Изоляция и визуализация живых, интактных кардиостимуляторных областей почечной лоханки мыши путем вибратомного сечения

Краткое содержание

Целью этого протокола является изоляция неповрежденных областей кардиостимулятора почечной лоханки мыши с помощью вибратомного сечения. Эти участки затем могут быть использованы для визуализации in situ Ca²⁺ для выяснения переходных свойств Ca²⁺ клеток кардиостимулятора и других интерстициальных клеток в срезах вибратома.

Аннотация

Почечная лоханка (РП) представляет собой воронкообразную гладкую мышечную структуру, которая облегчает нормальную транспортировку мочи из почки в мочеточник регулярными, пропульсивными сокращениями. Регулярные сокращения RP зависят от активности кардиостимулятора, которая происходит из наиболее проксимальной области RP в тазово-почечном соединении (PKJ). Из-за трудностей с доступом и сохранением неповрежденных препаратов PKJ большинство исследований по кардиостимулятору RP были сосредоточены на одноклеточной электрофизиологии и экспериментах с визуализацией Ca^2+. Хотя в результате такой работы появились важные откровения о темповом замещения RP, эти эксперименты имеют несколько внутренних ограничений, включая неспособность точно определить клеточную идентичность в смешанных суспензиях и отсутствие визуализации in situ активности кардиостимулятора RP. Эти факторы привели к ограниченному пониманию механизмов, лежащих в основе нормальных ритмических сокращений RP. В этой статье описан протокол для подготовки неповрежденных сегментов PKJ мыши с использованием метода вибратомного секционирования. Комбинируя этот подход с мышами, экспрессифицируя клеточные репортеры и генетически закодированные индикаторы Ca^2+, исследователи могут более точно изучить конкретные типы клеток и механизмы, ответственные за перистальтические сокращения RP, которые жизненно важны для нормального транспорта мочи.

Введение

Почечная лоханка (RP) представляет собой воронкообразную гладкую мышечную структуру, которая транспортирует мочу из почки в мочеточник. РП транспортирует мочу, генерируя регулярные ритмические сокращения (перистальтика)^1,2,3,4,5,которые выталкивают болюс мочи из почки дистально в мочеточник и, в конечном счете, в мочевой пузырь, где она хранится до тех пор, пока не произойдет мочеиспускание^6,7. Потеря этой регулярной активности имеет тяжелые последствия, включая гидронефроз и почечную недостаточность^1,3,8; следовательно, существует острая необходимость в изучении механизмов, лежащих в основе регулярных, ритмичных сокращений РП. Перистальтические сокращения возникают из наиболее близкой области RP-в тазово-почечном соединении (PKJ)^{9,10,11, 12,13,14,15} (Фиг.1A-C)и распространяются дистально для выталкивании мочи из сосочка в РП(Рисунок 1В). Электрическая активность кардиостимулятора регистрируется в PKJ как спонтанные переходные деполяризации^{10,11,12,13,15, 16,17,}которые, как полагают, возникают из специализированных клеток кардиостимулятора. Считается, что эти кардиостимуляторы, ранее называемые атипичными гладкомышечными клетками (ASMC), генерируют или координируют активность кардиостимулятора и управляют сокращениями «типичных» гладкомышечных клеток (SMC)^{9,10,11, 18,19,20, 21,22,23.}

ASMC наиболее распространены в проксимальном RP, на PKJ(Рисунок 1A-C),где перистальтические сокращения и электрическая активность кардиостимулятора возникают^{5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22}. Недавно опубликованное исследование этой группы идентифицировало рецептор фактора роста тромбоцитов-альфа (PDGFRα) в сочетании с тяжелой цепью гладкомышеского миозина (smMHC) в качестве уникального биомаркера для этих интерстициальных клеток (ИС)^24,что было подтверждено другими группами^25. Основываясь на их морфологии и структуре экспрессии белка, эти клетки были названы PDGFRα⁺ IC типа 1 (PIC1)^24,26. PIC1 находятся в мышечном слое PKJ, где они отображают высокочастотные, кратковременные переходные периоды Ca^{2 +,} которые, как считается, лежат в основе генерации потенциалов кардиостимулятора^24. Однако в PKJ существуют и другие типы клеток, в том числе несмМГК-экспрессирующие PDGFRα⁺ ИС (PIC2s) в адвентитном слое. В предыдущих докладах высказывались предположение о том, что ИС, не являющиеся smMHC, могут участвовать в регулировании деятельности кардиостимуляторов^19. Однако дальнейшему изучению ИС, не являющихся smMHC, препятствует плохое различие во время исследований визуализации Ca^2+. Как правило, гетерогенные типы клеток в препаратах RP без разбора нагружаются Ca²⁺-чувствительными красителями (например, Fluo-4). Чтобы преодолеть эти проблемы и изучить различные типы клеток в RP, генетически закодированные индикаторы Ca^{2 +} (GECIs) могут быть использованы для селективной экспрессии Ca^{2 +}-чувствительных флуорофоров в интересующих типах клеток.

Большинство исследований, разъясняющих переходные свойства Ca²⁺ в PIC1s/ASMC, были достигнуты путем визуализации тканевых препаратов RP с плоским листом^19,21,27. Поскольку PIC1s являются единственным типом клеток в PKJ для экспрессии smMHC, условная экспрессия GECI, GCaMP, в smMHC⁺ клетках подходит для изучения PIC1s в этой конфигурации. Однако, поскольку PIC1s и PIC2 экспрессируют PDGFRα, условная экспрессия вариантов GCaMP в клетках PDGFRα⁺ запрещает различение клеток в препаратах с плоским листом. Чтобы обойти эту проблему, был использован подход к разделу вибратома для различения PIC1 и PIC2 по всей стенке ткани PKJ^24. Чтобы выявить эти дискретные клеточные популяции, RP был разделен коронально, что позволило идентифицировать PIC2s в адвентициях и PIC1 в мышечной стенке на основе известных иммуногистохимических моделей маркировки и экспрессии GECI. В результате этого нового подхода к визуализации PKJ было обнаружено, что PIC1 и PIC2 демонстрируют различные сигнальные свойства Ca^{2+ 24.} Кроме того, путем выделения наиболее близких участков области PKJ(рисунок 2)область кардиостимулятора RP была сохранена таким образом, который не был достигнут ранее. Здесь описан протокол, чтобы показать, как изолировать препараты PKJ из почки мыши с помощью вибратомного сечения, как настроить эти препараты для экспериментов с визуализацией Ca^{2 +} и как различать различные типы клеток через стенку PKJ.

Протокол

Все используемые мыши и протоколы, описанные в этом исследовании, соответствовали Руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и Институциональному комитету по использованию и уходу за животными в Университете Невады, Рино, штат Невада. Эксперименты и использование животных также соответствовали принципам и правилам, описанным в Grundy^28.

1. Генерация мышей PDGFRα-GCaMP6f и SMCGCaMP3

1. Скрещивайте мышей GCaMP6f^lox/+ (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze}/J) с мышами PDGFRα^Cre (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) для генерации мышей PDGFRα-GCaMP6f.
2. Скрещивает GCaMP3^lox/+ мышей (B6.129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J) с самцами мышей smMHC^CreERT2 (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J) для генерации мышей SMC-GCaMP3.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Только самцы мышей скрещиваются (мышиGCaMP3^lox/+ и мыши smMHC^CreERT2) могут быть использованы, поскольку экспрессия Cre управляется из Y-хромосомы. Мыши smMHC^CreERT2 также могут быть скрещены с мышами GCaMP6f^lox/+ для улучшения отношения сигнал/шум Ca²⁺ и более быстрых временных свойств сигнала Ca^2+.

2. Подготовьте и введйте трансгенным мышам тамоксифен, чтобы индуцировать условную экспрессию GCaMP

1. Активировать индуцируемую Cre-рекомбиназу для клеточной экспрессии GCaMP в определенных типах клеток, как описано^{ранее 29.}

3.   Подготовьте растворы

1. Готовят 1 л раствора бикарбоната Кребса-Рингера (КРБ), содержащего 120,35 мМ NaCl, 5,9 мМ KCl, 15,5 мМ NaHCO_3,1,2 мМ_Na2HPO 4,1,2 мМ MgCl_2,11,5 мМ глюкозы и 2,5 мМ CaCl_2. В день использования выдерживая раствор КРБ на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: KRB можно хранить при 4 °C в течение одной недели и следует предварительно разпузырить смесью 97% O₂ и 3% CO 2 в течение не_менее 10 мин перед использованием.

