Методическая статья

Воспроизводимая модель эндотоксинов, ориентированная на отделение интенсивной терапии, у крыс

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62024

⸱

20 февраля 2021 г.

 , 
1Institute of Physiology, University of Zurich, 2Institute of Anesthesiology, University Hospital of Zurich

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем воспроизводимую модель эндотоксинов, ориентированную на отделение интенсивной терапии, у крыс.

Аннотация

Сепсис и септический шок остаются основной причиной смерти в отделениях интенсивной терапии. Несмотря на значительные улучшения в лечении сепсиса, смертность по-прежнему колеблется от 20 до 30%. Срочно необходимы новые подходы к лечению, чтобы уменьшить мультиорганную недостаточность и смерть, связанные с сепсисом. Надежные модели на животных позволяют применять один или несколько подходов к лечению, а также проверять их влияние на физиологические и молекулярные параметры. В этой статье представлена простая животная модель.

Во-первых, общая анестезия индуцируется у животных либо с использованием летучих, либо путем внутрибрюшинной анестезии. После установки внутривенного катетера (хвостовой вены), трахеостомии и введения внутриартериального катетера (хвостовой артерии) начинается искусственная вентиляция легких. Регистрируются исходные значения среднего артериального давления, насыщения артериальной крови кислородом и частоты сердечных сокращений.

Инъекция липополисахаридов (1 миллиграмм/килограмм массы тела), растворенных в фосфатно-буферном физиологическом растворе, вызывает сильную и воспроизводимую воспалительную реакцию через толл-подобный рецептор 4. Коррекция жидкости, а также применение норадреналина выполняются на основе устоявшихся протоколов.

Животная модель, представленная в этой статье, проста в освоении и сильно ориентирована на лечение клинического сепсиса в отделении интенсивной терапии с седацией, механической вентиляцией, непрерывным мониторингом артериального давления и повторяющимся забором крови. Кроме того, модель является надежной, позволяя воспроизводить данные с ограниченным количеством животных в соответствии с принципами 3R (уменьшить, заменить, уточнить) исследований на животных. В то время как эксперименты на животных в исследованиях сепсиса не могут быть легко заменены, повторяющиеся измерения позволяют уменьшить количество животных, а содержание септических животных под наркозом уменьшает страдания.

Введение

Сепсис и его более тяжелая форма, септический шок, являются синдромами на почве инфекции, приводящими к чрезмерной воспалительной реакции с высвобождением цитокинов, приводящим к физиологическим и биохимическим изменениям с подавленной иммунной защитой и летальным исходам 1,2. Эта несбалансированная воспалительная реакция приводит к дисфункции органов и органной недостаточности в различных жизненно важных органах, таких как легкие, почки и печень. При 37%3 сепсис является одной из наиболее распространенных причин госпитализации пациента в отделение интенсивной терапии (ОИТ). Смертность от сепсиса в настоящее время колеблется в районе 20-30%4. Раннее и эффективное лечение антибиотиками имеет первостепенное значение5. Реанимацию жидкости и вазопрессора нужно устанавливать на ранней стадии, кроме того, лечение является чисто поддерживающим6.

Сепсис определяется как доказанная или предполагаемая инфекция бактериями, грибками, вирусами или паразитами, которая сопровождается дисфункцией органов. Критерии септического шока соблюдаются, когда дальнейший сердечно-сосудистый коллапс невосприимчив к лечению только жидкостью,и присутствует уровень лактата более 2 миллимоля на литр. Органная недостаточность, связанная с сепсисом, может возникать в любом органе, но очень часто встречается в сердечно-сосудистой системе, мозге, почках, печени и легких. Большинству пациентов, страдающих сепсисом, требуется эндотрахеальная интубация для защиты дыхательных путей пациента, защиты от аспирации и применения положительной вентиляции выдоха с высокой долей вдыхаемого кислорода для предотвращения или преодоления гипоксии. Чтобы переносить трахеальную трубку и искусственную вентиляцию легких, пациентам обычно требуется седация.

Эндотоксины, такие как липополисахариды (ЛПС) в качестве компонента мембраны грамотрицательных бактерий, вызывают сильную воспалительную реакцию через толл-подобный рецептор (TLR) 47. Активация определенного пути обеспечивает стабильную воспалительную реакцию. Цитокины, такие как цитокин-индуцированный нейтрофильный хемоаттрактантный белок 1 (CINC-1), моноцитарный хемоаттрактантный белок 1 (MCP-1) и интерлейкин 6 (IL-6), известны как прогностические факторы тяжести и исхода в этой модели8. Внутривенное применение ЛПС было успешно использовано для изучения различных аспектов сепсиса у крыс 8,9.

