Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Для углубленного механистического анализа синтеза РНК респираторно-синцитиального вируса (RSV) мы сообщаем протокол использования шаперон-фосфопротеина (P) для коэкспрессии свободного от РНК нуклеопротеина (N⁰⁾для последующей сборки in vitro вирус-специфических нуклеокапсидов (НК).

Abstract

Использование аутентичного шаблона РНК имеет решающее значение для продвижения фундаментальных знаний о синтезе вирусной РНК, которые могут направлять как механистическое открытие, так и разработку анализов в вирусологии. РНК-шаблон несегментированных РНК-вирусов с отрицательным смыслом (NNS), таких как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), представляет собой не только молекулу РНК, а скорее инкапсидированный комплекс рибонуклеопротеинов нуклеопротеинов (N). Несмотря на важность аутентичного шаблона РНК, генерация и сборка такого рибонуклеопротеинового комплекса остаются сложными и требуют глубокого выяснения. Основная проблема заключается в том, что сверхэкспрессированный RSV N связывается не зреть с клеточными РНК с образованием случайных нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP). Здесь мы установили протокол для получения^N(N0)без РНК сначала путем совместной экспрессии N с шапероном фосфопротеином (P), затем сборки N⁰ с олигосами РНК с RSV-специфической последовательностью РНК для получения вирус-специфических нуклеокапсидов (НК). Этот протокол показывает, как преодолеть трудности в приготовлении этого традиционно сложного вирусного рибонуклеопротеинового комплекса.

Introduction

Несегментированные РНК-вирусы отрицательного смысла (NNS) включают в себя многие значимые патогены человека, такие как бешенство, Эбола и респираторно-синцитиальный вирус (RSV)^1,2. РСВ является основной причиной респираторных заболеваний, таких как бронхиолит и пневмония у маленьких детей и пожилых людей во всем мире³. В настоящее время нет эффективных вакцин или противовирусных препаратов для профилактики или лечения RSV^4. Как часть жизненного цикла, геном RSV служит шаблоном для репликации RSV-РНК-зависимой РНК-полимеразой для получения антигенома, который, в свою очередь, действует как шаблон для генерации генома потомства. Как геномные, так и антигеномные РНК полностью инкапсированы нуклеопротеином (N) с образованием нуклеокапсидов^{(НК) 3.} Поскольку НК служат шаблонами как для репликации, так и для транскрипции полимеразой RSV, правильная сборка NC имеет решающее значение для полимеразы, чтобы получить доступ к шаблонам синтеза РНК^5. Интересно, что на основе структурного анализа вирусных полимераз NNS предполагается, что несколько N-белков временно диссоциируют от НК, чтобы обеспечить доступ полимеразы и повторно привязываться к РНК после синтеза РНК^{6,7,8,9,10,11,12.}

В настоящее время установлен анализ полимеризации РНК РСВ с использованием очищенной РСВ-полимеразы на коротких голых РНК-шаблонах^13,14. Однако активность РСВ-полимеразы не достигает оптимального, как это наблюдается в необрабатывающих и абортивных продуктах, образующихся RSV-полимеразой при использовании голых шаблонов РНК. Отсутствие NC с вирус-специфической РНК является основным барьером для дальнейшего механистического понимания синтеза РНК RSV. Поэтому использование аутентичного шаблона РНК становится критической необходимостью для продвижения фундаментальных знаний о синтезе РНК RSV. Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) из RSV и других РНК-вирусов NNS показывают, что РНК в NCLP являются либо случайными клеточными РНК, либо средними вирусными геномными РНК^{15,16,17,18,19.} В совокупности основное препятствие заключается в том, что N связывается не специфически с клеточными РНК, образуя NCLP, когда N чрезмерно экспрессируется в клетках-хозяевах.

Чтобы преодолеть это препятствие, мы установили протокол для получения без РНК (N⁰⁾и сборки N⁰ с подлинной вирусной геномной РНК в NCLP^20. Принцип этого протокола заключается в получении большого количества рекомбинантного РНК-свободного N^(N0)путем совместной экспрессии N с шапероном, N-концевым доменом RSV фосфопротеина (P_NTD). Очищенный N 0 P может^бытьстимулирован и собран в NCLP путем добавления RSV-специфических олигов РНК, и во время процесса сборки шаперон P_NTD смещается при добавлении ОлигоС РНК.

Здесь мы подробно описываем протокол для генерации и сборки РНК-специфических для RSV НК. В этом протоколе мы описываем молекулярное клонирование, подготовку белка, сборку in vitro и валидацию сложной сборки. Выделена стратегия клонирования для создания бицистронных конструкций для коэкспрессии белка для молекулярного клонирования. Для приготовления белка мы описываем процедуры клеточной культуры, экстракции белка и очистки белкового комплекса. Затем мы обсудим метод сборки in vitro РНК-специфических НК RSV. Наконец, мы используем хроматографию исключения размеров (SEC) и электронную микроскопию с отрицательным пятном (EM) для характеристики и визуализации собранных NCLP.