4. Подготовьте кремниевые эластомерные диссекционные и микроскопические тарелки для визуализации

1. Смешайте компоненты эластомера кремния в соответствии с инструкциями производителя. Заполните чашку Петри 35 мм x 10 мм и чашку Петри 60 мм x 15 мм примерно на одну четверть, заполненную жидким кремниевым эластомером для экспериментов по визуализации и вскрытию соответственно. Полимеризуйте эластомер кремния при 37 °C в течение 1 дня перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы усилить контраст тонких участков почек, нанесите небольшой черный круг бумаги на основание чашки Петри перед заполнением кремниевым эластомером.

5. Рассечение почек

1. Обезболивать мышей путем вдыхания 3-4% изофлурана в проветриваемом капюшоне. Подтвердите индукцию глубокой анестезии потерей рефлекса защемления носков и / или хвоста, а затем усыплите мышей вывихом шейки матки.
2. Нанесите 70% этанола на грудь, чтобы смочить мех. Используя ножницы для наружного рассечения, откройте брюшную полость через продольный разрез, с ножничными лопастями, отогленными от животного, чтобы предотвратить повреждение внутренних органов.
3. Используя внутренние тканевые щипцы и внутренние расслоители ножницы, защемляйте кишечник и поднимайте его подальше от брюшной стенки. Во время подъема кишечника отрежьте нижнюю часть кишечника, свободную от тела в проксимальной части двенадцатиперстной кишки и дистальной части толстой кишки, чтобы получить доступ к забрюшину, содержащему почки.
4. Как только почки будут подвергнуты воздействию, извлеките их по отдельности. Осторожно защемить и поднять дистальный конец мочеточник (~ 4 мм от почки) тканевыми щипцами. Используя ножницы для рассечения, разрезайте под защемленным мочеточником по направлению к почке. Продолжайте резать под почкой, пока она не освободится от окружающей соединительной ткани.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать целостность тканей и консистенцию резки во время разрезания вибратома, почка должна быть как можно более неповрежденной. Чтобы обеспечить это, избегайте защемления или разрезания почки щипцами и ножницами для рассечения.
5. Поместите почку с прикрепленным мочеточником в ледяной раствор КРБ. Повторите шаги 5.4 и 5.5 с контралатеральной почкой. Выдерживая почки в растворе КРБ на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно переходите к следующему разделу протокола, чтобы сохранить жизнеспособность ткани PKJ. Из-за своего анатомического расположения глубоко в паренхиме почки ПКЖ лишен контакта с раствором КРБ.

6. Подготовьте почку к вибратомовой секции

1. Перенесите почку в силиконовую эластомерную форму для рассечения (60 мм x 15 мм) и заполните ее ледяным раствором KRB до тех пор, пока почка не будет полностью погружена.
2. Под рассекающим микроскопом закрепить почку к основанию тарелки, вставив миниатюрные булавки в проксимальный мочеточник и через тонкую переднюю почечную капсулу или окружающую жировую ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы не проколоть ткань паренхимы почки.
3. Используйте тонкие пружинные ножницы и внутренние щипцы для удаления жировой ткани из основания почки, чтобы обнажить дистальный РП и проксимальный мочеточник.
4. Удалите проксимальный мочеточник и часть дистального РП из основания РП с помощью тонких пружинных ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы не разрезать окружающую паренхиму почек. Черная пунктирная линия на рисунке 1А указывает приблизительное положение этого разреза. Этот разрез создает плоское основание на почке для более равномерного сечения тканей. При рассечении почки необходимо знать анатомическое положение области PKJ. На рисунке 1B показано, что неповрежденная почка может быть разрезана вдоль сагиттальной плоскости, чтобы обнажить продолговатый мозг, сосочек (дистальный продолговатый мозг, где сходятся собирающиеся протоки) и проксимальный и дистальный RP. Если сосочек должен быть полностью обнажен, как на рисунке 1C, PKJ и проксимальный RP (prox RP) могут быть визуализированы. Однако это не следует делать для техники вибратома; Это описание предназначено для ориентации читателя на местоположение PKJ в целом, подчеркнутое анатомическим различием, показанным на проходящих световых изображениях области PKJ и средней области RP на рисунке 1D,E.
5. Проткните внешнюю почечную капсулу тонкими щипцами, отводя кончики от тела почек. Используя щипцы каждой рукой, защемляйте свободные концы капсулы и очищайте их друг от друга. Продолжайте отшелушивать оставшуюся почечную мембрану капсулы до тех пор, пока она не будет полностью удалена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Почечная капсула представляет собой жесткий, волокнистый слой, который окружает почку. Он должен быть удален перед секционированием вибратома для оптимальной резки.

