co-CRISPR для скрининга. До сих пор единственный подробный C. elegans-ориентированныйна CRISPR / Cas9 видеопротокол, который существует, использует флуоресцентный маркер для скрининга21. Однако использование флуоресцентного маркера для скрининга требует доступа к флуоресцентному микроскопу, доступ к которому многие лаборатории в небольших учреждениях бакалавриата (PUI) могут найти труднодоступным. Отрадно отметить, что положительные корреляционные результаты были получены в предыдущих исследованиях между червями, несущих флуоресцентные маркеры, и наличием ред.21,22. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования для определения общей эффективности метода скрининга на основе флуоресценции для редактирования широкого спектра локусов с различными направляющих РНК и шаблонами восстановления. Наконец, поскольку плазмиды, кодирующие эти флуоресцентные маркеры, образуют внехромосомные массивы, из этих массивов часто производится переменная флуоресценция, что может затруднить идентификацию положительных результатов23. Таким образом, хотя метод скрининга на основе флуоресценции может быть полезен для принятия, вышеупомянутые проблемы могут ограничивать его применимость.

Использование маркера co-CRISPR, который производит видимый фенотип, значительно уменьшает количество потомства, которое необходимо провести скрининг, чтобы найти положительно отредактированного червя23,24,25,26,27,28. Важно отметить, что фенотипы, которые производятся этими маркерами, могут быть легко обнаружены под простым рассекающим микроскопом23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Маркер dpy-10 co-CRISPR является одним из наиболее характеризуемых и широко используемых маркеров co-CRISPR для выполнения редактирования генома C. elegans CRISPR / Cas924,27. Поэтому в данной статье будет рассмотрен способ выполнения редактирования CRISPR/Cas9 у C. elegans с использованием прямой доставки рибонуклеопротеиновых комплексов с dpy-10 в качестве ко-CRISPR-маркера27,35. В этом способе подготовленная редукционная инъекционная смесь для редактирования состоит из хорошо охарактеризованная dpy-10 crRNA и dpy-10 репарации шаблона для опосредования генерации наблюдаемого доминантного фенотипа «ролика» (Rol), который присваивается известной гетерозиготной мутацией dpy-10(cn64) в гене dpy-10 24,27,29. При наличии в гомозиготном состоянии мутация dpy-10(cn64) вызывает фенотип демпинга (Dpy), который производит более коротких и стуковых червей24,29. Фенотип Rol опосредован точной вставкой совместно поставляемого шаблона восстановления dpy-10 в одну копию гена dpy-10 с помощью HDR-опосредованного редактирования CRISPR/Cas9. Таким образом, появление Rol C. elegans указывает на успешную инъекцию, а также на успешное HDR-опосредованное событие редактирования в клетках введенного червя. Поскольку crRNA и шаблон репарации интересуемого гена-мишени находятся в одной и той же инъекционной смеси с шаблоном репарации dpy-10 crRNA и dpy-10, существует большая вероятность того, что идентифицированные черви Rol также были одновременно отредактированы в интересуемом гене-мишени. Следовательно, эти черви Rol затем проверяются на редактирование, представляющий интерес, с помощью таких методов, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) (для правок более 50 bp) или ПЦР с последующим ограничением пищеварения (для правок менее 50 bp).

Преимуществами использования этого метода для редактирования генома являются: i) редактирование CRISPR может быть сгенерировано с относительно высокой эффективностью (от 2% до 70%) с использованием этого метода27; ii) шаблоны ремонта и направляющие РНК, которые используются в данном методе, не предполагают клонирования, тем самым сокращая время, необходимое для их генерации; iii) путем сборки рибонуклеопротеиновых комплексов in vitroконцентрации собранных монтажных комплексов могут поддерживаться относительно постоянными, тем самым улучшая воспроизводимость; iv) было показано, что некоторые направляющие РНК, которые не генерируют изменения при экспрессии из плазмид, работают для редактирования генома CRISPR/Cas9 при поставке в виде транскрибированных crRNAs27 in vitro; v) включение маркера dpy-10 co-CRISPR позволяет легко проводить скрининг с помощью рассекающего микроскопа и уменьшает количество потомства, которое необходимо провести скрининг для нахождения положительных результатов24,27; и vi) секвенирование ДНК проверенных гомозиготно-отредактированных линий червей может быть получено этим методом в течение пары недель19,27.

Отличные главы книги, относящиеся ко многим различным методам CRISPR C. elegans, были опубликованы14,15,16,17,18,19,20,43. Однако демонстрация метода dpy-10 co-CRISPR в видеоформате в лабораторных условиях в настоящее время отсутствует. В этой статье мы опишем и продемонстрируем процесс использования метода dpy-10 co-CRISPR для редактирования репрезентативного гена-мишени под названием rbm-3.2, предполагаемого РНК-связывающего белка (WormBase:https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  В частности, здесь мы подробно описываем метод введения трех преждевременных стоп-кодонов в ген C. elegans rbm-3.2 с использованием собранных in vitro рибонуклеопротеиновых комплексов и экзогенно поставляемого линейного одноцепочечного шаблона репарации. Эти исследования были успешными в генерации первого штамма C. elegans CRISPR с преждевременными стоп-кодонами в гене rbm-3.2. Поскольку в настоящее время мало что известно о функции этого гена у C. elegans, этот штамм будет служить полезным инструментом в препарировки функции RMB-3.2. Этот метод также может быть принят для вставок, замен и делеций в любом локусе в геноме C. elegans.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол для редактирования генома CRISPR/Cas9 был одобрен Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Талсы в соответствии с руководящими принципами NIH. На протяжении всего этого протокола практиковалась стерильная техника. Все этапы этого протокола проводились с использованием реагентов, которые не имели нуклеаз. Особое усердствовало предотвращение загрязнения РНКазами, таких как чистка перчаток, а также рабочих мест и оборудования (например, пипеток, наружной части стеклянной посуды и т.д.) с помощью обеззараживающего раствора РНКазы.