Protocol

1. Молекулярное клонирование ПРИМЕЧАНИЕ: Независимое клонирование лигазы (LIC) использовалось для создания плазмиды бицистронной коэкспрессии RSV. LIC – это метод, разработанный в начале 1990-х годов, который использует активность 3′-5′ Экзо ДНК-полимеразы Т4 для создания свесов с комплементарностью между вектором и днк-вставкой21,22. Конструкции были сделаны с использованием векторной ДНК 2BT-10, которая состоит из 10-кратной метки His на N-терминале open reading Frame (ORF)(рисунок 1). Выполнение линеаризации векторов LIC с использованием СБРАЖИвания SSPI. Комбинируют 10 мкл буфера SSPI 10X, 4 мкл фермента SSPI в концентрации 5 Ед/мкл, эквивалентный объему 5 мкг векторной минипрепной ДНК и стерильный ddHот 2O до 100 мкл. Инкубировать перевар в течение 3 часов при 37 °C. Запустите дайджест на 1,0% агарозном гелевом для экстракции векторной ДНК. Используйте набор для экстракции геля для экстракции и очистки. Приостановить конечный объем векторной ДНК в 30 мкл ddH2O и сохранить его при -20 °C. Подготовьте вставки ДНК для N1-391 и P1-126 с использованием N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer и P1-126 Reverse Primer(таблица 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Существует достаточное перекрытие с линеаризованным вектором для обеспечения температуры плавления от 55 °C до 60 °C. Для обратной грунтовки имеется достаточное перекрытие с обратной комплементарной нитью линеаризированного вектора по той же причине. Выполняют ПЦР-амплификацию ДНК-вставки с использованием условий, приведенных в таблице 2 и таблице 3. Извлеките амплифицированную днк-вставку. Запустите продукты ПЦР с предыдущего этапа на 1,0% агарозном гелевом, затем извлеките и очистите полосы путем экстракции геля. Приостановить конечный объем экстрагированной ДНК в 15 мкл ddH2O. Т4 ДНК-полимеразная обработка векторной и вставной ДНК(табл. 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение должно проводиться отдельно для векторной ДНК и вставленной ДНК. Инкубировать смесь в течение 40 минут при комнатной температуре. Затем нагревают-инактивируют полимеразу при 75 °C в течение 20 минут. Хранить реакционную смесь при -20 °C. Отжиг вектора LIC и вектора вставки. Установите отрицательный контроль с 2 мкл векторной ДНК LIC и 2 мкл стерильного ddH2O. Объедините 2 мкл вставной ДНК и 2 мкл векторной ДНК LIC из предыдущих ДНК-полимеразных реакций Т4 в пробирке 0,2 мл. Выполните реакцию отжига при комнатной температуре в течение 10 минут. Утвенить реакцию 1,3 мкл ЭДТА в концентрации 25 мМ. Преобразуйте реакцию в 100 мкл E. coli Top10 компетентных клеток и нарежьте их на ампициллиновую селекционную пластину23,24. Определите позитивные конструкции. Приготовьте раствор плазмидного минипрепа. Это может быть сделано путем сбора колоний и прививки в среде LB. Обычно достаточно 3 колоний. Инкубировать смесь в течение ночи при 37 °C. Центрифугировать смесь при 4,560 х г в течение 10 минут и выбросить супернатант. Повторно суспендировать гранулы в 250 мкл буфера P1 и приготовить плазмидные минипрепы с помощью комплекта для отжима минипрепа. Проведите анализ пищеварения продукта miniprep с использованием AseI или других ферментов рестрикции. Загрузите образцы на 0,8% агарозного геля и запустите переваренные плазмиды. Проанализируйте гель под УФ-лампой. Используйте службу виртуализации для проверки последовательности положительного продукта. Получите коэкспрессионную вставку ДНК. Выполняют ПЦР для полученияN1-391 и P1-126, используя в качестве шаблонов ранее построенные 2BT-10 N1-391 и 2BT-10 P1-126. Выполнение1-й ПЦР для полученияN1-391 из конструкции 2BT-10 N1-391 с использованием условий ПЦР в Таблице 2 и Таблице 3 с N1-391 Форвардной праймерой и Обратной грунтовкой 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCGCGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́. Выполните2-ю ПЦР для получения P1-126 из конструкции 2BT-10 P1-126 с помощью Праймера: 5′-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGCAGGACTCGAGTTCTAGA-3 и P1-126 Обратная праймера (используйте условия ПЦР в таблице 2 и таблице 3). Наконец, выполняют перекрывающуюся ПЦР на смешанных продуктах предыдущих 2 реакций ПЦР для слиянияN1-391 иР1-126. Используйте грунтовку N1-391 и обратную грунтовку P1-126. Используйте условия ПЦР в таблице 5 и таблице 6. Соединяйте вектор и вставку ДНК. Обработайте перекрывающиеся продукты ПЦР ДНК-полимеразой Т4 в соответствии с протоколом на этапе 1.3. Отжиг вектора КСЖ и продукта ПЦР в соответствии с протоколом на этапе 1.4. Определите положительные конструкции, следующие протоколу на шаге 1.5. 