Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микрофлюидная модель для имитации первоначального события неоваскуляризации

4.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62003

⸱

10 апреля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предоставляем микрофлюидный чип и автоматически контролируемую, высокоэффективную микрофлюидную систему циркуляции, которая рекапиталитирует начальную микроокноронизацию неоваскуляризации, позволяя эндотелиальным клеткам (ЭК) стимулироваться высоким люминесцентным стрессом, физиологическим уровнем трансендотелиального потока и различным сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) одновременно.

Аннотация

Неоваскуляризация обычно инициализируется из существующей нормальной сосудоуположения, а биомеханическая микроокнония эндотелиальных клеток (ЭК) на начальном этапе резко отличается от следующего процесса неоваскуляризации. Хотя существует множество моделей для имитации различных стадий неоваскуляризации, 3D-модель in vitro, которая капитулирует первоначальный процесс неоваскуляризации при соответствующих стимуляциях нормальных микроокулинии сосудов, все еще отсутствует. Здесь мы реконструировали 3D-модель in vitro, которая имитирует начальное событие неоваскуляризации (MIEN). Модель MIEN содержит микрофлюидный прорастающий чип и автоматическую систему управления, высокоэффективную систему циркуляции. Сформировался функциональный, перфузируемый микроканал, покрытый эндотелием, и процесс прорастания был смоделирован в микрофлюидном прорастающих чипах. Первоначально физиологическая микроокнония неоваскуляризации была перепроверена с помощью системы микрофлюидного контроля, с помощью которой ЭК подвергались высокому светимому стрессу стрижки, физиологическому трансендохелиальный поток и различным сосудистым эндотелиальным факторам роста (VEGF) одновременно. Модель MIEN может быть легко применена к изучению механизма неоваскуляризации и имеет потенциальные перспективы в качестве недорогой платформы для скрининга лекарственных препаратов и применения токсикологии.

Введение

Неоваскуляризация происходит во многих нормальных ипатологических процессов 1,2,3,4 , которые включают всебядва основных процесса у взрослых, ангиогенез иартериогенез 5. Помимо наиболее известных факторов роста, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) 6 ,механическаястимуляция, в частности, кровоток индуцированного стресса стрижки, имеет важное значение в регуляции неоваскуляризации7. Как известно, величина и формы стресса стрижки резко и динамично различаются в разных частях сосудов, что приводит к значительному воздействиюна сосудистые клетки 8,9,10,11,12. Предыдущие исследования показали, что стресс стрижки может повлиять на различные аспекты ЭК, в том числе клеточные фенотипические изменения, трансдукция сигнала, экспрессия генов, исвязь с фресками клетки 13,14,15,16,17,18,19,20; следовательно, регулировать неоваскуляризацию21,22,23,24.

Поэтому, чтобы лучше понять неоваскуляризацию, важно реконструировать процесс при естественной клеточной микрооквидеония in vitro. В последнее время было создано много моделей для создания микро-сосудов и обеспечения точного контроля микрооконденций25,26,27,пользуясь достижениями в области микрофабрикации и микрофлюидных технологий. В этих моделях, микро-сосуды могут бытьсозданы гидрогеля 28,29, polydimethylsiloxane (PDMS) микрофлюидныхчипов 30,31,32 или 3Dбиопечати 33,34. Некоторые аспекты микроокантиронии, такие как светящийсястресс стрижки 22,23,35,36, трансендотельный поток37,38,39,40, биохимический градиентангиогенных факторов 41,42, штамм / растянуть43,44,45, и совместно культурных с другимитипами клеток 32,46 были имитированы и контролируются. Как правило, большой резервуар или шприц насос был использован для обеспечения perfused среды. Трансендотельный поток в этих моделях был создан падением давления междурезервуаром и микротрубой 22,23,38,40. Тем не менее, механическая микроокантиния было трудно поддерживать постоянно таким образом. Трансендотелиальный поток будет увеличиваться, а затем превышать физиологический уровень, если высокая скорость потока с высоким стрессом стрижки был использован для перфузии. Предыдущее исследование показало, что в начальный период неоваскуляризации, скорость трансендотелиального потока очень низка из-за нетронутых ЭК и мембраны подвала, как правило, под 0,05 мкм/с8. Между тем, хотя светимый стресс стрижки в сосудистой системе сильно варьируется, он относительно высок со средними значениями 5-20дин/см 2,11,47. На данный момент, скорость трансендотельного потока в предыдущих работах, как правило, хранится между 0,5-15 мкм /с 22,38,39,40, и светящийся блеск стресс, как правило, под 10 дин /см 223. По-прежнему трудно подвергать ЭК высокому светимому стрессу стрижки и физиологическому уровню трансендотельного потока одновременно. 