1. Конструкция crRNA

  1. Найдите PAM, который позволяет Cas9 резать ближе всего к сайту редактирования.
    1. Сайт PAM - 5'-NGG-3'.
    2. Помните, что PAM может быть на любой нити ДНК.
  2. Выберите 20 bp на 5' конце PAM в качестве последовательности crRNA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фактическая последовательность crRNA, синтезируемая коммерческими компаниями, длиннее 20 bp, поскольку она имеет дополнительную общую последовательность, которая автоматически добавляется к целевой последовательности crRNA 20 bp синтезаторной компанией. Что касается нецелевого эффекта, недавние исследования не обнаружили нецелевых эффектов Cas9 у C. elegans36,37,38,39,40. Кроме того, результирующие CRISPR-отредактированные штаммы пересекаются. Поэтому мы не очень обеспокоены нецелевым воздействием разработанных crRNAs. Тем не менее, онлайн-сайты, включая http://genome.sfu.ca/crispr/ и http://crispor.tefor.net/, могут быть использованы для поиска и выбора crRNAs с наименьшими нецелевыми эффектами38,41. CrRNAs, которые заканчиваются на G или GG и с содержанием GC более 50%, по прогнозам, будут более эффективными19,23,42.
  3. Закажите не менее 10 нмоль крРНК у компании (например, IDT, Horizon Discovery и т. Д.).
    1. Как только лиофилизированная crRNA поступит, храните ее при -30°C до дня микроинъекции.
    2. В день выполнения микроинъекции вращайте лиофилизированную crРНК с максимальной скоростью (17 000 х г) в течение одной минуты и повторно суспендируем ее в 5 мМ Tris-Cl (рН 7,4), чтобы получить запас крРНК 8 мкг/мкл.
    3. Хранить неиспользованный запас crRNA замороженным при -80 °C.

2. Восстановление дизайна шаблона

  1. Загрузите программное обеспечение для управления последовательностями (например, CLC sequence viewer, APE, Snapgene, Vector NTI и т. Д.). Мы используем CLC sequence viewer версии 8.0 (Qiagen), так как он удобен для пользователя и может быть загружен бесплатно.
  2. Вставьте последовательность целевой ДНК, которая представляет интерес, в средство просмотра последовательностей.
  3. Ориентация шаблона восстановления влияет на эффективность редактирования28. Для вставки последовательности репарации в 5' конец PAM, спроектируйте одноцепочечный шаблон репарации с последовательностью ДНК из той же цепи ДНК, на которой расположена последовательность PAM (протоспейсерная цепь)28. В то время как для вставки последовательности репарации в 3'-й конец PAM, разработайте одноцепочечный шаблон репарации с последовательностью ДНК из цепи ДНК, которая не несет последовательность PAM (спейсерная цепь)28.
  4. Выберите 35 пар оснований последовательности с непрерывной гомологией с обеих сторон (на конце 5' и 3') редактирования.
  5. Мутируйте или удалите PAM, чтобы предотвратить вырезание шаблона восстановления или отредактированной геномной ДНК Cas9.
    1. Если мутация PAM невозможна, введите несколько тихих мутаций вблизи 5'-го конца PAM, чтобы предотвратить вырезание шаблона восстановления или отредактированной геномной ДНК.
    2. Убедитесь, что вы вводите тихие мутации PAM только в том случае, если он присутствует в экзоновой области.
    3. Проверьте частоту использования кодона, чтобы убедиться, что мутированный кодон вводится с частотой, сопоставимой с исходным немутированным кодоном (например, https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). В некоторых случаях может оказаться невозможным ввести мутировавший кодон с частотой, аналогичной немутированной кодону. Однако для мутаций нескольких аминокислот мы не ожидаем, что уровень экспрессии мутантного белка будет значительно изменен.
  6. Если правка небольшая (например, мутация нескольких оснований), введите уникальный сайт ограничения, близкий к редактированию тихим мутагенезом. Мы используем http://heimanlab.com/cut2.html, чтобы найти сайты ограничений, которые могут быть введены тихим мутагенезом.
    1. Проверьте частоту использования кодона, чтобы убедиться, что мутированный кодон вводится с частотой, сопоставимой с исходным немутированным кодоном. Как было сказано выше, это не всегда возможно. Однако для экспериментов, включающих мутации нескольких аминокислот, мы не ожидаем, что уровень экспрессии мутантного белка будет значительно изменен.
  7. Синтезируйте и приобретайте линейные одноцепочечные шаблоны ремонта для HDR в виде ультрамерных олиго 4 нмоль.
  8. Повторно суспендируйте лиофилизированный олигонуклеотидный шаблон восстановления в воде без нуклеаз, чтобы сделать запас ремонтного шаблона 1 мкг/мкл и сохранить его при -30 °C до дальнейшего использования.

3. Конструкция просеивательной грунтовки

  1. Используя средство просмотра последовательностей CLC или другие подобные приложения, спроектируйте от 20 до 23 пар оснований вперед и обратно по обе стороны от редактирования соответственно, так что они производят полосу от 400 до 600 пар оснований при усилении ПЦР.
    1. Для более крупных вставок размером в несколько килобаз спроектируйте перевязочную грунтовку, расположенную рядом с левым гомологическим рычагом шаблона ремонта. Спроектируйте обратную грунтовку, расположенную в самом шаблоне ремонта. В этом случае продукт ПЦР будет получен только в случае положительно отредактированных червей.
    2. Чтобы идентифицировать гомозиготно отредактированных червей для более длинных вставок, усилите всю область вставки, спроектиив прямой и обратный грунтовки, которые расположены за пределами вставных соединений.
  2. Протестируйте праймеры и оптимизируйте условия ПЦР с геномной ДНК дикого типа перед использованием праймеров для генотипирования.
    1. Убедитесь, что одна полоса ожидаемого размера образуется при ПЦР-амплификации геномной ДНК (где это применимо).