Лечение сепсиса по-прежнему является проблемой, особенно из-за отсутствия прогностических моделей на животных. Если эндотоксемия с активацией системного воспаления является адекватной моделью для развития фармакологической терапии, спорным является. Тем не менее, с хорошо известным LPS-индуцированным путем TLR 4 можно получить важные знания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты, представленные в этом протоколе, были одобрены ветеринарными органами кантона Цюрих, Швейцария (номера одобрения 134/2014 и ZH088/19). Кроме того, все этапы, выполненные в этом эксперименте, соответствовали Руководству по экспериментам с животными Швейцарской академии медиальных наук (SAMS) и Руководству Федерации европейских ассоциаций лабораторных наук о животных (FELASA).

1. Индукция анестезии и мониторинг животных

  1. Содержать самцов крыс Wistar весом 250-300 грамм (г) в вентилируемых клетках в свободных от патогенов условиях. Обеспечьте 12-12-часовой цикл света / темноты при температуре окружающей среды 22 ± 1 ° C и свободный доступ к пище и воде.
  2. Индуцировать общую анестезию либо путем летучей индукции изофлураном (концентрация 3-5%) в индукционной коробке анестезии в течение 30 секунд (рисунок 1А), либо, альтернативно, индуцировать анестезию однократной инъекцией кетамина/ксилазина (10/1 миллиграмм (мг) на 100 г массы тела).
  3. Переместите животное на рабочее место и положите его на нагревательный коврик на протяжении всего эксперимента. Держите температуру тела между 36,5 и 37 °C.
  4. Используйте носовой конус для обеспечения кислородом (600 мл в минуту). Добавьте изофлуран 2-3%, если для поддержания анестезии была выбрана летучая анестезия. Убедитесь, что животное самопроизвольно дышит.
  5. Подтверждают уровень анестезии отсутствием рефлекса защемления пальцев ног перед установкой трахеостомии и артериальных и венозных катетеров.
  6. Проверка достаточной оксигенации путем периферического мониторинга насыщения кислородом (нормальное насыщение кислородом 98 - 100%).
  7. Используйте мазь (мазь витамина А) для защиты глаз.
  8. Подготовьте стерильные хирургические инструменты и катетеры на боковом столе, как показано на рисунке 1B.
  9. Кроме того, подготовьте мониторинг давления и насыщения кислородом, как показано на рисунке 1C.

2. Внутривенный доступ

  1. Наложите жгут на проксимальный хвост крысы для облегчения венозного доступа (рисунок 2А).
  2. Продезинфицируйте хвост 3 раза спиртом.
  3. Индуцируйте внутривенный катетер G26 в одну из двух боковых хвостовых вен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту проще разместить внутривенный доступ в дистальной части хвоста крысы, потому что вена здесь расположена ближе к коже. Кроме того, в случае неудачной канюляции достаточно места для перемещения проксимально.
  4. Строго избегайте нагнетания воздуха.
  5. Развязывают жгут после установки внутривенного катетера.
  6. Зафиксируйте внутривенный катетер на месте с помощью клейкой ленты (рисунок 2B).
  7. Подключите шприцевые насосы к внутривенному доступу для непрерывного применения жидкости и препарата.
  8. Используйте 3-ходовые запорные краны для болюсной жидкости, применения препарата и забора венозной крови.

3. Трахеостомия

  1. Побрейте переднюю часть шеи животного.
  2. Продезинфицируйте бритую кожу 3 раза раствором провидона-йода.
  3. Выполните около 2 см продольного разреза с помощью скальпеля (с лезвием No 10).
  4. Втягивайте кожу 2-0 шелковыми швами.
  5. Тупо подготовьте гортань и трахею хирургическими ножницами (рисунок 3А).
  6. Обязательно откройте трахею хирургическими микроножами на3-5-й застежке трахеи.
  7. Вставьте стерильную канюлю трахеи в трахею. Будьте осторожны, не вставляйте канюлю слишком глубоко, чтобы избежать односторонней вентиляции.
  8. Закрепите канюлю на месте с помощью шелкового шва 2-0.
  9. Подключите канюлю к вентилятору для вентиляции под давлением или объемом (рисунок 3B).

