Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Использование иммунофлуоресценции для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердцах эмбрионов рыбок данио

3.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62021

⸱

15 февраля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Soochow University, 2Toxicology, Risk Assessment and Research Division, Texas Commission on Environmental Quality

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол использует иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в рассеченных сердцах эмбрионов рыбок данио.

Аннотация

Воздействие тонкодисперсных частиц(ТЧ 2,5)может привести к токсичности для развития сердца, но основные молекулярные механизмы все еще неясны. 8-гидрокси-2'дезоксигеназа (8-OHdG) является маркером окислительного повреждения ДНК, а γH2AX является чувствительным маркером для разрывов двухцепочечных ДНК. В этом исследовании мы стремились обнаружить изменения PM2,5-индуцированных8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио с использованием иммунофлуоресцентного анализа. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали экстрагируемыми органическими веществами (EOM) изPM 2,5 при 5 мкг/мл в присутствии или отсутствии антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина (NAC, 0,25 мкМ) через 2 ч после оплодотворения (hpf). DMSO использовался в качестве управления транспортным средством. При 72 л.с. сердца были рассечены от эмбрионов с помощью шприцевой иглы и зафиксированы и пронизывались. После блокировки образцы были исследованы первичными антителами против 8-OHdG и γH2AX. Затем образцы промывали и инкубировали с вторичными антителами. Полученные изображения наблюдались под флуоресцентной микроскопией и количественно оценивались с помощью ImageJ. Результаты показывают, что EOM от PM2.5 значительно усиливает сигналы 8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио. Тем не менее, NAC, действуя как поглотитель активных форм кислорода (ROS), частично противодействовал повреждению ДНК, вызванному EOM. Здесь мы представляем протокол иммунофлуоресценции для исследования роли повреждения ДНК в пороках сердца, вызванныхPM 2,5,который может быть применен для обнаружения изменений экспрессии белка в окружающей среде, вызванных химическими веществами, в сердцах эмбрионов рыбок данио.

Введение

Загрязнение воздуха в настоящее время является серьезной экологической проблемой, стоящей перед миром. Окружающие тонкодисперсные твердые частицы(ТЧ 2,5),которые являются одним из важнейших показателей качества воздуха, могут переносить большое количество вредных веществ и поступать в кровеносную систему, нанося серьезный вред здоровьючеловека1. Эпидемиологические исследования показали, что воздействиеТЧ 2,5 может привести к повышенному риску врожденных пороков сердца (ИБС)2,3. Данные экспериментов на животных также показали, чтоPM 2,5 может вызывать аномальное сердечное развитие у эмбрионов рыбок данио и потомства мышей, но молекулярные механизмы сердечной токсичности развития PM2,5 все еще в значительной степени неизвестны4,5,6.

Повреждение ДНК может вызвать остановку клеточного цикла и вызвать апоптоз, который может значительно разрушить потенциал клеток-прародителей и, следовательно, ухудшить развитие сердца7). Хорошо задокументировано, что загрязнители окружающей среды, включаяТЧ 2,5,могут атаковать ДНК через механизмы окислительного стресса8,9. Как у человека, так и у рыбок данио сердечное развитие чувствительно к окислительнойнагрузке10,11,12. 8-OHdG является маркером окислительного повреждения ДНК, а сигнал γH2AX является маркером двухцепочечных разрывов ДНК. N-ацетил-L-цистеин (NAC), синтетический предшественник внутриклеточного цистеина и глутатиона, широко используется в качестве антиоксидантного соединения. В этом исследовании мы используем NAC для изучения роли окислительного стресса вPM 2.5- индуцированном повреждении ДНК13.

Рыбки данио как модельные позвоночные широко использовались для изучения сердечного развития и сердечно-сосудистых заболеваний человека, поскольку механизмы развития сердца высоко сохраняются среди позвоночных14,15. Преимущества использования рыбок данио в качестве модели включают их небольшой размер, сильную репродуктивную способность и низкую стоимость кормления. Особый интерес для этих исследований представляет то, что эмбрионы рыбок данио не зависят от кровеносной системы в период раннего развития и могут пережить тяжелую пороки сердца14. Более того, их прозрачность позволяет непосредственно наблюдать под микроскопом все тело. Таким образом, эмбрионы рыбок данио предоставляют выдающуюся возможность для оценки молекулярных механизмов, участвующих в индукции токсичности сердечного развития в результате воздействия различных химических веществ окружающей среды5,16,17. Ранее мы сообщали, что окислительный стресс, вызванныйPM 2,5,приводит к повреждению ДНК и апоптозу, что приводит к порокам сердца у рыбок данио18. В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол для изучения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердце эмбрионов рыбок данио.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Дикие рыбки данио (AB), используемые в этом исследовании, были получены из Национального ресурсного центра рыбок данио в Ухане, Китай. Все процедуры для животных, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институтом по уходу за животными Комитета по этике Университета Сучхоу.

