Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация и сборка вирус-специфических нуклеокапсидов респираторно-синцитиального вируса

3.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62010

⸱

27 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Emory University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Для углубленного механистического анализа синтеза РНК респираторно-синцитиального вируса (RSV) мы сообщаем протокол использования шаперон-фосфопротеина (P) для коэкспрессии свободного от РНК нуклеопротеина (N0)для последующей сборки in vitro вирус-специфических нуклеокапсидов (НК).

Аннотация

Использование аутентичного шаблона РНК имеет решающее значение для продвижения фундаментальных знаний о синтезе вирусной РНК, которые могут направлять как механистическое открытие, так и разработку анализов в вирусологии. РНК-шаблон несегментированных РНК-вирусов с отрицательным смыслом (NNS), таких как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), представляет собой не только молекулу РНК, а скорее инкапсидированный комплекс рибонуклеопротеинов нуклеопротеинов (N). Несмотря на важность аутентичного шаблона РНК, генерация и сборка такого рибонуклеопротеинового комплекса остаются сложными и требуют глубокого выяснения. Основная проблема заключается в том, что сверхэкспрессированный RSV N связывается не зреть с клеточными РНК с образованием случайных нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP). Здесь мы установили протокол для полученияN(N0)без РНК сначала путем совместной экспрессии N с шапероном фосфопротеином (P), затем сборки N0 с олигосами РНК с RSV-специфической последовательностью РНК для получения вирус-специфических нуклеокапсидов (НК). Этот протокол показывает, как преодолеть трудности в приготовлении этого традиционно сложного вирусного рибонуклеопротеинового комплекса.

Введение

Несегментированные РНК-вирусы отрицательного смысла (NNS) включают в себя многие значимые патогены человека, такие как бешенство, Эбола и респираторно-синцитиальный вирус (RSV)1,2. РСВ является основной причиной респираторных заболеваний, таких как бронхиолит и пневмония у маленьких детей и пожилых людей во всем мире3. В настоящее время нет эффективных вакцин или противовирусных препаратов для профилактики или лечения RSV4. Как часть жизненного цикла, геном RSV служит шаблоном для репликации RSV-РНК-зависимой РНК-полимеразой для получения антигенома, который, в свою очередь, действует как шаблон для генерации генома потомства. Как геномные, так и антигеномные РНК полностью инкапсированы нуклеопротеином (N) с образованием нуклеокапсидов(НК) 3. Поскольку НК служат шаблонами как для репликации, так и для транскрипции полимеразой RSV, правильная сборка NC имеет решающее значение для полимеразы, чтобы получить доступ к шаблонам синтеза РНК5. Интересно, что на основе структурного анализа вирусных полимераз NNS предполагается, что несколько N-белков временно диссоциируют от НК, чтобы обеспечить доступ полимеразы и повторно привязываться к РНК после синтеза РНК6,7,8,9,10,11,12.

В настоящее время установлен анализ полимеризации РНК РСВ с использованием очищенной РСВ-полимеразы на коротких голых РНК-шаблонах13,14. Однако активность РСВ-полимеразы не достигает оптимального, как это наблюдается в необрабатывающих и абортивных продуктах, образующихся RSV-полимеразой при использовании голых шаблонов РНК. Отсутствие NC с вирус-специфической РНК является основным барьером для дальнейшего механистического понимания синтеза РНК RSV. Поэтому использование аутентичного шаблона РНК становится критической необходимостью для продвижения фундаментальных знаний о синтезе РНК RSV. Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) из RSV и других РНК-вирусов NNS показывают, что РНК в NCLP являются либо случайными клеточными РНК, либо средними вирусными геномными РНК15,16,17,18,19. В совокупности основное препятствие заключается в том, что N связывается не специфически с клеточными РНК, образуя NCLP, когда N чрезмерно экспрессируется в клетках-хозяевах.

Чтобы преодолеть это препятствие, мы установили протокол для получения без РНК (N0)и сборки N0 с подлинной вирусной геномной РНК в NCLP20. Принцип этого протокола заключается в получении большого количества рекомбинантного РНК-свободного N(N0)путем совместной экспрессии N с шапероном, N-концевым доменом RSV фосфопротеина (PNTD). Очищенный N 0 P можетбытьстимулирован и собран в NCLP путем добавления RSV-специфических олигов РНК, и во время процесса сборки шаперон PNTD смещается при добавлении ОлигоС РНК.