4. Подготовка молодых взрослых червей к инъекциям

  1. Соберите L2-L3 стадии C. elegans на свежем бактериальном газоне на пластине MYOB и высиживайте при 20 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол изготовления пластин MYOB можно найти здесь: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
  2. В день микроинъекции подберите молодых взрослых червей с менее чем 10 эмбрионами в матке для инъекции.

5. Приготовление инъекционной смеси

  1. Готовят инъекционную смесь в том же порядке, как показано в таблице 1, в стерильных пробирках без нуклеаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты инъекционной смеси могут быть уменьшены до 5 мкл инъекционных смесей (вместо 20 мкл), если будущие инъекции с этой смесью не ожидаются.
  2. Смесь для инъекций перемешайте путем пипетки.
  3. Инкубировать инъекционную смесь при 37 °C в течение 15 минут для сборки рибонуклеопротеинов.
  4. Вращайте смесь для инъекций при 4 °C при 17 000 х г в течение 5 минут.

6. Микроинъекция в гонаду C. elegans

  1. Выполните микроинъекцию инъекционной смеси CRISPR в гонаду C. elegans, как описано в Iyer et al. 201943.
    1. Ввести около 30 червей с инъекционной смесью CRISPR. Неиспользованную инъекционную смесь можно повторно использовать, храня при 4°C в течение примерно 6 месяцев без потери эффективности49.
    2. По возможности ввести обе руки гонады. Инъекционные черви считаются поколением P0.

7. Инъекционное восстановление и перенос червей

  1. После микроинъекции переместите микроинъективных червей P0 с помощью червячной кирки на 60-миллиметровую агаровую пластину MYOB, засеянное кишечной палочкой OP50 E., и дайте им восстановиться при комнатной температуре в течение примерно одного часа.
    1. Обратите внимание, что температура восстановления будет зависеть от генотипа введенных червей. Например, для чувствительных к температуре штаммов может потребоваться восстановление червей при другой температуре.
  2. Используя сбор платинового проволочного червя, перенесите каждого введенного червя на одну посеянный 35-миллиметровую пластину MYOB agar petri и дайте им отложить яйца при 20 ° C до следующегодня.
    1. Обратите внимание, что некоторые черви погибнут в результате травмы от процедуры микроинъекции. Выбирайте только тех червей, которые живы и демонстрируют движение.
  3. Через 24 часа перенесите введенных червей на новые отдельные пластины (1 червь на пластину).

8. Комплектация C. элеганс для скрининга

  1. Через 3-4 дня при 20°C после инъекции контролируйте все пластины, которые содержат потомство введенных червей, с помощью рассекающего микроскопа.
  2. Определите пластины, которые имеют потомствоF1, демонстрирующее фенотипы ролика (Rol) и дампа (Dpy). Фенотип Dpy - это когда черви кажутся короче и полнее, чем контрольные черви на той же стадии развития (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Пластины с червями Rol и Dpy представляют собой пластины, где потомство F1 было успешно отредактировано с мутацией dpy-10(cn64), чтобы присутствовать в его гетерозиготном или гомозиготном состоянии, соответственно.
  3. Подберите тарелки с наибольшим количеством роликовых и болтовых червей для просеивания.
  4. Выделите от 50 до 100 червей F1 Rol из этих пластин на их собственные отдельные пластины (1 червь на тарелку) и позвольте им отложить яйца.
    1. Позвольте L4-ступенчатым червямF1 Rol откладывать яйца и производить потомство (F2)в течение 1-2 дней.

9. Одиночный глистный лизис и ПЦР

  1. После полученияF2 в течение 1-2 дней переведите каждую выделенную матьF1 Rol в 2,5 мкл лизизного буфера (таблица 2) с разведением 1:100 20 мг/мл протеиназы K.
  2. Заморозьте пробирки при -30 °C в течение 20 минут. Черви могут храниться на этом этапе в течение длительного периода времени до дальнейшего анализа.
  3. Выполняют одиночный червячный лизис на термоциклере ПЦР со следующими условиями: 60 °C в течение 1 часа, 95 °C в течение 15 мин и держат при 4 °C.
  4. Добавьте следующие реагенты непосредственно к 2,5 мкл лизированного червя, содержащего трубку ПЦР: 12,5 мкл 2x ПЦР-смеси, содержащей дНТП, ДНК-полимеразу,MgCl2 и нагрузочный краситель, 1 мкл 10 мкМ прямой праймер, 1 мкл обратной грунтовки 10 мкМ и стерильную воду до 22,5 мкл. Общий объем каждой реакции ПЦР составляет 25 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае скрининга нескольких червейF1 быстрее и удобнее сделать мастер-микс ПЦР для нескольких реакций и добавить 22,5 мкл мастер-микса в каждую лизисную трубку.
  5. Настраивать ПЦР-реакции на термоциклере со следующими условиями: 95 °C в течение 1 минуты, 35 циклов, 95 °C в течение 15 с, 55 °C в течение 15 с (оптимизировать для каждого набора праймеров), 72 °C в течение 1 минуты (оптимизировать для каждой целевой ДНК)44. Удерживайте реакции при 4 °C.

10. Ограничение пищеварения и электрофорез агарозного геля

ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничение пищеварения необходимо только при скрининге на небольшие правки (менее 50 bp).