7. Подготовьте и откалибруйте инструмент вибратома

1. Вставьте лезвие бритвы в держатель лезвия инструмента вибратома и отрегулируйте угол зазора лезвия до ~18°.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве дополнительного этапа для более качественного сечения следует использовать калибровочный блок (поставляемый с некоторыми вибратомными приборами) для регулировки положения лезвия для каждого нового лезвия, используемого в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Это обеспечит оптимальное позиционирование лезвия и минимизирует вертикальную вибрацию.
2. Отрегулируйте скорость продвижения лезвия до 0,2 мм/с, горизонтальную вибрацию/отстой лезвия до амплитуды 2,00 мм, а размер Z-шага лезвия до ~100-150 мкм. Убедитесь, что толщина участка почки не превышает 150 мкм, так как это негативно повлияет на эксперименты по визуализации Ca^{2 + (потому} что стенка PKJ часто будет катиться и складываться сама по себе, если она слишком толстая).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь должен точно настроить эти параметры резки, потому что настройки будут варьироваться между отдельными препаратами почек и вибратомными инструментами. Тонкая настройка должна происходить во время секционирования, когда пользователь может визуально осмотреть участки под микроскопом, как описано в шаге 7.2.
3. Установите ледяную ванну и буферный лоток на инструмент вибратома. Наполните ледяную ванну измельченным льдом, а внутреннюю область сцены наполните ледяным раствором KRB (заполните примерно до половины заполнения). Во время вибратомного сечения контролируйте и заменяйте растаянный лед.

8. Вибратом, разделяющий почку

1. Используйте тупые щипцы, чтобы аккуратно схватить и извлечь подготовленную почку из ледяного раствора КРБ. Немедленно поместите почку на абсорбивную бумагу на ~2-4 с, чтобы удалить лишнюю внешнюю влагу. Аккуратно прокатите почку по абсорбирующей бумаге, чтобы убедиться, что все стороны паренхимы высохли, чтобы была оптимальная адгезия почки к стадии вибратома.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку РП расположен внутри почки и, следовательно, защищен наружной паренхимой, этот короткий период высыхания не будет наносить ущерба целостности тканей.
2. Немедленно нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея (~ 1^см2)на основание пластины образца вибратома и используйте тупые щипцы, чтобы поместить почку, мочеточник стороной вниз, на область, покрытую клеем. Осторожно надавите вниз на верхнюю часть почки плоским краем щипцов примерно на 10-20 с, чтобы высушить клей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стабилизировать почку во время этой процедуры, используйте дополнительную пару щипцов, чтобы держать почку в вертикальном положении по мере высыхания клея. Очень важно, чтобы почка прилипла к пластине образца в вертикальном положении, чтобы секции были разрезаны прямо. Чтобы убедиться, что почка успешно прилипла к образцу пластинки, осторожно отодвиньте боковую часть почки. Если почка успешно прилипла к пластине, основание почки должно оставаться закрепленным на пластине.
3. Прочно закрепите пластину образца на дне буферного лотка. Отрегулируйте уровень раствора КРБ так, чтобы верхняя часть почки была полностью погружена. Во время этапов секционирования, когда лезвие вибратома перемещается глубже в буферный лоток, удалите раствор KRB, чтобы держатель лезвия не погружался в раствор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клей не полностью высох, прежде чем приступить к этому этапу, клей часто перемещается вверх от основания и далее к паренхиме почки. Этот избыток клея сделает сечение более изменчивым. Если это произошло, удалите почку из пластины и приступайте к свежему приготовлению почек.
4. Для автоматического сечения вибратома выберите начальное и конечное положения цикла резки вибратомного лезвия. Убедитесь, что эти положения ~ 0,5-1 см очищены от почки, чтобы гарантировать, что с каждым продвижением лезвия вся плоскость почки секается.
5. Подготовьте многозабочную плиту (24- или 48-скважинную) путем заполнения колодцев раствором КРБ и поместите пластину на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При генерации отдельные участки должны быть размещены в отдельных скважинах для отслеживания глубины участка.
6. Запустите процесс автоматической резки. Во время начального прохождения лезвия убедитесь, что лезвие соприкасается с самой верхушкой почки. Если контакт не производится, отрегулируйте начальное Z-положение лезвия.
7. Используя щипцы, собирайте участки, которые высвобождаются из почки. Немедленно перенесите секции в отдельные скважины и обратите внимание на Z-глубину секций, чтобы измерить приблизительное расположение PKJ в секциях почек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от параметров разреза, некоторые участки могут быть не отрезаны от почечного блока. Если это происходит, осторожно используйте тонкие пружинные ножницы, чтобы срезать участки от почечного блока. Пользователям также рекомендуется активно визуализировать участки под световым микроскопом, свободно плавая в отдельных скважинах, чтобы обеспечить оптимальные настройки разреза и расположение тканей. Участки, содержащие PKJ, обычно получают ~ 1000-1500 мкм из верхней части почки.
8. Продолжайте протокол секционирования до тех пор, пока области PKJ не станут более очевидными. В разделе репрезентативных результатов приведено описание регионов ПКЖ по мере их секционирования.
9. На этом этапе оптимизируйте параметры секционирования, чтобы гарантировать, что участки освобождены от блока почек равномерно и неповреждены. Кроме того, убедитесь, что области PKJ являются непрерывными и непрерывными, потому что сломанные стенки PKJ не позволят адекватно визуализировать клетки внутри стенки из-за коллапса. Если стены ломаются, уменьшите скорость сечения и увеличьте толщину сечения, а также продолжайте наблюдать за секциями под световым микроскопом для точной настройки параметров резания.
10. Хранить срезы при 4°C в растворе KRB до начала экспериментов.