Здесь мы подробно описываем протокол для генерации и сборки РНК-специфических для RSV НК. В этом протоколе мы описываем молекулярное клонирование, подготовку белка, сборку in vitro и валидацию сложной сборки. Выделена стратегия клонирования для создания бицистронных конструкций для коэкспрессии белка для молекулярного клонирования. Для приготовления белка мы описываем процедуры клеточной культуры, экстракции белка и очистки белкового комплекса. Затем мы обсудим метод сборки in vitro РНК-специфических НК RSV. Наконец, мы используем хроматографию исключения размеров (SEC) и электронную микроскопию с отрицательным пятном (EM) для характеристики и визуализации собранных NCLP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Молекулярное клонирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Независимое клонирование лигазы (LIC) использовалось для создания плазмиды бицистронной коэкспрессии RSV. LIC - это метод, разработанный в начале 1990-х годов, который использует активность 3'-5' Экзо ДНК-полимеразы Т4 для создания свесов с комплементарностью между вектором и днк-вставкой21,22. Конструкции были сделаны с использованием векторной ДНК 2BT-10, которая состоит из 10-кратной метки His на N-терминале open reading Frame (ORF)(рисунок 1).

  1. Выполнение линеаризации векторов LIC с использованием СБРАЖИвания SSPI.
    1. Комбинируют 10 мкл буфера SSPI 10X, 4 мкл фермента SSPI в концентрации 5 Ед/мкл, эквивалентный объему 5 мкг векторной минипрепной ДНК и стерильный ddHот 2O до 100 мкл.
    2. Инкубировать перевар в течение 3 часов при 37 °C.
    3. Запустите дайджест на 1,0% агарозном гелевом для экстракции векторной ДНК.
    4. Используйте набор для экстракции геля для экстракции и очистки. Приостановить конечный объем векторной ДНК в 30 мкл ddH2O и сохранить его при -20 °C.
  2. Подготовьте вставки ДНК для N1-391 и P1-126 с использованием N1-391 Forward Primer, N1-391 Reverse Primer, P1-126 Forward Primer и P1-126 Reverse Primer(таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует достаточное перекрытие с линеаризованным вектором для обеспечения температуры плавления от 55 °C до 60 °C. Для обратной грунтовки имеется достаточное перекрытие с обратной комплементарной нитью линеаризированного вектора по той же причине.
    1. Выполняют ПЦР-амплификацию ДНК-вставки с использованием условий, приведенных в таблице 2 и таблице 3.
    2. Извлеките амплифицированную днк-вставку. Запустите продукты ПЦР с предыдущего этапа на 1,0% агарозном гелевом, затем извлеките и очистите полосы путем экстракции геля. Приостановить конечный объем экстрагированной ДНК в 15 мкл ddH2O.
  3. Т4 ДНК-полимеразная обработка векторной и вставной ДНК(табл. 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение должно проводиться отдельно для векторной ДНК и вставленной ДНК.
    1. Инкубировать смесь в течение 40 минут при комнатной температуре. Затем нагревают-инактивируют полимеразу при 75 °C в течение 20 минут. Хранить реакционную смесь при -20 °C.
  4. Отжиг вектора LIC и вектора вставки.
    1. Установите отрицательный контроль с 2 мкл векторной ДНК LIC и 2 мкл стерильного ddH2O.
    2. Объедините 2 мкл вставной ДНК и 2 мкл векторной ДНК LIC из предыдущих ДНК-полимеразных реакций Т4 в пробирке 0,2 мл.
    3. Выполните реакцию отжига при комнатной температуре в течение 10 минут.
    4. Утвенить реакцию 1,3 мкл ЭДТА в концентрации 25 мМ.
    5. Преобразуйте реакцию в 100 мкл E. coli Top10 компетентных клеток и нарежьте их на ампициллиновую селекционную пластину23,24.
  5. Определите позитивные конструкции.
    1. Приготовьте раствор плазмидного минипрепа. Это может быть сделано путем сбора колоний и прививки в среде LB. Обычно достаточно 3 колоний.
    2. Инкубировать смесь в течение ночи при 37 °C.
    3. Центрифугировать смесь при 4,560 х г в течение 10 минут и выбросить супернатант.
    4. Повторно суспендировать гранулы в 250 мкл буфера P1 и приготовить плазмидные минипрепы с помощью комплекта для отжима минипрепа.
    5. Проведите анализ пищеварения продукта miniprep с использованием AseI или других ферментов рестрикции.
    6. Загрузите образцы на 0,8% агарозного геля и запустите переваренные плазмиды. Проанализируйте гель под УФ-лампой.
    7. Используйте службу виртуализации для проверки последовательности положительного продукта.
  6. Получите коэкспрессионную вставку ДНК.
    1. Выполняют ПЦР для полученияN1-391 и P1-126, используя в качестве шаблонов ранее построенные 2BT-10 N1-391 и 2BT-10 P1-126.
    2. Выполнение1-й ПЦР для полученияN1-391 из конструкции 2BT-10 N1-391 с использованием условий ПЦР в Таблице 2 и Таблице 3 с N1-391 Форвардной праймерой и Обратной грунтовкой 5 ́-GTGAAGATCCTGGCTGATGCAATGCGGCGGCGCG
      CGCCGCGATCGCGGATCC-3 ́.
    3. Выполните2-ю ПЦР для получения P1-126 из конструкции 2BT-10 P1-126 с помощью Праймера: 5'-CCGCCGCATTGCATCAGCCAGGATCTTCACTGC
      AGGACTCGAGTTCTAGA-3 и P1-126 Обратная праймера (используйте условия ПЦР в таблице 2 и таблице 3).
    4. Наконец, выполняют перекрывающуюся ПЦР на смешанных продуктах предыдущих 2 реакций ПЦР для слиянияN1-391 иР1-126. Используйте грунтовку N1-391 и обратную грунтовку P1-126. Используйте условия ПЦР в таблице 5 и таблице 6.
  7. Соединяйте вектор и вставку ДНК.
    1. Обработайте перекрывающиеся продукты ПЦР ДНК-полимеразой Т4 в соответствии с протоколом на этапе 1.3.
    2. Отжиг вектора КСЖ и продукта ПЦР в соответствии с протоколом на этапе 1.4.
    3. Определите положительные конструкции, следующие протоколу на шаге 1.5.