  1. Перенесите 10 мкл ДНК ПЦР со этапа 9 в новую трубку.
  2. Добавьте от 2 до 4 единиц фермента рестрикции и 1x буфера фермента рестрикции (1,5 мкл 10x реакционного буфера) на реакцию 15 мкл.
  3. Инкубировать при 37 °C (или при другой фермент-специфической температуре) в течение 2 часов (более короткое время инкубации может быть возможно с ферментами быстрого действия).
  4. Тепло инактивирует рестрикционный переваритель путем нагревания ПЦР-трубок при 65 °C (или другой фермент-специфической температуре) в течение 10-15 минут.
  5. Загрузите всю реакцию из каждой трубки ПЦР в одну скважину с 1%-2% агарозным гелем и запустите гель при 110 мА до тех пор, пока не будет достигнуто надлежащее разделение полос.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем ПЦР-смесь, которая уже имеет загрузочный краситель, включенный для визуализации при работе на агарозном геле. Эта смесь не мешает реакции ограничения пищеварения и поэтому удобна в использовании для скрининга многих глистов одновременно.

11. Идентификация положительно отредактированных червей

  1. Визуализируйте агарозные гели под ультрафиолетовым светом (для гелей бромида этидия) для определения размеров полосы ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положительно отредактированные черви будут отображать дополнительную полосу ДНК в ожидаемом размере из-за редактирования с использованием шаблона восстановления, несущего участок ограничения в желаемом локусе в геноме червя. Ожидается, чтороликовые черви F1 будут гетерозиготными для редактирования и, следовательно, будут демонстрировать три полосы (один неразрезанный продукт ПЦР дикого типа и два меньших фрагмента из отредактированного разрезаемого продукта ПЦР). Хотя это редко, следует отметить, что гомозиготы возникают время от времени.
  2. Сохраните все исходные положительно отредактированные пластины до тех пор, пока наличие правки не будет проверено секвенированием Сэнгера.

12. Гомозиготная правка, представляющий интерес

  1. Выберите от 8 до 12 диких червей F2 из соответствующих положительно отредактированных пластин червей F1 Rol и позвольте им откладывать яйца и производить потомство в течение 1-2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку C. elegans являются самооплодотворяющимися гермафродитами, если отредактированный аллель не влияет на жизнеспособность или развитие, доля ожидаемых гомозиготных мутантов должна составлять примерно 25%. Некатные черви F2 должны быть дикого типа для локуса dpy-10. Выбор некатных червей позволяет генерации отредактированных червей, которые потеряли мутацию dpy-10 (cn64) и имеют мутацию только в интересующий вас ген.
    1. Обратите внимание, что ген dpy-10 присутствует на хромосоме II. Если ваш интересующих ген связан с dpy-10,вы не сможете легко отделить мутацию dpy-10 от интересуя вашего гена.
  2. Выполните шаги с 9 по 11, чтобы определить гомозиготные линии червей.

13. Подтвердите редактирование с помощью последовательности

  1. Как только гомозиготные черви идентифицированы, выполняют лизис и ПЦР, как описано в шаге 9.
    1. Настройте по меньшей мере 3 реакции ПЦР для каждой гомозиготной линии, которая должна быть секвенирована.
  2. Очистите реакции ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР.
  3. Измерьте концентрацию ДНК с помощью нанокаперопного спектрофотометра.
  4. Отправьте образец с соответствующим праймером для секвенирования Сэнгера. Убедитесь, что букварь направлена так, чтобы она была на не менее чем 50 основаниях от редактируемого для виртуализации.
  5. Проанализируйте результаты секвенирования с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей, чтобы подтвердить наличие правки.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

rbm-3.2 является предполагаемой РНК-связывающим белком, который имеет гомологию к человеческому фактору стимуляции расщепления субъедицы 2 тау-варианта (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10). Белок RBM-3.2 был идентифицирован как связывающий партнер белковой фосфатазы 1 (GSP-1) и его регуляторов Ингибитор-2 (I-2SZY-2)и SDS-22 в предыдущем исследовании, которое идентифицировало эти белки как новые регуляторы дупликации центриол C. elegans (данные не показаны)45. В настоящее время очень мало известно о функции гена rbm-3.2 у C. elegans. Следовательно, для дальнейшего изучения биологической роли гена C. elegans rbm-3.2 из Центра генетики кэнорхабдита (CGC) был получен нулевой аллель rbm-3.2(ok688).

К сожалению, в дополнение к обладания делецией всего гена rbm-3.2, аллель rbm-3.2 (ok688) также приводит к частичной делеции перекрывающегося гена rbm-3.1, тем самым усложняя генетический анализ. Поэтому, чтобы точно исследовать роль гена rbm-3.2 у C. elegans, мы использовали редактирование CRISPR / Cas9 для введения трех преждевременных стоп-кодонов очень близко к началу кодирующей области C. elegans rbm-3.2, оставив перекрывающийся ген rbm-3.1 нетронутым.

Чтобы ввести эти преждевременные стоп-кодоны в ген C. elegans rbm-3.2, мы разработали crRNA с мотивом PAM, которая была расположена на противоположной нити (шаблонной цепи) ДНК (рисунок 1A). Участок разреза Cas9 располагался в 6 базах от стартового кодона РБМ-3.2 ПТД. Чтобы ввести преждевременные стоп-кодоны в ген rbm-3.2, мы разработали шаблон восстановления со следующими пятью основными характеристиками: 1) 35 оснований непрерывной гомологии к rbm-3.2 выше по течению от стартового кодона rbm-3.2 (левая рука гомологии) 2) Короткий участок оснований, содержащих мотив PAM, был удален 3) Сразу после стартового кодона для скрининга был введен сайт ограничения EcoRI для скрининга 4) Второй и третий кодоны rbm-3.2 были удалены и три стоп-кодона были введены после пятого кодона RBM-3.2 для остановки трансляции rbm-3.2 мРНК 5) 35 оснований непрерывной гомологии в первый интрон rbm-3.2 были включены после редактирования (правый гомологический рычаг) (рисунок 1B).