9. Срез почки Ca^{2 +} получение изображения

1. Переложите отдельный срез почки в силиконовую эластомерную форму (35 мм x 10 мм) и немедленно наполните блюдо свежим ледяным раствором KRB.
2. Вставьте миниатюрные булавки по периферии почечного среза, чтобы закрепить участок к основанию тарелки для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для предотвращения перемещения участка, когда физиологические растворы перфузируются над срезом во время визуализации.
3. Поместите тарелку для визуализации на ступень вертикального вращающегося дискового конфокального микроскопа и немедленно начните перфузию раствором KRB.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался вертикальный микроскоп, оснащенный высокоскоростным вращающимся дисковым конфокальным сканером Nipkow.
4. Поддерживать скорость перфузии на уровне 3 мл/мин и температуру раствора КРБ на уровне 36 ± 1 °C. Перед визуализацией дайте срезу уравновешиваться в течение 1 ч.
5. Выберите соответствующий куб дихроичной визуализации и лазеры. Получайте изображения с помощью электронно-умножающего устройство с зарядовой связью (EMCCD) или научной комплементарной металл-оксидно-полупроводниковой камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальная система в этом протоколе оснащена 488-нм лазером для возбуждения GCaMP6f или GCaMP3. Изображения были получены с помощью камеры EMCCD с разрешением 512 x 512 пикселей.
6. Используйте объектив с низким увеличением, погружением в воду (4x или 10x), чтобы найти срез почки. Центрируете поле изображения на участках среза, где присутствует PKJ. Определите ориентиры, как показано на рисунке 2D,чтобы найти PKJ (то есть полукруги мышечных тканей, подвешенных между паренхиматозными тканями).
7. Как только PKJ будет найден, используйте объектив с более высоким увеличением (20x, 40x или 60x), чтобы увеличить интересуемую область.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе 20-кратная объективная численная апертура (NA) составляла 1,0, 40-кратная объективная NA составляла 0,8, а 60-кратная объективная NA была 1,0.
8. Различать различные клетки, представляющие интерес в стенке PKJ, используя трансгенных мышей, экспрессирующих GCaMP6f или GCaMP3 в PDGFRα⁺ клетках или SMC соответственно. Наблюдать различные типы переходных длительности Ca²⁺ в PDGFRα⁺ клетках в стенке PKJ в PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ почечных срезах(рисунок 3C,см. репрезентативные результаты для описания) и в GCaMP3⁺ SMC в SMC GCaMP3⁺ почечных срезах(рисунок 3D,см. репрезентативные результаты для описания).
9. После того, как ячейки, представляющие интерес в стенке PKJ, были идентифицированы, отрегулируйте интенсивность лазера, чтобы получить хорошее соотношение сигнал/шум. Записывайте изображения с частотой временной дискретизации от 16 Гц до 32 Гц с помощью соответствующего программного обеспечения для сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от интенсивности лазера, используемого во время визуализации, рекомендуется ограничить количество записей из-за отбеливающего воздействия на флуорофоры Ca^2+. Пользователь должен выбрать длину записи на основе конкретных экспериментальных целей.