4. Артериальный доступ

  1. Продезинфицируйте хвост крысы 3 раза раствором повидона-йода.
  2. Разрезать кожу скальпелем (с лезвием No 10) около 1 см продольно с вентральной стороны.
  3. Будьте осторожны, не режьте слишком глубоко, чтобы избежать травмы хвостовой артерии.
  4. Используйте хирургический микроскоп, чтобы тщательно обнажить артерию. Срежьте фасцию, окружающую артерию, хирургическими микроножами.
  5. Разложите дистальную часть артерии с помощью шелкового шва 6-0.
  6. Приготовьте проксимальный 6-0 шелковый шов, но не затягивайте шелк (рисунок 4А).
  7. Введите катетер G-26 в артерию между дистальным и проксимальным шелковым швом.
  8. Как только катетер окажется в артерии, затяните проксимальный шелковый шов и зафиксируйте катетер на месте (рисунок 4B).
  9. Подключите катетер к датчику давления для обеспечения непрерывного измерения артериального давления (нормальное среднее артериальное давление: 60 - 100 мм рт.ст.) (рисунок 4C).
  10. Кроме того, поместите 3-полосный запорный кран между катетером, подключенным к датчику давления, и катетером G-26 для забора артериальной крови.

5. Базовое измерение, индукция сепсиса и последующие измерения

  1. После того, как животное достигнет устойчивого состояния, вводят ЛПС.
  2. Соберите образцы крови при достижении устойчивого состояния (обычно через 15-30 минут).
  3. Заменить потерю жидкости из образцов крови раствором Рингера в соотношении 1:4.
  4. Чтобы вызвать сепсис, вводите ЛПС в виде болюса или в виде непрерывного применения ЛПС.
  5. Для болюсного применения вводят 1 мг ЛПС/килограмм массы тела (кг), растворенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в концентрации 1 мг/мл.
  6. Для непрерывного применения вводят 300 мкг ЛПС/кг/час на протяжении всего эксперимента с помощью шприцевого насоса (запасной раствор ЛПС: 1 мг/мл в ПБС).
  7. Избегайте впрыска воздуха в любое время, чтобы предотвратить воздушную эмболию.
  8. Определите протоколы замены жидкости, протоколы применения сосудосуживающих средств и критерии аборта (например, гипотония, определяемая как среднее артериальное давление ниже 50 мм рт.ст. в течение более 30 минут, несмотря на замену жидкости) перед началом эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы предлагаем непрерывную инфузию раствора Рингера со скоростью 10 мл/кг/час.
  9. Вычтите любое непрерывное введение жидкостей (например, для непрерывного применения ЛПС) из количества, введенного таким образом, чтобы результаты были сопоставимы с результатами контрольных групп.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В конце эксперимента и до извлечения любых органов, таких как печень, почки или селезенка, для дальнейших анализов, таких как гистологическое или биохимическое исследование, животные могут быть усыплены путем разреза нижней полой вены. Рекомендуемым методом эвтаназии является приведение животных к хирургической плоскости анестезии перед разрезанием нижней полой вены и инъекцией ледяного физиологического раствора в левое сердце, особенно если необходимо оценить воспалительные маркеры в органах. Обеспечьте соблюдение требований законодательства и местных руководящих принципов. Чтобы проверить органную недостаточность, связанную с сепсисом, можно проанализировать маркер проапоптоза, такой как каспаза-3, а также α1-микроглобулин для проверки трубчатого повреждения в почках. Орган-специфический анализ маркеров, таких как CINC-1, MCP-1 и IL-6, также может предоставить информацию о специфической воспалительной реакции органа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представленная система допускает эндотоксемию у гемодинамически стабильных животных, как сообщалось ранее9. В то время как среднее артериальное давление остается стабильным у животных с стимуляцией ЛПС и без нее, у животных развиваются такие характеристики сепсиса, как избыток отрицательного основания и сильная воспалительная реакция, измеренная цитокинами плазмы (через 6 часов после применения), такими как CINC-1 (867 нг / мл), MCP-1 (5027 нг / мл) и IL-6 (867 нг / мл) 8, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, позволяет создать высоко воспроизводимую, но простую в освоении модель сепсиса, которая может быть адаптирована в соответствии с вопросом исследования. Основные данные in vivo, относящиеся к функции органов, такие как частота сердечных сокращений, кровяное давление и насыщение периферических артерий кислородом, могут собираться непрерывно, а забор крови может выполняться повторно на протяжении всего эксперимента. Кроме того, могут быть установлены модификации в отношении протоколов замены жидко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов в отношении представленного исследования. Мартин Шлепфер подал патент на смягчение негативных последствий операции и/или анестезии для пациентов, использующих медицинские газы, в частности кислород (O2) и углекислый газ (CO2). Он получил неограниченные исследовательские гранты от Sedana Medical, Швеция, и от Roche, Швейцария, не связанные с этой работой.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Беатрис Бек-Шиммер (MD) и Эрика Шадде (MD) за их критический анализ и их ценный вклад в эту рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-0 шелковые шовные нитиEthicon, Соммервилль, Нью-ДжерсиK833 Стандартныйхирургический
26 внутривенный катетерBecton Dickinson, Франклин Лейкс, Нью-Джерси391349Стандартное оборудование для анестезии
6-0 LOOK черный плетеный шелкSurgical Specalities Corporation, Вайомиссинг, ПенсильванияSP114Стандартный хирургический
шприцевой насос AlarisBencton Dickinson
BetadineMundipharma, Базель, Швейцария7.68034E+12GTIN-число
Изогнутые тонкие наконечники микрощипцыWorld precision instruments (WPI), Сарасота, Флорида504513Облегчает сосудистую подготовку
Тонкие наконечники микрощипцыWorld precision instruments (WPI), Сарасота, Флорида501976Наконечники необходимо регулярно полировать
Infinity Delta XL Мониторинг анестезииDraeger, Lü beck, Германия
Изофлуран, флаконы 250 млAttane, Piramal, Mumbai, IndiaLDNI 22098Стандартное ветеринарное оборудование
Ketamine (Ketalar)Pfitzer, Нью-Йорк, Нью-Йорк
Липополисахарид (ЛПС) от Escherichia coli, серотип 055:B5Sigma, Бухс, Швейцария
Q-tips smallCarl Roth GmbH, Карлсруэ, ГерманияEH11.1Стандартный хирургический
RingerfundinBbraun, Мельзунген, Германия
Испаритель изофторана Tec-3Ohmeda, GE-Healthcare, Чикаго, Иллинойсбольше не доступенСтандартное ветеринарное оборудование
Xylazine (Xylazin Streuli)Streuli AG, Uznach, Швейцария