Инъекционная смесь для этого эксперимента CRISPR была приготовлена, как указано в таблице I. Инъекционную смесь инкубировали при 37 °C в течение 15 минут для сборки рибонуклеопротеинов. Затем смесь центрифугировали и загружали в вытянутую микроинъекционную иглу. Микроинъекция в гонаду C. elegans была выполнена, как описано в Iyer et al. 201943.

На рисунке 2 показана экспериментальная временная шкала для генерации отредактированных C. elegans с использованием этого протокола. Хотя мы обычно вводим 30 червей для каждого эксперимента CRISPR, некоторые лаборатории вводят меньше червей (от 10 до 20) для каждого эксперимента CRISPR. Поскольку инъекция большего количества червей увеличивает вероятность нахождения положительных изменений, мы предпочитаем вводить большее количество червей. Многие лаборатории отбирают выводки «джекпота» (тарелки с более чем 50% потомство Rol и Dpy) для скрининга. По нашему опыту после выполнения нескольких экспериментов CRISPR, хотя выводки джекпота возникают время от времени, в большинстве случаев, черви Rol, которые выбираются для скрининга, часто происходят из разных пластин P0, каждая из которых состоит из нескольких потомков Rol. В этом эксперименте не было получено никаких выводков джекпота.

В общей сложности мы проверили геномную ДНК 73 червей F1 Rol, которые были получены из 7 введенных червей P0 на наличие редактирования. Последовательности экранировочных праймеров и их расположение относительно стартового кодона гена rbm-3.2 представлены на рисунке 3А. Благодаря нашему анализу, 7 из 73 червей F1 оказались положительными для редактирования (9,5%) (рисунок 3B). Необезредактированные черви показали один фрагмент ДНК 445 bp при пищеварении EcoRI. Принимая во внимание, что черви, несущие преждевременный стоп-кодон в гене rbm-3.2, демонстрировали два фрагмента 265 bp и 166 bp соответственно при пищеварении EcoRI. Гетерозиготно отредактированные черви показали три фрагмента при пищеварении EcoRI: один нередактированный фрагмент ДНК дикого типа 445 bp и два фрагмента ДНК 265 bp и 166 bp соответственно из отредактированной копии гена rbm-3.2.

Чтобы идентифицировать червей, несущих гомозиготные правки, мы перенесли 12F2 червей из идентифицированных положительных гетерозиготF1 на новые отдельные пластины и позволили им производить потомство (F3). Затем червейF2 проверяли на гомозиготность, как описано ранее. 6 из 12 (50%) скрининговых червей были признаны гомозиготными для нашей интересуемой правки (рисунок 4A). Геномная ДНК идентифицированной гомозиготно отредактированной линии червей была использована для создания реакции секвенирования ДНК. Анализ секвенирования ДНК подтвердил наличие правки в ее гомозиготном состоянии(рисунок 4В). В общем, полезно секвенировать несколько гомозиготных линий червей, чтобы гарантировать, что все гомозиготно отредактированные линии червей демонстрируют один и тот же фенотип (если нулевая мутация производит определенный фенотип). Кроме того, может также потребоваться проверка нокаутов генов с использованием анализа на основе экспрессии, такого как вестерн-блоттинг или ОТ-ПЦР, или с помощью анализа фенотипа. Это связано с тем, что, несмотря на введение преждевременных стоп-кодонов в начале гена, альтернативный ATG может присутствовать после преждевременных стоп-кодонов. Этот АТГ может быть использован для инициирования экспрессии белка, что приводит к частично функциональному усечению белка.

РеагентКонцентрацияДобавляемый объем
Белок Cas9 в воде без нуклеазы с 20% глицерина2 мкг/мкл5 мкл
тракрРНК в 5 мМ Tris-Cl рН 7,54 мкг/мкл5 мкл
dpy-10 crRNA в 5 мМ Tris-Cl рН 7,58 мкг/мкл0.4 мкл
rbm-3,2 крРНК в 5 мМ Tris-Cl рН 7,58 мкг/мкл1 мкл
dpy-10 ремонтный шаблон в стерильной воде без нуклеазы500 нг/мкл0.55 мкл
rbm-3.2 восстанавливать шаблон в стерильной воде без нуклеазы1 мкг/мкл2.2 мкл
KCl в стерильной воде без нуклеазы1 М0.5 мкл
стерильная вода без нуклеазы-5.35 мкл

Таблица 1: Компоненты инъекционной смеси для редактирования CRISPR/Cas9 с использованием рибонуклеопротеиновых комплексов и dpy-10 в качестве маркера co-CRISPR. Используйте стерильные методы и реагенты без РНКазы при изготовлении инъекционной смеси. Обратите внимание, что для изготовления инъекционной смеси использовалась стерильная, не обработанная DEPC вода без нуклеазы.

РеагентКонцентрацияДобавляемый объем
ККл1 М5 мл
Трис-HCl pH 8,31 М1 мл
МгCl21 М250 мкл
NP-40 (или IGEPAL CA-630)100%450 мкл
Анимация-20100%450 мкл
Желатин2%500 мкл
Вода-92.35 мл

Таблица 2: Рецепт буфера лизиса червей. Буфер лизиса червей может быть изготовлен в объеме, автоклавирован, отфильтрован и аликвотирован для длительного хранения (ПРИМЕЧАНИЕ: буфер лизиса может храниться более года при комнатной температуре). Добавьте разбавление 1:100 20 мг/мл протеиназы К в буфер лизиса червей непосредственно перед каждым использованием.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема, показывающая дизайн crRNA и шаблона восстановления для rbm-3.2 преждевременной остановки CRISPR. Схема,отображающая кодирующие и шаблонные нити гена rbm-3.2 с последовательностью crRNA и последовательностью мотивов PAM, расположенными на шаблонной цепи. B.Схема, представляющая различные характеристики шаблона репарации, который был синтезирован для введения трех преждевременных стоп-кодонов в ген rbm-3.2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2:Экспериментальная временная шкала для генерации гомозиготно отредактированных C. elegans путем редактирования CRISPR/Cas9 с использованием предварительно собранных рибонуклеопротеиновых комплексов и dpy-10 в качестве маркера co-CRISPR. Посовеменная разбивка шагов, которые необходимо выполнить для генерации гомозиготно отредактированных C. elegans с использованием этого метода редактирования CRISPR/Cas9. Вкратце, 30 червей вводили с помощью смеси для редактирования CRISPR с использованием микроинъекции и разделяли на отдельные пластины MYOB, засеянные OP50 E. coli. Через 24 часа введенных червей P0 переносили на свежие новые пластины MYOB и позволяли продолжать откладывать яйца. На 3 и 4 день после микроинъекции пластины исследовали на наличие червей RolF1. Были отобраны пластины с максимальным количеством червей Rol и Dpy F1, и 73 червя F1 Rol (мы обычно выбираем от 50 до 100 F1 Rol червей за эксперимент CRISPR) были выделены на новые отдельные пластины MYOB (1 червь на пластину) и им было разрешено откладывать яйца в течение примерно 2 дней. На 6-й день после микроинъекции червячные лизаты получали из червейF1, которые произвели потомство(F2),и проверяли на наличие редактирования с помощью ПЦР с последующим рестрикционным пищеварением с помощью EcoRI и электрофорезом агарозного геля. На 7-й день 12 червей без Rol, не Dpy F2 были перенесены с положительных пластин на новые отдельные пластины и позволили произвести потомство (F3). На 9-й день черви F2 были проверены на гомозиготность редактирования, как описано ранее. На 10-й день для гомозиготных червейF3 был проведен лизис червей, ПЦР и ПЦР-очистка, а концентрация ДНК была измерена с помощью спектрофотометра NanoDrop. На 11-й день реакции секвенирования Сэнгера были настроены для положительных образцов, и реакции были отправлены на секвенирование ДНК. На 12-й день результаты секвенирования были проанализированы, и наличие правки было проверено с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей (например, CLC sequence viewer). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3:Скрининг на C. elegans, которые являются гетерозиготными для rbm-3.2 преждевременных стоп-кодонов. Изображения электрофореза агарозного геля C. elegans геномной ПЦР-ДНК, перевариваемой с помощью EcoRI. 73 отдельных червяF1 были генотипированы и проверены на наличие rbm-3.2 edit. Красные цифры и звездочки указывают на положительно отредактированных червей. Все 7 идентифицированных положительно отредактированных C. elegans были гетерозиготными для редактирования, поскольку они продемонстрировали один нередактированный фрагмент ДНК дикого типа 445 bp и два фрагмента ДНК 265 bp и 166 bp соответственно из отредактированной копии гена rbm-3.2 при пищеварении EcoRI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4:Идентификация и проверка гомозиготно отредактированных C. elegans, несущих преждевременные стоп-кодоны rbm-3.2. А. Скрининг на C. elegans, которые являются гомозиготными для rbm-3.2 преждевременных стоп-кодонов. Изображения электрофореза агарозного геля геномной ДНК C. elegans, перевариваемой с помощью EcoRI. 12 отдельных червейF2 из положительных пластин были генотипированы и проверены на гомозиготность редактирования rbm-3.2. Красный: гомозиготно-отредактированные черви. 6 из 12 просеявшихF2 червей (50%) были гомозиготными для преждевременных стоп-кодонов rbm-3.2. Для червя 7 не было препарата ПЦР. В. Подтверждение введения преждевременных стоп-кодонов в rbm-3.2 путем секвенирования ДНК. Схема, показывающая сравнение последовательностей ДНК и белков неотредактированных и отредактированных гомозигот. Анализ результатов секвенирования ДНК геномной ДНК гомозиготно-отредактированных червей подтвердил наличие трех преждевременных стоп-кодонов в гене rbm-3.2 при редактировании CRISPR/Cas9. Все результирующие изменения аминокислот после редактирования CRISPR/Cas9 обозначены либо красными буквами, либо красными звездочками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали вышеупомянутый протокол для редактирования нескольких генов, помимо rbm-3.2. Эффективность редактирования для различных локусов, направляющих РНК и шаблонов восстановления (одноцепочечных и двухцепочечных) варьировалась от 2% до 58% (данные не показаны). Наблюдаемая эффективность редактирования сопоставима с ранее сообщенной эффективностью редактирования от 2% до 70% для данного протокола27. Мы также успешно использовали эту технику в делеции генов. Используя две crРНК, мы заменили ген длиной около 6 кб кодирующей последовательностью для зеленого флуоресцентного белка (GFP) (данные не показаны). Для этого эксперимента около 14% проанализированных червей RolF1 оказались положительными для делеции генов и замены GFP (данные не показаны). Однако необходимы дополнительные эксперименты для определения максимальной длины делеций генов и замен, которые могут быть выполнены с использованием этой методики.