10. Анализ изображений Ca²⁺

1. Выполнение анализа визуализации Ca²⁺ различных типов клеток в областях кардиостимулятора PKJ путем пространственно-временного картирования, как описано ранее для других интактных препаратов кардиостимулятора в желудочно-кишечном тракте^29,30.

Результаты

Визуализация PKJ in situ Ca²⁺ может выявить важную клеточную активность клеток RP-кардиостимуляторов. Используя мышей, которые экспрессируют генетически закодированные индикаторы Ca²⁺ (такие как GCaMP), управляемые клеточными промоторами, информация о кардиостимуляторе RP может быть получена с точностью и детализацией, которые невозможны из экспериментов по визуализации Ca^{2 +} из препаратов RP с плоским листом. Начало ПКЖ отличается внезапным появлением полукругов мышц, подвешенных между паренхиматозной тканью почки(Рисунок 2С;проксимальный ПКЖ заключен в пунктирную коробку). Во время последующих раундов сечения внутренний продолговатый мозг становится отличимым от окружающей кортикальной ткани. Под световым микроскопом внутренний мозг выглядит поперечно-полосатым в областях, более светлым по цвету по сравнению с кортикальной тканью и прерывистым на своей длинной оси с остальной частью почки(рисунок 2B,D). На этом этапе начнет появляться больше областей PKJ. Примеры этого показаны на рисунке 2D (пунктирные прямоугольники, H и G), где 3 полукруга мышцы подвешены паренхиматозной тканью. Эти мышечные полосы будут тесно приложены к внутреннему сосочку и, как правило, будут соседствовать с почечной артериолой(рисунок 2D,пунктирные прямоугольники; Рисунок 2F-H,черные наконечники стрел). По мере получения большего количества дистальных участков эти полосы мышц будут интегрироваться, образуя более полную, унифицированную структуру, указывающую на конец области PKJ(рисунок 2E).
На рисунке 3A,B показан участок PKJ при низком энергопотреблении (4-10x) от мыши, экспрессирующей GCaMP в PDGFRα⁺ клетках (GCaMP6f, экспрессируемый индуцируемой Cre-рекомбиназы, управляемой Pdgfra). Используя такие ориентиры, как почечный артериол(рисунок 3A;звездочка), экспериментаторы должны быть в состоянии легко различить тонкую стенку PKJ, подвешенную между паренхизмальной тканью(рисунок 3B;звездочки). Экспрессия GCaMP6f в этой специфической трансгенной ткани распространяется по всей ширине PKJ, как по мышечным, так и по адвентициальным слоям(рисунок 3C).

В PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ почечные срезы сеть клеток, которая обычно простирается по ширине стенки PKJ, будет флуоресцентной(рисунок 3C)и отображать колеблющиеся переходные переходные процессы Ca²⁺ различной длительности и частоты. PDGFRα⁺ ячейки в стене PKJ отображают два различных типа переходных длительности Ca^2+. В адвентициальном слое (ориентированном ближе к коре) определяются PDGFRα+ клетки, присутствующие в виде сети клеток и их процессы. Адвентициальные PDGFRα⁺ клетки демонстрируют низкочастотные (4 ± 2,7 Гц) и длительные (1 ± 0,67 с) переходные периоды Ca^2+. Второй слой клеток PDGFRα^+, присутствующих в мышечном слое (ориентированный ближе к продолговатому мозгу), демонстрирует аналогичные переходные частоты и длительности Ca^2+, что и клетки SMC GCaMP3⁺ (описанные ниже), поскольку они относятся к тому же типу клеток.

В срезах почек SMC GCaMP3⁺ слой клеток GCaMP3⁺ присутствует в мышечном слое(рисунок 3D). В адвентициальном слое не будет флуоресцентного сигнала(рисунок 3D;звездочка). GCaMP3⁺ SMC в мышечном слое обычно демонстрируют высокочастотные (10 ± 4 Гц) и кратковременные (632 ± 74 с) переходные периоды Ca^2+. PDGFRα⁺ клетки, расположенные в адвентиции PKJ, вызывают длительные, низкочастотные переходные процессы Ca²⁺ (рисунок 3E,видео 1). Тем не менее, эксперименты с визуализацией Ca²⁺ из тканей, экспрессирующих GCaMP3, приводимые в действие промотором Myh11, ограничены мышечным аспектом PKJ(рисунок 3D). По сравнению с PDGFRα⁺ клетками в адвентиции, SMC чаще запускали переходные периоды Ca²⁺ (Рисунок 3F,Видео 2).