В настоящем исследовании мы описываем 3D-модель in vitro, имитирующий начальное событие неоваскуляризации (MIEN). Мы разработали микрофлюидный чип и автоматическую систему управления, высокоэффективную систему циркуляции для формирования микротрубок перфузии и имитации процессапрорастания 48. С помощью модели MIEN микроокниронизация ЭК, стимулируемая в начальный период неоваскуляризации, в первую очередь резюмируется. ЭК можно стимулировать высоким светимым стрессом стрижки, физиологическим уровнем трансендотелиального потока и различным распределением VEGF одновременно. Мы подробно описываем шаги по созданию модели MIEN и ключевые моменты, на которые следует обратить внимание, надеясь предоставить рекомендации для других исследователей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка вафель

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол специфичен для СУ-8 2075 отрицательный фоторезист, используемый в ходе этого исследования.

  1. Очистите кремниевую пластину от 3 до 5 раз метанолом и изопропанолом на спиновом пальто следующим образом: сначала вращайся по 15 с при 500 об/мин, а затем вращайся по 60 с при 3000 об/мин.
  2. Перенесите кремниевую пластину на горячую пластину, которая разогревается до 180 градусов по Цельсию и выпекайте в течение 10 минут.
  3. Снимите кремниевую пластину с плиты и охладите ее до комнатной температуры. Очистите снова сжатым воздухом, прежде чем приступить к спиновое покрытие. Нанесите 4 МЛ фоторезист су-8 2075 в центр.
  4. Получить функцию высотой 70 мкм на спину пальто следующим образом: сначала спина для 12 с при 500 об / мин, а затем спина для 50 с при 2100 об / мин.
  5. Мягкая выпечка пластины на плите следующим образом: сначала выпекать в течение 8 мин при температуре 65 градусов по Цельсию, затем выпекать в течение 20 минут при температуре 95 градусов по Цельсию. Затем снимите кремниевую пластину с плиты и охладите ее до комнатной температуры перед литографией.
  6. Поместите фотомаск на фотореалистскую пленку. Выставить пластины с литографии оборудования для достижения общей экспозиции 200 мДж / см2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фотомаска содержит девять наборов узоров чипа, так что он может изготовить девять микрофлюидных прорастания чипов каждый раз.
  7. Сообщение разоблачить на плите следующим образом: сначала выпекать в течение 5 мин при температуре 65 градусов по Цельсию, а затем выпекать в течение 20 минут при температуре 95 градусов по Цельсию. Затем снимите кремниевую пластину с плиты и охладите ее до комнатной температуры перед развитием.
  8. Перенесите пластину на стеклянную чашку Петри, заполненную разработчиком СУ-8 (PGMEA), чтобы начать разработку.
    ВНИМАНИЕ: Разработчик раздражает глаза и дыхательные пути. Выполните развивающихся в дым капот. Носите очки для брызг, нитриленые перчатки и маску авиакомпании во время операции.
  9. Встряхните блюдо осторожно вдоль направления канала потока и изменить разработчика через 10 минут.
  10. Повторите шаг 1,9 3-5 раз, пока шаблоны не будут четко соблюдены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на пластине не осталось остатков фоторезистаста, в противном случае снова промойте пластину у разработчика.
  11. Перенесите пластину на разогретую плиту, установленную до 120 градусов по Цельсию, и выпекайте ее в течение 30 минут.
  12. Pipet 35 йл силана на крышку, а затем положить крышку вместе с пластиной в desiccator и тянуть вакуум. Запечатайте дезикатор и оставьте пластину под вакуумом на 4 ч, чтобы иланизировать пластину, чтобы предотвратить адгезию PDMS во время мягкой литографии процессов.
    ВНИМАНИЕ: Силан токсичен. Чтобы предотвратить отравление, выполнить силанизации в дым капот и носить нитриле перчатки при обработке.
  13. Освободите вакуум от децикатора. Удалите силанизованную пластину на разогретую плиту и выпекайте ее при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 2 ч.
  14. Храните пластину в чистой чашке Петри до тех пор, пока это не потребуется.

