Методическая статья

Использование иммунофлуоресценции для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердцах эмбрионов рыбок данио

DOI:

10.3791/62021

⸱

15 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Soochow University, 2Toxicology, Risk Assessment and Research Division, Texas Commission on Environmental Quality

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в рассеченных сердцах эмбрионов рыбок данио.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Воздействие тонкодисперсных частиц(ТЧ 2,5)может привести к токсичности для развития сердца, но основные молекулярные механизмы все еще неясны. 8-гидрокси-2'дезоксигеназа (8-OHdG) является маркером окислительного повреждения ДНК, а γH2AX является чувствительным маркером для разрывов двухцепочечных ДНК. В этом исследовании мы стремились обнаружить изменения PM2,5-индуцированных8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио с использованием иммунофлуоресцентного анализа. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали экстрагируемыми органическими веществами (EOM) изPM 2,5 при 5 мкг/мл в присутствии или отсутствии антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина (NAC, 0,25 мкМ) через 2 ч после оплодотворения (hpf). DMSO использовался в качестве управления транспортным средством. При 72 л.с. сердца были рассечены от эмбрионов с помощью шприцевой иглы и зафиксированы и пронизывались. После блокировки образцы были исследованы первичными антителами против 8-OHdG и γH2AX. Затем образцы промывали и инкубировали с вторичными антителами. Полученные изображения наблюдались под флуоресцентной микроскопией и количественно оценивались с помощью ImageJ. Результаты показывают, что EOM от PM2.5 значительно усиливает сигналы 8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио. Тем не менее, NAC, действуя как поглотитель активных форм кислорода (ROS), частично противодействовал повреждению ДНК, вызванному EOM. Здесь мы представляем протокол иммунофлуоресценции для исследования роли повреждения ДНК в пороках сердца, вызванныхPM 2,5,который может быть применен для обнаружения изменений экспрессии белка в окружающей среде, вызванных химическими веществами, в сердцах эмбрионов рыбок данио.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Загрязнение воздуха в настоящее время является серьезной экологической проблемой, стоящей перед миром. Окружающие тонкодисперсные твердые частицы(ТЧ 2,5),которые являются одним из важнейших показателей качества воздуха, могут переносить большое количество вредных веществ и поступать в кровеносную систему, нанося серьезный вред здоровьючеловека1. Эпидемиологические исследования показали, что воздействиеТЧ 2,5 может привести к повышенному риску врожденных пороков сердца (ИБС)2,3. Данные экспериментов на животных также показали, чтоPM 2,5 может вызывать ано....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дикие рыбки данио (AB), используемые в этом исследовании, были получены из Национального ресурсного центра рыбок данио в Ухане, Китай. Все процедуры для животных, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институтом по уходу за животными Комитета по этике Университета Сучхоу.

1. Отбор пробТЧ 2,5 и экстракция органических соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: PM2.5 был собран в городской местности в Сучжоу, Китай, 1-7 августа 2015 года, как описаноранее 5.

  1. Выпекайте 47-мм кварцевые мембранные фильтры в муфельной печи 500 °C в течение 2 ч для удаления органических компоне....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот иммунофлуоресцентный анализ является чувствительным и специфическим методом измерения изменений экспрессии белка в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию химических веществ окружающей среды.

В этом репрезентативном анализе эмбрионы, подвергшиеся воздействиюPM 2,5 в отсутствие или присутствие антиоксиданта NAC, оценивались на наличие наличия пороков развития сердца(рисунок 1)........

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя рыбки данио является отличной моделью позвоночных для изучения токсичности химических веществ окружающей среды для развития сердца, из-за небольшого размера сердца эмбриона трудно получить достаточное количество белка для анализа вестерн-блэт. Поэтому мы представляем чувствительный метод иммунофлуоресценции для количественной оценки уровней экспрессии белка биомаркеров повреждения ДНК в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействиюPM 2,5.

Во время рассечения важно сох.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом наук о природе Китая (номер гранта: 81870239, 81741005, 81972999) и Приоритетным академическим программным развитием высших учебных заведений Цзянсу.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
8-OHdG антителоSanta Cruz Biotechnology, СШАsc-66036Первичные антитела
Аналитические весыSartorius, КитайBSA124S
BSASolarbio, Пекин, КитайSW3015Для блокировки
DAPIAbcam, СШАab104139Для ядерного противодействия.
DMSOSolarbio, Пекин, КитайD8371
Флуоресцентный микроскопOlympus, ЯпонияIX73Для визуализации флуоресцентных сигналов /
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3Карлсбад, СШАCW0159Вторичное антитело
Goat Anti-rabbit IgG FITCКарлсбад, СШАRS0003Вторичное антитело
N-ацетил-L-цистеин (NAC)Adamas-Beta, Шанхай, Китай616-91-1
Орбитальный шейкерQILINBEIER, КитайTS-1
ПараформальдегидSigma, КитайP6148Сделайте 4% параформальдегид для фиксации.
Фосфатно-солевой буферHyClone,СШАSH30256.01Приготовьте 0,1% твин в PBS для стирки.
Пробоотборник PM2.5TianHong, Ухань, КитайTH-150CДля 24-часового непрерывного отбора проб PM2.5.
Рециркуляционная система аквакультурыХайшэн, Шанхай, КитайВ нем содержались рыбки данио.
Экстрактор SoxhletZhengQiao, Шанхай, КитайBSXT-02Для экстракции органических компонентов.
СтереомикроскопNikon, КанадаSMZ645Для вскрытия сердца из эмбрионов рыбок данио
Трикаин метансульфонат (MS222)Sigma, КитайE10521Для обезболивания эмбрионов рыбок данио-рерио
Tween 20Sigma, КитайP1379
γ H2AX АнтителоAbcam, СШАab26350Первичное антитело
.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
  2. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
  3. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C.,....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PM2 5zebrafish8 OHdGGamma H2AXNAC

Похожие статьи