2. Экспрессия и очистка белка ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте E. coli для бицистронной конструкции коэкспрессии как N, так и P. Культивирует клетки при 37 °C, но проводит экспрессию при пониженной температуре (16 °C) в течение ночи. Очищают белковые комплексы с помощью комбинации кобальтовой колонки, ионного обмена и размерной исключаемой хроматографии(рисунок 2). Используйте штамм E. coli BL21(DE3) для производства белка. Выращивайте 4 L клеточных культур при 37 °C в среде LB (Luria Broth) до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,6. Понизьте температуру до 16 °C. Через час индуцируют экспрессию с помощью 0,5 мМ изопропил 1-тио–D-галактопиранозида (IPTG) в течение ночи. Центрифугируют ячейки при 4,104 х г в течение 25 мин, а затем отбрасывают супернатант. Повторно суспендировать клеточные гранулы в 200 мл лизисного буфера А (50 мМ фосфата натрия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, 10% глицерина и 0,2% NP40). Используйте 50 мл лизисного буфера для повторного суспендирования клеточных гранул из 1 л клеточной культуры. Различите клетки ультразвуком в течение 15 минут, 3 секунды включено и 3 секунды выключено. Затем центрифужные ячейки при 37,888 х г в течение 40 мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания клеток перед ультразвуком в морозильной камере с температурой -80 °C. Загрузите супернатант в кобальтовую гравитационную колонну (диаметр х длина: 2,5 см х 10 см) с ~10 мл бусин, предварительно уравновешенных 5-10 колонными объемами (CV) лизисного буфера. Промыть колонку 5 CV буфера B (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 1 М NaCl, 10% глицерина и 5 мМ имидазола) и 5 CV буфера C (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 5 мМ имидазола). Элюдирует белок из шариков, используя 2 CV буфера D (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазола). Разбавляют элюированный белок 5x буфером QA (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 5% глицерина) для колонки Q. Промыть 5 мл колонны Q буфером QA, чтобы уравнять колонну, затем загрузить разбавленный образец в колонну Q с помощью перистальтического насоса (например, Rabbit). Загрузите колонку Q в машину ВЭЖХ вместе с буфером QA и буфером QB (50 мМ Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% глицерин). Установите скорость потока 1 мл/мин. Запустите программу «стирка насоса», чтобы постирать машину с буфером QB, за которым следует буфер QA (1-2 резюме / каждый). Установите расход системы на 3 мл/мин. Установите UV1 на 280 нм и UV2 на 260 нм. Используйте 96 пластин глубокой скважины для сбора фракций. Элюируют белки с помощью ступенчатого градиента элюирующего агента (QB Buffer), применяя 3-4 CV от каждой концентрации, увеличивая процент на 5% каждый раз, начиная с 0% QB. Белковый комплекс N0P выйдет на 15% QB Buffer. После того, как весь белок элюирован, промыть колонку 100% буфером QB (2 CV). Выделяют белок путем гелевой фильтрации Superdex 200 Увеличение 10/300 GL колонки (диаметр х длина: 1,0 см х 30 см) и уравновешивать буфером E (20 мМ HEPES pH 7,4 и 200 мМ NaCl). Анализ белковосодержащих фракций с помощью SDS-PAGE. 3. Сборка in vitro вирус-специфического NC ПРИМЕЧАНИЕ: Сборку in vitro РСВ-специфического NC (N:РНК) проводили путем инкубации подготовленного комплекса N0P с Олигосом РНК. Затем хроматография SEC была использована для отделения сборочного комплекса от N0P и избыточной РНК(рисунок 2). Смешайте и инкубируют очищенный комплекс N0P с Олиго РНК с молекулярным соотношением 1:1,5 при комнатной температуре в течение 1 часа, обычно для следующего этапа достаточно 1 мл белкаN0P с концентрацией 1 мг/мл. Настройте контрольный образец, который содержит только такое же количество белка N0P. Предварительно уравновешивают гель фильтрацию Superdex 200 Увеличение 10/300 GL колонки с буфером E (20 мМ HEPES, рН 7,4, 200 мМ NaCl). Центрифугировать образец с 21 130 х г в течение 15 мин, удалить любые осадки и загрузить супернатант в колонну SEC. Сравните хроматографические изображения SEC образца сборки N:РНК и контрольного образца N0P, объедините соотношение A260/A280, чтобы определить, какие пики являются собранными N-РНК, N0P и свободной РНК. Соберите пиковые фракции, запустите гель SDS-PAGE или сделайте сетки. Для сборки комплекса N-РНК соберите все фракции пика N-РНК, сделайте экстракцию РНК и запустите гель Urea-PAGE, чтобы дважды проверить длину специфической РНК, которая такая же, как смешанная и инкубированная на первом этапе. 