Ссылки

  1. Hotchkiss, R. S., Karl, I. E. The pathophysiology and treatment of sepsis. New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
  2. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).
  3. Vincent, J. L., et al. Assessment of the worldwide burden of critical illness: the intensive care over nations (ICON) audit. Lancet Respiratory Medicine. 2 (5), 380-386 (2014).
  4. Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
  5. Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Critical Care Medicine. 34 (6), 1589-1596 (2006).
  6. Gotts, J. E., Matthay, M. A. Sepsis: pathophysiology and clinical management. British Medical Journal. 353, (2016).
  7. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).
  8. Urner, M., et al. Insight into the beneficial immunomodulatory mechanism of the sevoflurane metabolite hexafluoro-2-propanol in a rat model of endotoxaemia. Clinical and Experimental Immunology. 181 (3), 468-479 (2015).
  9. Beck-Schimmer, B., et al. Which Anesthesia Regimen Is Best to Reduce Morbidity and Mortality in Lung Surgery?: A Multicenter Randomized Controlled Trial. Anesthesiology. 125 (2), 313-321 (2016).
  10. Deitch, E. A. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned. Shock. 9 (1), 1-11 (1998).
  11. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
  12. Perretti, M., Duncan, G. S., Flower, R. J., Peers, S. H. Serum corticosterone, interleukin-1 and tumour necrosis factor in rat experimental endotoxaemia: comparison between Lewis and Wistar strains. British Journal of Pharmacology. 110 (2), 868-874 (1993).
  13. Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29 (5), 572-576 (2008).
  14. Thiemermann, C., Ruetten, H., Wu, C. C., Vane, J. R. The multiple organ dysfunction syndrome caused by endotoxin in the rat: attenuation of liver dysfunction by inhibitors of nitric oxide synthase. British Journal of Pharmacology. 116 (7), 2845-2851 (1995).
  15. Osuchowski, M. F., et al. Minimum quality threshold in pre-clinical sepsis studies (MQTiPSS): an international expert consensus initiative for improvement of animal modeling in sepsis. Intensive Care Medicine Experimental. 6 (1), 26(2018).
  16. Fink, M. P., Heard, S. O. Laboratory models of sepsis and septic shock. Journal of Surgical Research. 49 (2), 186-196 (1990).
  17. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: Setting the stage. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (10), 854-865 (2005).
  18. Balls, M. The principles of humane experimental technique: timeless insights and unheeded warnings. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 144-148 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи