Method Article

Маркировка и визуализация продуктов экспрессии митохондриального генома в хлебобулочных saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/62020

⸱

April 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, M.V. Lomonosov Moscow State University, 2Institute of Functional Genomics, M.V. Lomonosov Moscow State University, 3National Research Centre "Kurchatov Institute"

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дрожжи Бейкера митохондриального генома кодирует восемь полипептидов. Цель текущего протокола состоит в том, чтобы обозначить все из них, а затем визуализировать их как отдельные полосы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии являются важными органеллами эукариотических клеток, способных к аэробному дыханию. Они содержат круговой геном и аппарат экспрессии генов. Митохондриальный геном хлебопекарных дрожжей кодирует восемь белков: три субъединита цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазы АТФ (Atp6p, Atp8p и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Цель метода, описанного здесь, состоит в том, чтобы конкретно обозначить эти белки с 35S метионином, отделить их электрофорезом и визуализировать сигналы как дискретные полосы на экране. Процедура включает в себя несколько этапов. Во-первых, дрожжевые клетки культури в галактозоссодержащей среде, пока они не достигнут поздней стадии логаритмического роста. Далее, циклохексимид лечения блокирует цитоплазмический перевод и позволяет 35S метионин включения только в митохондриальных переводческих продуктов. Затем все белки извлекаются из дрожжевых клеток и отделяются полиакриламинидным гель-электрофорезом. Наконец, гель сушат и инкубируется с экраном фосфора хранения. Экран сканируется на фосфоримагер выявления полос. Метод может быть применен для сравнения скорости биосинтеза одного полипептида в митохондриях штамма мутантных дрожжей по сравнению с диким типом, который полезен для изучения дефектов экспрессии митохондриального гена. Этот протокол дает ценную информацию о скорости перевода всех дрожжей митохондриальных мРНК. Тем не менее, для того, чтобы сделать правильные выводы, требуется несколько элементов управления и дополнительные эксперименты.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии являются органеллы глубоко участвует в метаболизме эукариотической клетки. Их цепочка передачи электронов снабжает клетку АТФ, основной энергетической валютой, используемой в нескольких биохимических путях. Кроме того, они участвуют в апоптозе, синтезе жирных кислот и гемов, а также в других процессах. Дисфункция митохондрий является известным источником болезни человека1. Это может быть результатом мутаций в ядерных или митохондриальных генах, кодирующих структурные или регулятивные компонентыорганелл 2. Дрожжи Бейкера Saccharomyces cerevisiae является отличной моделью организма для изучения митохондриальной экспрессии генов по нескольким причинам. Во-первых, их геномполностью секвенирован 3,хорошо аннотирован, и большая сумма данных уже доступна в литературе благодаря долгой истории исследований, проведенных с этим организмом. Во-вторых, манипуляции с их ядерным геномом относительно быстры и просты из-за их быстрых темпов роста и высокоэффективной гомологичной системы рекомбинации. В-третьих, хлебопекарные дрожжи S. cerevisiae являются одним из немногих организмов, для которых разрабатываются манипуляции с митохондриальными геномами. Наконец, хлебопекарные дрожжи – это аэробе-анаэробный биологический организм, который позволяет изоляцию и изучение респираторных дефектных мутантов, так как они могут расти в средствах массовой информации, содержащих ферментируемые источники углерода.

Мы описываем метод изучения митохондриальной экспрессии генов пекаря дрожжей S. cerevisiae на трансляционнойуровне 4. Его основной принцип исходит из нескольких наблюдений. Во-первых, дрожжи митохондриального генома кодирует только восемь белков: три подразделения цитохрома c oxidase (Cox1p, Cox2p и Cox3p), три подразделения синтазыАТФ(Atp6p, Atp8p, и Atp9p), подразделение ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase Это число невелико, и все они могут быть разделены электрофорезом на одном геле в соответствующих условиях. Во-вторых, митохондриальные рибосомы относятся к прокариотическому классу, а нек эукариотическим 6,и поэтому чувствительность к антибиотикам различна для дрожжевых цитоплазмических и митохондриальных рибосом. Это позволяет ингибировать цитоплазмический перевод циклохексимидом, обеспечивая условия, при которых маркированная аминокислота(35S-метионин) включается только в митохондриальные переводческие продукты. В результате эксперимента дается информация о скорости включения аминокислот в митохондриальные белки, синтезированные de novo, что отражает общую эффективность митохондриального перевода для каждого из восьми продуктов