4. Изготовление отрицательных пятен сетки ПРИМЕЧАНИЕ: Электронная микроскопия отрицательных пятен (ЭМ) представляет собой метод, при котором молекулы адсорбируются в углеродную пленку, а затем встраиваются в слой атомов тяжелых металлов. Отрицательное пятно EM создает высокий контраст изображения, что позволяет легко видеть и вычислительно выравнивать частицы. Другим преимуществом является то, что адсорбция частиц к углеродной пленке обычно побуждает молекулы прилипать к сетке с несколькими предпочтительными ориентациями. Когда молекулы находятся в одинаковой ориентации, их легко разделить на структурно различные классы. Таким образом, отрицательное окрашивание ЭМ является подходящим методом для руководства пробоподготовкой25,26 (рисунок 3). Микроволновая печь или нагрейте 5 мл ddH2O в небольшом стеклянном стакане с помощью вольфрамового нагревателя до тех пор, пока он не закипит. Взвесите 37,5 мг уранилфоримата и добавьте к 5 мл нагретого ddH2O, чтобы получить 0,75% раствор для окрашивания уранилформата. Перемешайте под покрытым алюминиевой фольгой мукером для защиты от света. Добавьте 4 мкл 10 М NaOH в окрашивающий раствор и продолжайте перемешивать в течение 15 мин, защищенных от света. Процедить раствор через фильтр 0,22 мм в пробирку. Используйте тлеющий разряд, чтобы сделать непрерывные электромагнитные решетки с углеродным покрытием гидрофильными27.ПРИМЕЧАНИЕ: Сети размещены внутри камеры, подключенной к источнику питания. При подаче высокого напряжения газ в камере ионизируется, а отрицательно заряженные ионы осаживаются на углеродных решетках, чтобы сделать их гидрофильными. Вырежьте и сложите полоску парапленки. Пипетировать 2 капли по 40 мкл буфера с одной стороны парапленки, а пипетировать еще 2 капли по 40 мкл окрашивающего раствора на другую сторону. Чтобы сделать эм-углеродные решетки, нанесите 3 мкл образца белка на 1 минуту. Смажь сетки на промокающей бумаге.ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки промывают 2 раза буфером и 1 раз с 0,75% раствором для окрашивания уранилформата, промокающим после каждой ступени. Подержите поверхность сетки во второй капле 0,75% раствора для окрашивания уранилформата в течение 30 секунд. Промокните сетку о промокающую бумагу, чтобы удалить лишний раствор пятен и дать сетке высохнуть на воздухе. Сохраните сетки в поле сетки перед созданием изображения.

Representative Results

Очистка не-РНК-свободного N0P белкаС помощью этого протокола можно получить крупномасштабный растворимый гетеродимерный комплекс RSV N0P. Полная длина N и N концевой части P-белков была совместно экспрессирована с 10X His-Tag на N-белке в E. coli. N0P очищали с помощью…

Discussion

Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) несегментированных РНК-вирусов отрицательного смысла (NNS) показывают, что собранные NCLP представляют собой комплекс N с клеточными РНК хозяина при сверхэкспрессии в бактериальных или эукариотических системах экспрессии^15,…

Materials

Agarose	SIgma	A9539-500G	making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC901024	concentrate the protein sample
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antibiotic for cell culture
AseI	NEB	R0526S	making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	Heate the sample
dCTP	Invitrogen	10217016	making construct using LIC method
dGTP	Invitrogen	10218014	making construct using LIC method
Glycerol	Sigma	G5516-4L	making solution
HEPES	Sigma	H3375-100G	making solution
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Protein purification
Imidazole	Sigma	I5513-100G	making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonicator for lysing cell
Negative stain grids	Electron Microscopy Sciences	CF400-Cu-TH	For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	making solution
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	Purify DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Protein purification
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	making solution
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22451	making negative stain solution