2. Микрофлюидное прорастание чипа изготовления

  1. Смешайте 20 г базового агента и 2 г лечебного средства (10:1 соотношение) в пластиковом стакане и тщательно перемешайте их со смешивая стержнем.
  2. Поместите стакан в децикатор и потяните вакуум на 1 ч, чтобы удалить пузырьки воздуха в смеси PDMS.
  3. Налейте смесь PDMS на пластину в чашке Петри и поместите чашку Петри обратно в децикатор, дегазации еще 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать двустороннюю клеевую ленту, чтобы приклеить пластину на дно чашки Петри, чтобы убедиться, что пластина хранится горизонтальной во время дегазации и лечения.
  4. Удалите чашку Петри из децикатора и поместите ее в сухую духовку на 80 градусов по Цельсию на 3 ч для лечения.
  5. Тщательно отделить слой PDMS от и сократить слой до девяти фишек скальпелем в соответствии с шаблоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите функцию на стороне вверх после разделения.
  6. Удар два порта впрыска гидрогеля и четыре порта впрыска мультимедиа из каждого чипа с помощью 1 мм и 3,5 мм биопсии удар, соответственно.
  7. Очистите пролитые чипы с остатками свободной лентой, чтобы удалить остатки PDMS. Поместите чипы и девять стеклянных крышек в плазменный очиститель и обработать их кислородной плазмой в течение 30 с, чтобы сформировать ковалентные связи на поверхности.
  8. Вынул фишки и крышки. Прикрепите сторону функции фишек на крышки.
  9. Поместите прикрепленные чипсы в сухую духовку на 80 градусов Цельсия на 1 ч, чтобы усилить склеивание.
  10. Автоклав чипов перед использованием и держать их стерильными для остальной части процедуры.

3. Модификация поверхности и инъекция гидрогеля

  1. Для каждого чипа, пипетки 40 л 1 мг / мл поли-D-лизин (PDL) и вводить его в каналы в чипе из порта впрыска гидрогеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что PDL заполняет каналы, особенно в узких каналах вблизи портов.
  2. Инкубировать чипы при 37 градусов по Цельсию в течение 4 ч, чтобы изменить поверхность PDMS .
  3. Pipet 200 йл стерильной воды и ввести его в каналы в чипе из порта впрыска гидрогеля, чтобы вымыть PDL.
  4. Удалите чипсы в сухую духовку на 120 градусов Цельсия в течение 3 ч для восстановления гидрофобности.
  5. Поместите на лед стерильную трубку и вычислите объем коллагена типа I, который будет использоваться в качестве следующего уравнения.
    Окончательный объем (50 л) х Окончательная концентрация коллагена (3 мг/мл в этом исследовании) / Концентрация в бутылке и объем коллагена, который будет добавлен
  6. Рассчитайте объем NaOH, который будет использоваться в качестве следующего уравнения.
    (объем коллагена, который будет добавлен) х 0,023 й объем 1 N NaOH
  7. Подготовьте 50 мкл гидрогеля в трубке в качестве следующего протокола: добавьте 5 МКЛ 10хТБ, 0,5 л фенола красного цвета, расчетный объем 1 N NaOH, 4 л 1 мг/мл фибронектина, рассчитанный объем коллагена типа I в свою очередь. Добавьте надлежащее количество dH2O так, чтобы общий объем достиг 50 йл. Смешайте все содержимое в трубке тщательно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все операции на льду. Используйте фенол красный в качестве кислотного индикатора, чтобы помочь в визуальном определении рН гидрогеля. Окончательный гидрогель заканчивается оранжевый, когда рН составляет около 7,4 и жесткость составляет около 15 kPa49.
  8. Pipet 2-3 МКЛ гидрогеля для каждого чипа и медленно вводить его в центральный канал гидрогеля из порта впрыска гидрогеля.
  9. Инкубировать чипсы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы гелеобразование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Печать чипов в запечатанную коробку с 1 мл стерильной воды, если они не используются немедленно. Запечатанные чипы могут храниться при 37 градусах Цельсия не более 24 ч.

4. Посев клеток

  1. Pipet 20 йл из 125 мкг/мл фибронектина в один медиа-инъекционный порт канала клеточной культуры.
  2. Вырежьте наконечник пипетки, чтобы соответствовать порту канала культуры клеток с ножницами.
  3. Вставьте наконечник пипетки в другой порт впрыска мультимедиа канала культуры клеток. Затем, пипетки из воздуха из канала культуры клеток, чтобы заполнить его с Фибронектин.
  4. Инкубировать чипсы при 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
  5. Перед посевом клеток, пипетки 20 йл ECM средств массовой информации в каждом порту впрыска средств массовой информации и инкубировать чипы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
  6. Затем, pipet из всех средств массовой информации во всех портах впрыска средств массовой информации.
  7. Далее, пипетки 5 йл подвески клеток в один порт впрыска средств массовой информации канала культуры клеток. Затем эндотелиальные клетки быстро распространяются по всему каналу под дифференциальным гидростатическим давлением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте подвеску клетки путем trypsinizing людские пупочные клетки вены эндотелиальные (HUVECs) от колбы культуры и центрифугировать их на 400 x g. Затем, повторного перерасхода клеток до 107 клеток / мл в трубке.
  8. Добавьте около 4-6 МКЛ средств массовой информации ECM в другой порт, чтобы настроить гидростатическое давление и остановить перемещение клеток.
  9. Удалите чипы в клеточный инкубатор. Затем переворачивать чипы каждые 30 минут, пока эндотелиальные клетки не покрыть вокруг внутренней поверхности канала культуры клеток 2 ч позже (Рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сделать чип с ног на голову, трубы немного воды на задней части крышки. Затем чип можно прикрепить к крышке чашки Петри.
  10. Используйте наконечник пипетки, чтобы удалить прикрепленные ячейки в инъекционных портах очень тщательно.
  11. Затем вставьте четыре колючие женские адаптеры Luer в порты впрыска мультимедиа и заполните ecM-медиа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптеры могут функционировать как резервуары жидкости, чтобы обеспечить питательные вещества для клеток в канале.
  12. Удалите чипы в клеточный инкубатор. Изменение ECM-медиа в адаптерах Luer каждые 12 ч.

5. Измерение диффузной проницаемости FITC-декстрана

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки барьерной функции микро-сосуда оценивается диффузная проницаемость канала культуры ЕС с или без клеточной подкладки.

  1. Вынюхив микрофлюидный прорастающий чип с инъекционным гидрогелем.
  2. Повторите шаги 4.1-4.6.
  3. Удалите все адаптеры Luer и вывехите все средства массовой информации в четырех портах впрыска мультимедиа.
  4. Поместите чип на конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.
  5. Трубопровод 5 МКЛ культурных средств массовой информации, содержащий 500 мкг/мл 40 кДа FITC-декстран в один порт канала культуры клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 40 kDa FITC-декстран имеет аналогичный молекулярный размер VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Захват изображения каждые 3 с на 30 с. Таким образом, измеряется диффузная проницаемость без клеточной подкладки.
  7. Вынюхив микрофлюидный прорастающий чип после того, как HUVECs совесят в канале культуры клеток.
  8. Повторите шаги 5.3-5.5.
  9. Захват изображения каждые 3 с на 30 с. Таким образом, измеряется диффузная проницаемость с клеточной подкладкой.
  10. Рассчитайте диффузную проницаемость путем количественной оценки изменений флуоресцентной интенсивности с течением времени с помощью следующего измененногоуравнения 50.
    Pd(I2- I1) / ((I1- Ib) Зт) S/d
    где, Pd является диффузным коэффициентом проницаемости, I 1 является средней интенсивностью в начальной точке времени, I 2 являетсясредней интенсивностью после дельтового времени (No), Ib является фоновой интенсивностью, S является областью канала в изображениях флуоресценции, и d является общим интервалом микро-сообщений в флуоресценционных изображениях. В настоящей работе, qt установлен как 9 s.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящее уравнение немного отличается отпервоначального 50, из-за направления диффузии флуоресценции в чипе только от канала ЕС до гидрогеля канала, который не похож на круговой трубки диффузии во всех радиальных направлении.