2. Экспрессия и очистка белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте E. coli для бицистронной конструкции коэкспрессии как N, так и P. Культивирует клетки при 37 °C, но проводит экспрессию при пониженной температуре (16 °C) в течение ночи. Очищают белковые комплексы с помощью комбинации кобальтовой колонки, ионного обмена и размерной исключаемой хроматографии(рисунок 2).

  1. Используйте штамм E. coli BL21(DE3) для производства белка. Выращивайте 4 L клеточных культур при 37 °C в среде LB (Luria Broth) до тех пор, пока OD600 не достигнет 0,6.
  2. Понизьте температуру до 16 °C. Через час индуцируют экспрессию с помощью 0,5 мМ изопропил 1-тио--D-галактопиранозида (IPTG) в течение ночи.
  3. Центрифугируют ячейки при 4,104 х г в течение 25 мин, а затем отбрасывают супернатант.
  4. Повторно суспендировать клеточные гранулы в 200 мл лизисного буфера А (50 мМ фосфата натрия, рН 7,4, 500 мМ NaCl, 5 мМ имидазола, 10% глицерина и 0,2% NP40). Используйте 50 мл лизисного буфера для повторного суспендирования клеточных гранул из 1 л клеточной культуры.
  5. Различите клетки ультразвуком в течение 15 минут, 3 секунды включено и 3 секунды выключено. Затем центрифужные ячейки при 37,888 х г в течение 40 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен путем замораживания клеток перед ультразвуком в морозильной камере с температурой -80 °C.
  6. Загрузите супернатант в кобальтовую гравитационную колонну (диаметр х длина: 2,5 см х 10 см) с ~10 мл бусин, предварительно уравновешенных 5-10 колонными объемами (CV) лизисного буфера.
  7. Промыть колонку 5 CV буфера B (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 1 М NaCl, 10% глицерина и 5 мМ имидазола) и 5 CV буфера C (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 5 мМ имидазола).
  8. Элюдирует белок из шариков, используя 2 CV буфера D (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазола).
  9. Разбавляют элюированный белок 5x буфером QA (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 5% глицерина) для колонки Q.
  10. Промыть 5 мл колонны Q буфером QA, чтобы уравнять колонну, затем загрузить разбавленный образец в колонну Q с помощью перистальтического насоса (например, Rabbit).
  11. Загрузите колонку Q в машину ВЭЖХ вместе с буфером QA и буфером QB (50 мМ Tris-HCl pH7.4, 1.5 M NaCl, 5% глицерин). Установите скорость потока 1 мл/мин.
  12. Запустите программу «стирка насоса», чтобы постирать машину с буфером QB, за которым следует буфер QA (1-2 резюме / каждый). Установите расход системы на 3 мл/мин.
  13. Установите UV1 на 280 нм и UV2 на 260 нм. Используйте 96 пластин глубокой скважины для сбора фракций.
  14. Элюируют белки с помощью ступенчатого градиента элюирующего агента (QB Buffer), применяя 3-4 CV от каждой концентрации, увеличивая процент на 5% каждый раз, начиная с 0% QB. Белковый комплекс N0P выйдет на 15% QB Buffer.
  15. После того, как весь белок элюирован, промыть колонку 100% буфером QB (2 CV).
  16. Выделяют белок путем гелевой фильтрации Superdex 200 Увеличение 10/300 GL колонки (диаметр х длина: 1,0 см х 30 см) и уравновешивать буфером E (20 мМ HEPES pH 7,4 и 200 мМ NaCl).
  17. Анализ белковосодержащих фракций с помощью SDS-PAGE.