1. Отбор пробТЧ 2,5 и экстракция органических соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: PM2.5 был собран в городской местности в Сучжоу, Китай, 1-7 августа 2015 года, как описаноранее 5.

  1. Выпекайте 47-мм кварцевые мембранные фильтры в муфельной печи 500 °C в течение 2 ч для удаления органических компонентов.
  2. Поместите фильтр в пробоотборник ТЧ2,5 на 24 ч непрерывного отбора проб.
  3. Снимите фильтр и высушите в течение 24 ч при комнатной температуре.
  4. Количественно оцените фильтр с помощью аналитического баланса.
  5. Экстрагирование органических компонентов из фильтра экстракцией Soxhlet с использованием дихлорметана в качестве растворителя19.
  6. Высушите EOM путем ротационного испарения на водяной бане 60 °C и потока азота. Растворить ЭОМ в ДМСО и хранить при -20 °C.

2. Сбор и лечение эмбрионов рыбок данио

  1. Поддерживайте рыбку данио при 28,5 ± 0,5 °C в системе рециркуляторной аквакультуры с 14-ч светлым и 10-ч темным фотопериодным циклом.
  2. Поместите здоровых взрослых рыбок данио в аквариум в соотношении 2: 1 между самцами и самками.
  3. На следующий день соберите эмбрионы и промыйте их системной водой (т.е. водой для размножения рыбок данио).
  4. Отобрать и случайным образом разделить эмбрионы рыбок данио, демонстрирующие нормальное развитие (однородный размер, полные зерна и отсутствие коагуляции яиц) на 4 группы в отдельных стеклянных чашках Петри диаметром 7 см (около 50 эмбрионов на блюдо).
  5. Обрабатывайте эмбрионыТЧ 2,5 (5 мг/л) в присутствии или отсутствии NAC при 0,25 мкМ от 2 л.с.ф. до 72 л.с. Используйте ДМСО в качестве контроля транспортного средства до конечной концентрации при 0,1% (v/v).

3. Морфологическое наблюдение за эмбрионами рыбок данио и рассечение сердца

  1. При 72 л.с. переносите эмбрионы на стеклянные слайды и наблюдайте под стереомикроскопом. Регистрировать пороки развития сердца, такие как отек перикарда, измененная петля и уменьшенный размер.
  2. Рассчитайте частоту пороков развития (процент эмбрионов с пороками сердца от общего числа живых эмбрионов) и проанализируйте различия между группами с использованием односторонней ANOVA, за которой следует тест множественного сравнения Турции (p < 0,05 = статистически значимый).
  3. Обезболить эмбрионы 0,6 мг/мл MS-222, чтобы обездвижить их на стеклянных слайдах.
  4. Записывайте сердечные удары в течение 30 с и количественно оцените частоту сердечных ритмов с помощью программного обеспечения ImageJ5,20.
  5. Рассекните сердца от эмбрионов рыбок данио с помощью одноразовой шприцевой иглы под стереомикроскопом. Внимание: Избегайте разрушения формы сердца.

4. Иммунофлуоресцентный анализ

  1. Чтобы использовать иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5, в сердце эмбрионов рыбок данио, используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистой стеклянной стороне.
  2. Добавьте 50 мкл 4% параформальдегида к 1,25 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS), чтобы получить фиксаторный раствор.
  3. Поместите 3 рассеченных сердца в один гидрофобный барьерный круг и высиживая в течение 20 минут при комнатной температуре.
  4. Декантировать раствор под микроскопом и сушить образцы при комнатной температуре не менее 5 мин, чтобы сердца полностью прикрепляли к стеклянным слайдам.
  5. Трижды мойте слайды в PBS с 0,1% Tween 20 (PBST) в течение 5 минут на одну стирку.
  6. Добавьте 50 мкл бычьего сывороточного альбумина (BSA) к 1000 мкл PBST для получения 5% раствора BSA и инкубируйте слайды во влажной камере в течение 1 ч, чтобы блокировать связывание неспецифических антител.
  7. Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение 5 минут на одну промывку.
  8. Развести 2 мкл мышиного моноклонального антитела против 8-OHdG и 2 мкл поликлонального антитела кролика против γH2AX в 296 мкл PBST для получения рабочего первичного раствора коктейля антител.
  9. Инкубировать образцы сердца с 50 мкл раствора коктейля первичных антител против 8-OHdG и γH2AX в увлажненной камере в течение не менее одного часа при комнатной температуре или ночью при 4 °C (ночная инкубация может увеличить интенсивность сигнала).
  10. Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение 5 минут на одну промывку.
  11. Развести 1 мкл меченого FITC вторичного антитела против мыши и 1 мкл вторичного антитела против кролика cy3 в 498 мкл PBST для получения рабочего раствора коктейля вторичных антител и инкубировать образцы с вторичными антителами (1:500 в PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  12. Декантирует раствор и промывает образцы PBS три раза в течение 5 минут за одну промывку, защищенную от света.
  13. Добавьте 20 мкл DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндола) в образцы для ядерного окрашивания в течение 30 мин при комнатной температуре.
  14. Нанесите накладку на скольжение и запечатайте лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение. Затем визуйте образцы под флуоресцентным микроскопом и количественно оцените флуоресцентный сигнал области сердца с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассчитайте относительные изменения со средним значением контрольных образцов DMSO. Определите статистическую значимость данных, как по состоянию на шаге 3.2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот иммунофлуоресцентный анализ является чувствительным и специфическим методом измерения изменений экспрессии белка в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию химических веществ окружающей среды.

В этом репрезентативном анализе эмбрионы, подвергшиеся воздействиюPM 2,5 в отсутствие или присутствие антиоксиданта NAC, оценивались на наличие наличия пороков развития сердца(рисунок 1)....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя рыбки данио является отличной моделью позвоночных для изучения токсичности химических веществ окружающей среды для развития сердца, из-за небольшого размера сердца эмбриона трудно получить достаточное количество белка для анализа вестерн-блэт. Поэтому мы представляем чувствительный метод иммунофлуоресценции для количественной оценки уровней экспрессии белка биомаркеров повреждения ДНК в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействиюPM 2,5.

Во время рассечения важно сох...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом наук о природе Китая (номер гранта: 81870239, 81741005, 81972999) и Приоритетным академическим программным развитием высших учебных заведений Цзянсу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
8-OHdG антителоSanta Cruz Biotechnology, СШАsc-66036Первичные антитела
Аналитические весыSartorius, КитайBSA124S
BSASolarbio, Пекин, КитайSW3015Для блокировки
DAPIAbcam, СШАab104139Для ядерного противодействия.
DMSOSolarbio, Пекин, КитайD8371
Флуоресцентный микроскопOlympus, ЯпонияIX73Для визуализации флуоресцентных сигналов /
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3Карлсбад, СШАCW0159Вторичное антитело
Goat Anti-rabbit IgG FITCКарлсбад, СШАRS0003Вторичное антитело
N-ацетил-L-цистеин (NAC)Adamas-Beta, Шанхай, Китай616-91-1
Орбитальный шейкерQILINBEIER, КитайTS-1
ПараформальдегидSigma, КитайP6148Сделайте 4% параформальдегид для фиксации.
Фосфатно-солевой буферHyClone,СШАSH30256.01Приготовьте 0,1% твин в PBS для стирки.
Пробоотборник PM2.5TianHong, Ухань, КитайTH-150CДля 24-часового непрерывного отбора проб PM2.5.
Рециркуляционная система аквакультурыХайшэн, Шанхай, КитайВ нем содержались рыбки данио.
Экстрактор SoxhletZhengQiao, Шанхай, КитайBSXT-02Для экстракции органических компонентов.
СтереомикроскопNikon, КанадаSMZ645Для вскрытия сердца из эмбрионов рыбок данио
Трикаин метансульфонат (MS222)Sigma, КитайE10521Для обезболивания эмбрионов рыбок данио-рерио
Tween 20Sigma, КитайP1379
γ H2AX АнтителоAbcam, СШАab26350Первичное антитело
.

Ссылки

  1. WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
  2. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
  3. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  4. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  5. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  6. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  7. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  8. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  9. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  10. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  11. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  12. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).
  13. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  14. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  15. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  16. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  17. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  18. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).
  19. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  20. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  21. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  22. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  23. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

PM2 5zebrafish8 OHdGGamma H2AXNAC
Использование иммунофлуоресценции для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердцах эмбрионов рыбок данио
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.