6. Настройка системы микрофлюидной системы управления

ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидная система управления в настоящем исследовании состоит из микро-шприц насос, электромагнитный клапан щепотку, чип ловушки пузыря, микрофлюидный чип, микроперистальтический насос, и резервуар. Каждая часть системы может быть заменена альтернативами, способными выполнять ту же функцию.

  1. Изготовление чипов пузырчатой ловушки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чип ловушки пузыря используется для удаления пузырьков воздуха в обращении. Чип состоит из трех слоев PDMS. Верхний слой построен с использованием мягкой литографии для формирования структуры сетки в качестве жидкой камеры. Ширина каждого канала сетки составляет 100 мкм. Нижний слой представляет собой кусок PDMS с отверстием. Между двумя слоями, 100 мкм тонкая пленка PDMS укладывается.
    1. Повторите шаг 1, чтобы подготовить пластину для чипа ловушки пузыря.
    2. Повторите шаги 2.1-2.5, чтобы изготовить верхний слой и нижний слой чипа ловушки пузыря.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фотомаска верхнего слоя содержит три набора узоров, поэтому разрежьте слой PDMS до трех фишек в соответствии с шаблоном.
    3. Удар шесть отверстий на конце входных и розетки каналов верхнего слоя с помощью 3,5 мм биопсии удар.
    4. Удар два отверстия на соответствующем положении нижнего слоя с помощью 6 мм биопсии удар в соответствии с рисунком на верхнем слое.
    5. Повторите шаги 2.1-2.2, чтобы подготовить 10 г смеси PDMS и залить его по центру очищенной кремниевой пластины.
    6. Изготовить 100 мкм PDMS фильм, применяя следующий протокол спина: спина для 15 с при 500 об /мин, увеличить скорость спина до 1300 об / мин и провести здесь 45 с.
    7. Перенесите пластину на разогретую плиту, установленную до 180 градусов по Цельсию, и выпекайте ее в течение 30 минут.
    8. Очистите пролитые слои без остатков лентой, чтобы удалить остатки PDMS. Поместите верхние слои и в плазменный очиститель и обработать их кислородной плазмой в течение 30 с, чтобы сформировать ковалентные связи на поверхности.
    9. Вынюхив верхние слои и. Прикрепите сторону функции верхних слоев на пленку PDMS.
    10. Аккуратно вырежьте пленку по краю верхних слоев иглой.
    11. Медленно отделить пленку от и перевернуть фишки, чтобы сделать пленку стороне вверх после разделения.
    12. Поместите нижние слои и прикрепленные чипы в плазменный очиститель и обработать их кислородной плазмой в течение 30 с снова.
    13. Вывихим нижние слои и прикрепленные фишки. Прикрепите нижние слои на пленку PDMS и чипы ловушки пузыря сделаны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выравнивание отверстий на нижнем слое с узорами на верхнем слое при присоединении.
    14. Поместите чипсы в сухую духовку на 80 градусов по Цельсию на 1 ч, чтобы усилить склеивание.
  2. Сборка системы микрофлюидного управления
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все части системы, такие как чип ловушки пузыря, резервуар, трубки и разъемы используются после стерилизации автоклава, за исключением электронного оборудования. Соберите микрофлюидную систему управления на чистой скамейке.
    1. Для сборки микрофлюидной системы управления подготовьем две полиэтиленовые трубки, две короткие силиконовые трубки, три длинные силиконовые трубки, один женский адаптер Luer с колючей колючей проволокой, один разъем типа Y и три разъема типа L.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Преимуществом полиэтиленовой трубки является низкая эластичность, поэтому в трубопроводе требуется меньше средств массовой информации. Силиконовая трубка, напротив, имеет высокую эластичность, поэтому подходит для щепотки клапана и перистрального насоса.
    2. Заполните шприц 10 мл разогретой (37 градусов по Цельсию) среды ECM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разогрев помогает среднему высвобождению растворенного газа.
    3. Подключите полиэтиленовую трубку к шприцу с помощью колючего женского адаптера Luer. Затем соедините другой конец полиэтиленовой трубки с разъемом типа Y.
    4. Затем соедините две длинные силиконовые трубки с двумя другими концами разъема типа Y с одной трубкой, соединяющейся с резервуаром, а другая трубка, соединяющаяся с чипом ловушки пузыря.
    5. Подключите к резервуару еще одну длинную силиконовую трубку.
    6. Далее используйте две короткие силиконовые трубки, чтобы соединить все входные и выходные отверстия на верхнем слое чипа ловушки пузыря. Подключите полиэтиленовую трубку к бэкэнду чипа.
    7. Затем зафиксв шприц на насосе микро-шприца.
    8. Зарезать две длинные силиконовые трубки в электромагнитный клапан щепотку.
    9. Затем переключитесь электромагнитный клапан щепотки, чтобы открыть трубопровод между шприцем и резервуаром. Ввимите средства массовой информации в резервуар с помощью микро-шприц насоса, чтобы исчерпать воздух в трубке.
    10. Затем снова переключитесь на клапан, чтобы открыть трубопровод между шприцем и чипом ловушки пузыря. Ввените средства массовой информации для заполнения жидкой камеры и бэкэнд трубки чипа ловушки пузыря.