3. Сборка in vitro вирус-специфического NC

ПРИМЕЧАНИЕ: Сборку in vitro РСВ-специфического NC (N:РНК) проводили путем инкубации подготовленного комплекса N0P с Олигосом РНК. Затем хроматография SEC была использована для отделения сборочного комплекса от N0P и избыточной РНК(рисунок 2).

  1. Смешайте и инкубируют очищенный комплекс N0P с Олиго РНК с молекулярным соотношением 1:1,5 при комнатной температуре в течение 1 часа, обычно для следующего этапа достаточно 1 мл белкаN0P с концентрацией 1 мг/мл. Настройте контрольный образец, который содержит только такое же количество белка N0P.
  2. Предварительно уравновешивают гель фильтрацию Superdex 200 Увеличение 10/300 GL колонки с буфером E (20 мМ HEPES, рН 7,4, 200 мМ NaCl).
  3. Центрифугировать образец с 21 130 х г в течение 15 мин, удалить любые осадки и загрузить супернатант в колонну SEC.
  4. Сравните хроматографические изображения SEC образца сборки N:РНК и контрольного образца N0P, объедините соотношение A260/A280, чтобы определить, какие пики являются собранными N-РНК, N0P и свободной РНК.
  5. Соберите пиковые фракции, запустите гель SDS-PAGE или сделайте сетки.
  6. Для сборки комплекса N-РНК соберите все фракции пика N-РНК, сделайте экстракцию РНК и запустите гель Urea-PAGE, чтобы дважды проверить длину специфической РНК, которая такая же, как смешанная и инкубированная на первом этапе.

4. Изготовление отрицательных пятен сетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Электронная микроскопия отрицательных пятен (ЭМ) представляет собой метод, при котором молекулы адсорбируются в углеродную пленку, а затем встраиваются в слой атомов тяжелых металлов. Отрицательное пятно EM создает высокий контраст изображения, что позволяет легко видеть и вычислительно выравнивать частицы. Другим преимуществом является то, что адсорбция частиц к углеродной пленке обычно побуждает молекулы прилипать к сетке с несколькими предпочтительными ориентациями. Когда молекулы находятся в одинаковой ориентации, их легко разделить на структурно различные классы. Таким образом, отрицательное окрашивание ЭМ является подходящим методом для руководства пробоподготовкой25,26 (рисунок 3).