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка дрожжевой культуры

  1. Полоса дрожжей из замороженных фондовых культур на свежих тарелках с соответствующей среде. Положите пластины в инкубатор культуры при 30 градусов по Цельсию на 24-48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пусть чувствительные к температуре мутанты растут при разрешительной температуре.
  2. Прививают дрожжевые культуры в 2 мл YPGal среды (2% пептона, 1% дрожжевой экстракт, 2% галактозы) из свежей полосы в 15 мл трубок и инкубировать их ночь агитации при 200 об/мин при 30 градусов по Цельсию.
  3. Измерьте оптическую плотность культуры на длине волны 600 нм (OD600).
  4. Возьмите объем, соответствующий 0,2 абсорбторных единиц в стерильных трубках, гранулы дрожжевых клеток на 9000 х г для 30 с при комнатной температуре, и отказаться от супернатанта.
  5. Вымойте клетки с 0,5 мл стерильной воды вихрем в течение 5 с. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г на 30 с при комнатной температуре и отказаться от супернатанта. Разбавить клетки в 2 мл свежей среды YPGal.
  6. Инкубационный агитационный при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию, пока OD600 не достигнет значений 1,5-1,9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Темпы роста дрожжей варьируются, так что будьте готовы ждать. Разумно сделать шаги 1.3-1.6 рано утром. Обычно это занимает 4-5 ч, но может занять больше времени.

2. Включение радиоактивных изотопов

  1. Передача объема культуры, эквивалентного одному оптическому блоку в микроцентрифуге трубки. Спин трубки на 3000 х г в течение 1 мин и отказаться от супернатанта. Вымойте 0,5 мл стерильной воды вихрем на 5 с.
    1. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г на 30 с при комнатной температуре и отказаться от супернатанта. Resuspend дрожжевых клеток в 0,5 мл стерильного буфера перевода. Поместите подвеску в трубку 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод буфера является решением, содержащим 2% галактозы (w/v) и 50 мМ фосфат калия с рН 6.0.
  2. Добавьте циклохексимид в подвеску клеток до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Инкубация в течение 5 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию для ингибирования цитозолового перевода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор циклохексимида (20 мг/мл, в этаноле) должен быть подготовлен свежим перед экспериментом. Хлорамфеникол можно успешно заменить анизомицином в той же концентрации7.
  3. Добавьте 25-30 мкг 35S-мезионина в подвесную клетку и инкубировать в течение 30 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь 35S-methionine и 35S-цистеин также может быть использован. Чистый 35S-methionine приводит к самому сильному сигналу и лучшему соотношению сигнала к шуму. Как правило, мезионин является более эффективным, чем цистеин, потому что содержание этой аминокислоты в митохондриальных белков выше. Тем не менее, смесь EasyTag из 35S-methionine и цистеина дешевле и дает сопоставимые результаты7.
    ВНИМАНИЕ: 35S-мезионин является радиоактивным. Следуйте обычным правилам безопасности при обращении с радиоактивными материалами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо известно, что включение радиоактивности достигает предела, из-за которого общее количество сигналов выравнивается с течением времени. Как только этот предел будет достигнут, практически невозможно определить скорость синтеза различных переводческих продуктов. Чтобы проанализировать скорость митохондриального перевода, необходимо быть в состоянии, при котором интенсивность сигнала увеличивается со временем инкубации с 35S-methionine в линейной манере. Для обычных лабораторных штаммов дикого типа, сигнал уже насыщен инкубации раз гораздо короче, чем 30 мин. Переводные мутанты могут вести себя совсем по-другому. Следует проводить тайм-курс для установления кинетики включения радиоактивности и, следовательно, скорости перевода, по крайней мере при работе с новым штаммом. Для этого мы предлагаем брать пробы с интервалом в несколько минут (например, 2,5, 5,0, 7,5, 10 и 20 мин).
  4. Добавьте неочищенные «холодные» метионин (окончательная концентрация должна быть 20 мМ) и пуромицин (окончательная концентрация должна быть 1-10 мкг/мл), чтобы остановить маркировку. Инкубация в течение 10 мин агитации при 200 об/мин и 30 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, чтобы дать рибосомы время, чтобы закончить перевод пептидов. В противном случае, все полипептиды короче, чем в полный рост будут обнаружены на другой размер. На этом этапе можно провести эксперимент по времени (пульс-погоня) для определения стабильности митохондриальных переводческих продуктов. Для этого продолжайте инкубацию, взяв пробы с интервалом в 30 минут (например, 30, 60, 90 и 120 мин).

3. Дрожжевой клеточныйлиз и экстракция белков

  1. Соберите дрожжевые клетки путем центрифугации на 9000 х г на 30 с. Вымойте клетки с 0,5 мл стерильной воды вихрем в течение 5 с. Пеллет дрожжевых клеток на 9000 х г для 30 с при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта.
    заметка. Протокол можно приостановить здесь. Храните образцы при -20 градусов по Цельсию.
  2. Добавьте 75 МКЛ буфера лиза к гранулам и вихрю в течение 5-10 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лиз буфер является решением 1.8 M NaOH, 1 M β-меркаптоэтанол, и 1 мМ PMSF в воде. Избегайте чрезмерной инкубации с буфером лиза, что приводит к щелочному гидролизу белков. Немедленно приступайте к шагу 3.3.
  3. Добавьте 500 МКЛ буфера 0,5 М Трис-HCl с рН 6,8. Вортекс кратко.

4. Осадки белков

ВНИМАНИЕ: Метанол и хлороформ являются органическими растворителями. Следуйте обычной практике безопасности для обработки органических веществ.

  1. Добавьте в образец 600 МКЛ метанола. Вихрь для 5 с.
  2. Добавьте в образец 150 МКЛ хлороформа. Вихрь для 5 с.
  3. Центрифуга образцов в течение 2 мин при 12000 х г. Аккуратно отбросьте верхнюю фазу с помощью пробоя.
  4. Добавьте в образец 600 МКЛ метанола. Тщательно перемешайте трубку несколько раз.
  5. Центрифуга образцов в течение 2 мин при 12000 х г. Откажитесь от супернатанта.
  6. Воздушно-сухие гранулы в течение 2 мин при 80 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся жидкость должна испаряться. Существует риск иметь аномальное разделение белков в геле, если гранулы были высушены недостаточно. Тем не менее, это не возможно, чтобы пересушить гранулы, так что он может даже храниться на ночь при 4 градусов по Цельсию.
  7. Растворите осажденные белки в 60 МКЛ 1x буфера образца Laemmli.
  8. Нагрейте в течение 10 мин при температуре 40 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте кипячения образцов при 95 градусов по Цельсию, потому что это вызывает агрегацию. Если агрегаты все еще образуются, закруть образцы на 12 000 х г в течение 2 мин и соберите супернатант. Образцы можно хранить при -20 градусов по Цельсию. Протокол можно приостановить здесь.

5. СТРАНИЦА SDS

  1. Бросьте 17,5% Laemmli SDS-полиакриламидный гель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 6 M мочевины могут быть добавлены в гель для решения лучше atp8 и atp9. Градиент 15%-20% гелей также может дать лучшее разрешение.
  2. Загрузите 15 МКЛ (40–50 мкг) каждого образца в карманах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости измерять концентрацию белка, если значения OD600 были близки в шаге 1.6. Если нет, то измерьте концентрации белка с помощью анализа с помощью моющих средств, совместимых с реагентами.
  3. Запустите гель в холодной комнате, пока синий краситель достигает примерно 65% от длины геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для используемой системы (например, ячейки Protean II xi) мы используем любой из двух режимов: 16-17 ч при 5 В/см или 5 ч при 15 В/см. Нет белков работать быстрее, чем бромофено синий краситель, но длинные трассы может привести к размытию сигналов atp8 и atp9.
  4. Пятно гель с Coomassie блестящий синий и сделать сканирование или фото, которое требуется в качестве управления загрузкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативным способом управления погрузкой является иммуноблотинг с антителом к митохондриальному гену «домашнего хранения», например, порин 1.