Этот метод может быть использован для изготовления вставок длиной около 1,6 кб19. Недавнее исследование показало, что для создания вставок длиной более 1,6 КБ с использованием этого протокола, генерация двух двухцепочечных разрывов и использование шаблонов восстановления с более длинными гомологическими плечами может позволить вставлять гораздо большие фрагменты ДНК (~ 10 Кб)28. В качестве альтернативы, несколько раундов редактирования генов с помощью этого протокола могут быть выполнены для генерации более крупных изменений. Другие протоколы редактирования генов CRISPR/Cas9 на основе плазмид также могут быть приняты для экспериментов CRISPR, включающих вставку фрагментов ДНК размером более 1,6 кб46,47,48.

Прежде чем использовать этот протокол для редактирования генов, необходимо убедиться, что интересующие гены не связаны с локусом dpy-10 на хромосоме II. В случае, если ген-мишень связан с dpy-10,может быть проблематично отделить мутацию dpy-10 от интересующих вас правок. Следовательно, в случае, если интересуящий ген связан с локусом dpy-10, другие маркеры co-CRISPR, такие как unc-58 (X-хромосома),unc-22 или zen-4 (хромосомаIV) и ben-1 или pha-1 (хромосома III), которые расположены на разных хромосомах, могут быть использованы24,25,26,28. Данные лаборатории Мейера демонстрируют, что мутации бен-1 и дзен-4 могут быть использованы в качестве успешных маркеров co-CRISPR для скрининга с помощью этого метода28. Тем не менее, важно отметить, что использование zen-4 и pha-1 в качестве маркеров co-CRISPR требует проведения эксперимента CRISPR на фонах zen-4 (cle10ts) или pha-1(e2123ts) без дикого типа соответственно26, 28. Кроме того, эксперименты CRISPR с участием некоторых маркеров co-CRISPR, таких как бен-1, могут потребовать подготовки специальных пластин (например, пластин, содержащих бензимидазол)28. Мы успешно использовали маркер unc-58 co-CRISPR для скрининга положительных изменений для гена, который связан с dpy-10 с помощью этого метода (данные не показаны). Мутация unc-58(e665) дает видимый фенотип (паралич), который может быть эффективно использован для скрининга положительно отредактированных червей24. Альтернативно, если доступ к флуоресцентному микроскопу доступен, ген gtbp-1 с флуоресцентной меткой также может быть использован в качестве маркера co-CRISPR для этого протокола19.

Для высокой эффективности редактирования при использовании этого метода редактирования генома сайт редактирования должен находиться в пределах от 10 до 30 оснований от сайта резки Cas9. Если сайт редактирования находится на более чем 30 базах от сайта резки Cas9, эффективность редактирования резко падаетна 19,35,37. Тем не менее, недавнее исследование, проведенное в лаборатории Мейера, показало, что создание двух двухцепочечных разрывов на расстоянии друг от друга может позволить вставлять правки далеко от сайта резки Cas9 с использованием этого протокола28.

В текущем протоколе шаблон восстановления был разработан таким образом, чтобы все три вставленных стоп-кодона отображались в одном кадре чтения. Тем не менее, альтернативной стратегией создания нулевых мутантов было бы использование универсальной 43-базовой длинной кассеты STOP-IN, которая была описанаранее 50. Важно отметить, что эта кассета имеет стоп-кодоны во всех трех возможных кадрах чтения и вызывает мутации сдвига кадра. Это особенно полезная стратегия для генерации нулевых мутантов, когда на сайте редактирования происходит неправильное или неполное восстановление.

В заключение, благодаря своей короткой продолжительности и последним достижениям в этом методе, это отличный метод для рутинных лабораторных экспериментов, включающих добавление коротких иммуногенных эпитопных меток, флуоресцентных меток, проведение делеций генов, замен генов и замен кодонов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана стартовыми фондами Университета Талсы (TU) и летней стипендией TU Faculty Development Summer Fellowship, присужденной Джоти Айер. Мы хотели бы поблагодарить Летнюю исследовательскую программу бакалавриата по химии (CSURP) и Tulsa Undergraduate Research Challenge (TURC) за присуждение стипендий студентам, участвующим в этом исследовании. Мы хотели бы выразить признательность г-же Кэролайн Данн за ее техническую помощь. Наконец, мы хотели бы поблагодарить докторов Джордана Уорда, Эйми Харамильо-Ламберт, Анну Аллен, Роберта Шиффа, Уильяма Поттера и Сайли Моге за их критические комментарии к этой рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пробирки для секвенирования ДНК со штрих-кодомEurofins GenomicsSimpleSeq Kit Предварительно смешанныйN/A
белок Cas9PNA BioCP01Лиофилизированный белок Cas9 ресуспендировали в 20% глицеринсодержащей воде, содержащей нуклеазу, аликвотировали и хранили при температуре -80 °°; C
crРНКHorizon Discovery/ GE DharmaconN/AЛиофилизированные crРНК ресуспендировали в 5 мМ Tris-Cl pH 7,5, аликвотировали и хранили при -80 °°; C
EcoRINew England BiolabsR3101Sхранится при температуре -30 °°; C
Minelute PCR purification kitQiagen28004Spin колонки, хранящиеся при температуре 4 ° C
MyTaq RedmixMeridian BioscienceBIO-25043при температуре -30 °°;
С-праймерыIDTN/AStandard 20 нмоль олиголигоны синтезировали, ресуспендировали в стерильной воде, не содержащей нуклеаз, и хранили при температуре -30 °Deg; C
протеиназа KGold BioP-480-SL4хранится при -30 °°; C
Репарирующий матричный олигонIDTN/A 4нмоль Ультрамерные олигоны синтезировали, ресуспендировали в стерильной воде, не содержащей нуклеаз, и хранили при температуре -30 °°; C
tracrRNAHorizon Discovery/ GE DharmaconU-002005-50Лиофилизированную тракрРНК ресуспендировали в 5 мМ Tris-Cl pH 7,5, аликвотировали и хранили при -80 °°; С