7. Эндотелиальный прорастания анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании используется верхний инкубатор, собранный с помощью фазового контрастного микроскопа для наблюдения за процессом прорастания в режиме реального времени. Верхний инкубатор стадии может поддерживать температуру, влажность и CO2 контроль на стадии микроскопа, будучи хорошим для живой визуализации клеток. Но оборудование не является необходимым для анализа. Протоколы, представленные здесь, также могут быть проработаны в базовом клеточном инкубаторе.

  1. Вынул эндотелиальные прорастания чипов из клеточного инкубатора.
  2. Затем удалите адаптеры Luer со стороны клеточной культуры. Вставьте две трубы пробки в гидрогель инъекционных портов микрофлюидных прорастания чипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробки могут трансформироваться из игл, и их основная функция заключается в предотвращении разлива средств массовой информации.
  3. Подключите бэкэнд трубку чипа ловушки пузыря к одному порту канала культуры клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что есть нет пузырьков в трубке перед подключением.
  4. Вставьте разъем типа T в другой порт и соедините его с длинной силиконовой трубкой, подключенной к резервуару.
  5. Затмите длинную силиконовую трубку в микро-перистралтический насос.
  6. Затем вставьте воздушный фильтр в резервуар.
  7. Затем соберите микрофлюидный прорастающий чип в верхний инкубатор сцены.
  8. Затем подключите вакуумный насос к отверстиям в нижнем слое чипа пузырчатой ловушки с трубкой TPU.
  9. Настройка объема циркуляции и скорости потока в пользовательской программе, которая контролирует микро-шприц насоса и электромагнитного клапана щепотку одновременно(рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока через эндотелиальный канал культуры клеток рассчитывается в соответствии с классическим уравнением.
    6 евро / Втч2
    где, является стресс стрижки (дин /см 2), μ является вязкость среды (8,8 х 10-4 па), является скорость потока через эндотелиальный канал культуры клеток (мл/с), ч является высота канала (70 мкм), и W является ширина канала (1000 мкм). Вязкость среды измеряется с помощью коаксиального типа цилиндра вращательного вискометра. Высота и ширина канала предопределены и вручную подтверждаются с помощью фазового контрастного микроскопа при 4x увеличении. Объем циркуляции составляет 5 мл, а скорость потока составляет 85 мкл/мин (в среднем 0,2 м/с в канале клеточной культуры) для 15дин/см 2 стрижки стресса в соответствии с расчетами.
  10. Далее налачат скорость потока микро-перистального насоса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока микро-перистрального насоса немного выше, чем микро-шприц насос, с тем чтобы предотвратить утечку средств массовой информации.
  11. Включите насос микро-шприца. Затем устанавливается система контроля циркуляции.

8. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки ростков была рассчитана нормализованная площадь прорастания, средняя длина ростка и длинная длина ростка. Результаты представляют собой среднее ± SEM, полученное в результате трех независимых исследований. Статистическая значимость (< 0,05) оценивается студенческимт-тестом.

  1. Исправить клетки и ростки в микрофлюидных прорастания чип после экспериментов с 4% параформальдегида в PBS в течение 15 мин. Пятно ядра с 4 ",6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI; 1: 1000; Сигма-Олдрич) в течение 10 мин, а затем пятно цитоскелет с фаллоидином TRITC (P5285, 1: 100; Сигма-Олдрич) за 1 ч. Вымойте клетки с PBS три раза с интервалом в 5 минут между каждым шагом.
  2. Возьмите конфокальные изображения чипов в режиме плитки и сшить их с помощью программного обеспечения для редактирования изображений.
  3. Подсчитайте количество флуоресцентных пикселей изображений с помощью пользовательского кода в программном обеспечении программирования для количественной оценки нормализованной области прорастания (см. Дополнительный файл).
  4. Вручную определить и обозначить каждый кончик ростков в проекционных изображениях и рассчитать расстояния между кончиками ростков до мембраны подвала ECs, используя другой пользовательский код для количественной оценки средней длины ростка и длины длинной длины ростка (см. Дополнительный файл).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленная здесь 3D-модель in vitro, имитирующая первоначальное событие неоваскуляризации (MIEN), состояла из микрофлюидного прорастания чипа и микрофлюидной системы управления. Микрофлюидный прорастающий чип был оптимизирован изпредыдущих публикаций 22,23,37,40,51,52,53. Короче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Долгое время наблюдение за неоваскуляризацией в режиме реального времени было проблемой. Несколько подходов были разработаны в последнее время для создания перфлитированных сосудов накладки с ECs и прилегающих к внеклеточнойматрицы для прорастания 22,32,40,46,54, но механическое микроокнижение по-прежнему трудно поддерживать постоянно. По-прежнему трудно имити...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом исследований естественных наук Китая Гранты в помощь (грант No 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 и 32071311), Национальная ключевая программа исследований и разработок Китая (грант No 2016YFC1101101 и 2016YFC1102202), проект 111 (B13003) и Пекинский фонд естественных наук (4194079).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Трипсин-ЭДТАGenviewGP3108
Коллаген I, крысиный хвостCorning354236
DAPISigma-AldrichD9542
Электромагнитный пережимной клапанWokun TechnologyWK02-308-1/3
Эндотелиальная клеточная среда (ECM)Sciencell1001
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Every GreenNA
FibronectinCorning354008
FITC-dextranMiragen60842-46-8
Графическая среда программированияLab VIEWNA
Программное обеспечение для редактирования изображенийPhotoShopNA
Программа обработки изображенийImageJNA
ИзопропанолSigma-Aldrich91237
Оборудование для литографииИнститут оптики и электроники Китайской академии наукURE-2000/35
МетанолSigma-Aldrich82762
Микроперистальтический насосСвинцовая жидкостьBT101L
Микрошприцевой насосСвинцовая жидкостьTYD01
Кислородная плазмаMING HENGPDC-MG
ПараформальдегидSigma-AldrichP6148
PBS (10x)BeyotimeST448
Постоянный эпоксидный негативный фоторезистMicrochemSU-8 2075
Фенол Красная натриевая сольSigma-AldrichP5530
Полидиметилсилоксан (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Поли-D-лизина гидробромид (PDL)Sigma-AldrichP7886
ПолитетрафторэтилентефлонNA
Программное обеспечениеMATLABNA
Рекомбинантный человеческий VEGF-165StemImmune LLCHVG-VF5
Гидроксид натрия (NaOH)Sigma-Aldrich1.06498
Топовый инкубаторTokai HitNA
SU-8 проявительMicrochemNA
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)силанSigma-Aldrich448931
TRITC PhalloidinSigma-AldrichP5285

Ссылки

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261(1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249(2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209(2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869(2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56(2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737(2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880(2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092(2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657(2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046(2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863(2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64(2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443(2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188(1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Механизм неоваскуляризацииэндотелиальные клеткимикрофлюидный чип для моделирования спрутинганапряжение сдвигатрансэндотелиальный потокфактор роста эндотелия сосудовперфузируемый микроканаланализ эндотелиального спрутингаплатформа для скрининга лекарственных препаратов
Микрофлюидная модель для имитации первоначального события неоваскуляризации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.