6. Авторадиография

  1. Высушите гель в геле-сушилке. Храните его в кассете с экраном фосфора хранения в течение 3-5 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой скринингу сушеного геля является передача белков в мембрану нитроцеллюлозы путем электро-блоттинга и скрининга его после этого. Это приводит к более сильным сигналам и более острым полосам.
  2. Сканирование экрана на фосфоримагере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы фосфорной визуализации, рентгеновская пленка также может быть использована для выявить сигналы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя описанной выше протоколу, мы назначили продукты митохондриального перевода из двух штаммов S. cerevisiae: дикого типа (WT)и мутанта, подшипника удаления гена AIM23 (AIM23), кодируя фактор посвящения митохондриального перевода 3 (Таблица 1)8. Продукты митохондриального перевода были радиоактивно маркированы и разделены в SDS-PAAG9. Образцы были собраны каждые 2,5 минуты до насыщения, чтобы построить курс времени(рисуно...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования экспрессии генов занимают центральное место в современных науках о жизни. Разработаны многочисленные методы, обеспечивающие понимание этого сложного процесса. Здесь мы описали метод, позволяющий получить доступ к биосинтезу белка в хлебопекарных дрожжах S. cerevisiae митохондрий. Обычно применяется для сравнения эффективности перевода мРНК в митохондриях штамма мутантных дрожжей по сравнению с диким типом, чтобы получить доступ к последствиям изученной мутации. Это один из основных экспериментов, ко...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Российским фондом фундаментальных исследований, грантом No 18-29-07002. П.К. был поддержан Государственным поручением Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, грантом АААА-А16-116021660073-5. М.В.П. при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, грант No 075-15-2019-1659 (Программа Курчатовского центра геномных исследований). Работы частично были выполнены на оборудовании, закупленное в рамках Программы развития МГУ. I.C., S.L. и M.V.B. были дополнительно поддержаны грантом МГУ «Ведущая научная школа Ноев ковчег».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-МеркаптоэтанолSigma-AldrichM3148
АкриламидSigma-AldrichA9099
Персульфат аммонияSigma-AldrichA3678
Бактериологический агарSigma-AldrichA5306 
Биоволновой измеритель плотности клеток CO8000BIOCHROM US BE80-3000-45
МАРКИ стандартные одноразовые кюветыSigma-AldrichZ330361
хлороформSigma-Aldrich288306 
циклогексимидSigma-AldrichC1988 
D-(+)-галактозаSigma-AldrichG5388 
D-(+)-глюкозасигма-ОлдричG7021 
цифровой блочный нагревательThermo Scientific88870001
EasyTag L-[35S]-Метионин, 500&микро; Ci (18,5 МБк), стабилизированный водный растворPerkin ElmerNEG709A500UC
центрифуга Eppendorf 5425Thermo Scientific13-864-457
GE Накопительные люминофорные экраныSigma-AldrichGE29-0171-33
L-метионинSigma-AldrichM9625 
метанолSigma-Aldrich34860 
N,N,N′,N′-ТетраметилэтилендиаминSigma-AldrichT9281
N,N′-МетиленбисакриламидSigma-AldrichM7279
Нью-Брансуик Innova 44/44R Шейкер ИнкубаторНью-Брансуик Научный
пептон из мяса, бактериологическийMillipore91249 
ФенилметансульфонилфторидSigma-AldrichP7626 
Набор для анализа белка Pierce 660 нмThermo Scientific22662
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1645050
Protean II xi cellBio-Rad1651802
Пуромицина дигидрохлорид из Streptomyces albonigerSigma-AldrichP8833
Гидроксид натрияSigma-Aldrich221465
Storm 865 люминофорный тепловизорGE Healthcare
Тризма базаSigma-Aldrich93352 
Вакуумная нагреваемая гелевая сушилкаCalaver ScientificCSL-GDVH
Дрожжевой экстрактSigma-AldrichY1625 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
  2. Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
  3. Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
  4. Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
  5. Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
  6. Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
  7. Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
  8. Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749(2016).
  9. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
  12. Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
  13. Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
  14. Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).
  15. Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
  16. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial Gene ExpressionYeast MitochondriaProtein BiosynthesisSaccharomyces CerevisiaeRadioactive LabelingPolyacrylamide GelCycloheximide TreatmentMitochondrial TranslationPhosphorimager AnalysisMitochondrial Proteins

Related Articles