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
  2. Carroll, D. Genome engineering with targetable nucleases. Annual Review of Biochemistry. 83, 409-439 (2014).
  3. Chandrasegaran, S., Carroll, D. Origins of Programmable Nucleases for Genome Engineering. Journal of Molecular Biology. 428 (5), 963-989 (2016).
  4. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  5. Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  6. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., Almendros, C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 155 (3), 733-740 (2009).
  9. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  10. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  11. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  12. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. CRISPR, Methods in Molecular Biology. 1311, Humana Press. New York, NY. 7-75 (2015).
  13. Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
  14. Frøkjær-Jensen, C. Exciting prospects for precise engineering of Caenorhabditis elegans genomes with CRISPR/Cas9. Genetics. 195 (3), 635-642 (2013).
  15. Waaijers, S., Boxem, M. Engineering the Caenorhabditis elegans genome with CRISPR/Cas9. Methods. 68 (3), 381-388 (2014).
  16. Xu, S. The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans. Journal of Genetics and Genomics. 42 (8), 413-421 (2015).
  17. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-based methods for Caenorhabditis elegans genome engineering. Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).
  18. Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
  19. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121, 86-93 (2017).
  20. Kim, H. M., Colaiácovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in Caenorhabditis elegans. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 106(2019).
  21. Prior, H., MacConnachie, L., Martinez, J. L., Nicholl, G. C., Beg, A. A. A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins. Journal of Visualized Experiments. (134), e57518(2018).
  22. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly efficient, rapid and Co-CRISPR-independent genome editing in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (11), 3693-3698 (2017).
  23. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  24. Arribere, J. A., Bell, R. T., Fu, B. X., Artiles, K. L., Hartman, P. S., Fire, A. Z. Efficient marker-free recovery of custom genetic modifications with CRISPR/Cas9 in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (3), 837-846 (2014).
  25. Kim, H., et al. A co-CRISPR strategy for efficient genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 197 (4), 1069-1080 (2014).
  26. Ward, J. D. Rapid and precise engineering of the Caenorhabditis elegans genome with lethal mutation co-conversion and inactivation of NHEJ repair. Genetics. 199 (2), 363-377 (2015).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Farboud, B., Severson, A. F., Meyer, B. J. Strategies for efficient genome editing using CRISPR-Cas9. Genetics. 211 (2), 431-457 (2019).
  29. Levy, A. D., Yang, J., Kramer, J. M. Molecular and genetic analyses of the Caenorhabditis elegans dpy-2 and dpy-10 collagen genes: a variety of molecular alterations affect organismal morphology. Molecular Biology of the Cell. 4 (8), 803-817 (1993).
  30. Kramer, J. M., Johnson, J. J., Edgar, R. S., Basch, C., Roberts, S. The sqt-1 gene of C. elegans encodes a collagen critical for organismal morphogenesis. Cell. 55 (4), 555-565 (1988).
  31. Schnabel, H., Schnabel, R. An organ-specific differentiation gene, pha-1, from Caenorhabditis elegans. Science. 250 (4981), 686-688 (1990).
  32. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Research. 22 (9), 1762-1763 (1994).
  33. Chalfie, M., Thomson, J. N. Structural and functional diversity in the neuronal microtubules of Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 93 (1), 15-23 (1982).
  34. Severson, A. F., Hamill, D. R., Carter, J. C., Schumacher, J., Bowerman, B. The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeMKLP1 to the mitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Current Biology. 10 (19), 1162-1171 (2000).
  35. Paix, A., Schmidt, H., Seydoux, G. Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs. Nucleic Acids Research. 44 (15), 128(2016).
  36. Chiu, H., Schwartz, H. T., Antoshechkin, I., Sternberg, P. W. Transgene-free genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas. Genetics. 195 (3), 1167-1171 (2013).
  37. Paix, A., et al. Scalable and versatile genome editing using linear DNAs with microhomology to Cas9 Sites in Caenorhabditis elegans. Genetics. 198 (4), 1347-1356 (2014).
  38. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  39. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nature Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
  40. Friedland, A. E., Tzur, Y. B., Esvelt, K. M., Colaiácovo, M. P., Church, G. M., Calarco, J. A. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
  41. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  42. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PloS One. 9 (5), e98186(2014).
  43. Iyer, J., DeVaul, N., Hansen, T., Nebenfuehr, B. Using microinjection to generate genetically modified Caenorhabditis elegans by CRISPR/Cas9 editing. Microinjection, Methods in Molecular Biology. 1874, 431-457 (2019).
  44. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  45. Peel, N., Iyer, J., Naik, A., Dougherty, M. P., Decker, M., O'Connell, K. F. Protein phosphatase 1 down regulates ZYG-1 levels to limit centriole duplication. PLoS Genetics. 13 (1), 1006543(2017).
  46. Dickinson, D. J., Pani, A. M., Heppert, J. K., Higgins, C. D., Goldstein, B. Streamlined genome engineering with a self-excising drug selection cassette. Genetics. 200 (4), 1035-1049 (2015).
  47. Norris, A. D., Kim, H. M., Colaiácovo, M. P., Calarco, J. A. Efficient genome editing in Caenorhabditis elegans with a toolkit of dual-marker selection cassettes. Genetics. 201 (2), 449-458 (2015).
  48. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  49. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA Donor Molecules Greatly Improves Precision Genome Editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (2), (2020).
  50. Wang, H., Park, H., Liu, J., Sternberg, P. W. An efficient genome editing strategy to generate putative null mutants in Caenorhabditis elegans using CRISPR/Cas9. G3: Genes, Genomes, Genetics. 8 (11), 3607-3616 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C elegans

Похожие статьи