  1. Микроволновая печь или нагрейте 5 мл ddH2O в небольшом стеклянном стакане с помощью вольфрамового нагревателя до тех пор, пока он не закипит.
  2. Взвесите 37,5 мг уранилфоримата и добавьте к 5 мл нагретого ddH2O, чтобы получить 0,75% раствор для окрашивания уранилформата. Перемешайте под покрытым алюминиевой фольгой мукером для защиты от света.
  3. Добавьте 4 мкл 10 М NaOH в окрашивающий раствор и продолжайте перемешивать в течение 15 мин, защищенных от света.
  4. Процедить раствор через фильтр 0,22 мм в пробирку.
  5. Используйте тлеющий разряд, чтобы сделать непрерывные электромагнитные решетки с углеродным покрытием гидрофильными27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сети размещены внутри камеры, подключенной к источнику питания. При подаче высокого напряжения газ в камере ионизируется, а отрицательно заряженные ионы осаживаются на углеродных решетках, чтобы сделать их гидрофильными.
  6. Вырежьте и сложите полоску парапленки. Пипетировать 2 капли по 40 мкл буфера с одной стороны парапленки, а пипетировать еще 2 капли по 40 мкл окрашивающего раствора на другую сторону.
  7. Чтобы сделать эм-углеродные решетки, нанесите 3 мкл образца белка на 1 минуту.
  8. Смажь сетки на промокающей бумаге.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки промывают 2 раза буфером и 1 раз с 0,75% раствором для окрашивания уранилформата, промокающим после каждой ступени.
  9. Подержите поверхность сетки во второй капле 0,75% раствора для окрашивания уранилформата в течение 30 секунд.
  10. Промокните сетку о промокающую бумагу, чтобы удалить лишний раствор пятен и дать сетке высохнуть на воздухе.
  11. Сохраните сетки в поле сетки перед созданием изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Очистка не-РНК-свободного N0P белка
С помощью этого протокола можно получить крупномасштабный растворимый гетеродимерный комплекс RSV N0P. Полная длина N и N концевой части P-белков была совместно экспрессирована с 10X His-Tag на N-белке в E. coli. N0P очищали с помощью кобальтовой колонки, ионого обмена и хроматографии с исключением размеров. N0P содержит как полноразмерный N, так и N-терминал P, но не содержит клеточной РНК, основанной на УФ-абсор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) несегментированных РНК-вирусов отрицательного смысла (NNS) показывают, что собранные NCLP представляют собой комплекс N с клеточными РНК хозяина при сверхэкспрессии в бактериальных или эукариотических системах экспрессии15,16,17,18,19. Предыдущие исследования пытались получить N без РНК с помощью различны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследовательские программы в лаборатории Лян в Эмори поддерживаются Национальным институтом общих медицинских наук США (NIGMS), Национальными институтами здравоохранения (NIH) под номером R01GM130950 и Фондом исследовательских стартапов в Медицинской школе Университета Эмори. Автор благодарит членов лаборатории Лян за полезную поддержку и критическое обсуждение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АгарозаSIgmaA9539-500Gизготовление конструкции методом LIC
Amicon Ultra-15 Центробежная фильтрующая установкаMilliporeUFC901024концентрат белка образца
Ампициллин натрияGOLD BIOTECHNOLOGY5118.111317Aантибиотик для клеточной культуры
AseINEBR0526Sизготовление конструкта методом LIC
Cobalt (Высокая плотность) Агарозные бусиныЗолото BioH-310-500Для очистки белка His-tag
Corning LSE Digital Dry Bath HeaterCORNING6885-DBГеат образца
dCTPInvitrogen10217016изготовление конструкции методом LIC
dGTPInvitrogen10218014изготовление конструкции методом LIC
GlycerinSigmaG5516-4LРаствор
HEPESSigmaH3375-100GРаствор
HiTrap Q HPSigmaGE29-0513-25Очистка белка
ИмидазолSigmaI5513-100GРаствор
IPTG (Изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид)GOLD BIOTECHNOLOGY1116.071717Aиндуцировать экспрессию белка
Микроцентрифужные пробиркиVWR47730-598для ПЦР
Misonix Sonicator XL2020 Ультразвуковой жидкостный процессорSpectraLabMSX-XL-2020Ультразвуковой аппарат для лизирования клеток
Сетки с отрицательным окрашиваниемElectron Microscopy SciencesCF400-Cu-THДля изготовления сеток с отрицательным окрашиванием
New Brunswick Innova 44/44ReppendorfM1282-0000Шейкер для культивирования клетки
Nonidet P 40 ЗаменительSigma74385-1Lделающий раствор
OneTaq DNA PolymeraseNEBM0480LPCR
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28706Purify ДНК
SSPI-HFNEBR3132Sизготовление конструкта с использованием метода LIC
Superose 6 Increase 10/300 GLSigmaGE29-0915-96Очистка белка
T4 DNA полимеразаSigma70099-3изготовление конструкта методом LIC
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus ЦентрифугаFisher Scientific36-101-0816Центрифуга, самая высокая скорость 20 000 об/мин
Тризма гидрохлоридSigmaT3253-250Gполучение раствора
Uranyl FormateElectron Microscopy Sciences22451получение отрицательного раствора окрашивания

Ссылки

  1. Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
  2. Lamb, R. A. Fields virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).
  3. Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
  4. Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
  5. Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
  6. Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
  7. Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
  8. Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368(2020).
  9. Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
  10. Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
  11. Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
  12. Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
  13. Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627(2016).
  14. Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
  15. Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429(2013).
  16. Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
  17. Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
  18. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  19. Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
  20. Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
  21. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  22. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  23. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  24. Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
  25. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  26. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
  27. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
  28. Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
  29. Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
  30. Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
  31. Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
  32. Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
  33. Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
  34. Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сборка вирусного нуклеокапсидарибонуклеопротеиновый комплексматричная РНКкоэкспрессия белковгель-фильтрацияэксклюзионная хроматографияэлектронная микроскопия с негативным контрастированиемSDS-PAGEкриоэлектронный анализ
Генерация и сборка вирус-специфических нуклеокапсидов респираторно-синцитиального вируса
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.