В дополнение к пониманию сигнальных свойств в PKJ PDGFRα⁺ ИС, применение этого метода для изучения других типов клеток в почках с вибратомным сечением было продемонстрировано в этой статье. При тщательном изучении почечного продолговатого мозга (у мышей, экспрессирующих GCaMP6f в клетках PDGFRα⁺⁾ наблюдался массив флуоресцентных сигналов Ca²⁺ внутри и вокруг собирающих протоков(Видео 3). Медуллярные PDGFRα⁺ клетки запускали спонтанные Ca²⁺ переходные процессы переменной частоты и длительности. Эти исследования визуализации Ca²⁺ участков вибратома почек также могут быть расширены для изучения почечных артериол (диаметр ~ 50-80 мм), которые часто соседствуют с сегментами мышц PKJ(рисунок 2F,G; белые стрелки). Визуализация Ca²⁺ почечных артериол (из ткани, экспрессии GCaMP в гладкомышечные клетках) демонстрирует колебания ca²⁺ транзиторов в SMC(Видео 4).

Рисунок 1:Основная анатомия почек и расположение области кардиостимулятора PKJ. (A) Диаграмма интактной почки, показывающая ориентацию RP и мочеточника. Почечная артерия и почечная вена отображаются красным и синим цветами соответственно. (B)Интактная почка может быть разрезана вдоль сагиттальной плоскости, чтобы обнажить внутренний аспект почки, включая продолговатый мозг, сосочек (дистальный продолговатый мозг, где сходятся собирающиеся протоки), а также проксимальный и дистальный RP. (C) Продолговатый мозг и сосочек могут быть иссечены, чтобы полностью обнажить PKJ и prox RP. (D и E)представляют собой передаваемые световые изображения из области кардиостимулятора PKJ и дистального RP соответственно. Последовательное сечение к дистальному концу таза приводит к тому, что полукруги мышц в области PKJ(Di)объединяются в одно, более толстое мышечное кольцо(Ei), которое инкапсулирует весь сосочек. Черные, пунктирные прямоугольники в Di и Ei показывают приблизительные области в коронарных участках почек, где были получены изображения пропускаемого света. Ориентация изображений D и E на 90° против часовой стрелки к соответствующим вставкам(Di и Ei). Шкала стержней в D и E = 20 мкм. Сокращения: РП = почечная лоханка; prox RP = проксимальный почечный полок таза; PKJ = тазово-почечное соединение; PICs = рецептор-альфа-положительные интерстициальные клетки рецептора фактора роста тромбоцитов; SMC = гладкомышечная клетка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2:Вибратомное сечение целых почек для создания тонких срезов. (A) Почки устанавливаются мочеточником лицом вниз к основанию инструмента вибратома, а стандартное лезвие (прикрепленное к головке вибратома) используется для разрезания последовательных участков от проксимального до дистального конца почки. (B)Схематическое изображение тонкого сечения, вырезанного из всей почки с аннотированными ориентирами. Сегменты мышц PKJ (черный пунктирный прямоугольник) часто обнаруживаются подвешенными между паренхизмальной тканью. (C)Легкое микроскопическое изображение проксимального отдела почки. Появление мышечных полос, взвешенных между паренхимозными тканями, указывает на начало проксимальных проекций PKJ (указывается внутри белого пунктирного прямоугольника). (D)Световое микроскопическое изображение, представляющее оптимальную область, где можно найти несколько (2-3) сегментов PKJ (области в белых пунктирных прямоугольниках). Тонкие мышечные полоски PKJ подвешены между паренхимой почек и тесно связаны с почечными артериолами и продолговатым мозгом. (E) Легкое микроскопическое изображение дистального отдела почки. Отдельные мышечные сегменты слились, образовав единую непрерывную мышечную полосу (белый пунктирный прямоугольник), которая окружает внутренний сосочек (не присутствующий на этом изображении). Шкала шкал C-E = 500 мкм. F-H Увеличенные (20x) области от панели D указывают на расположение PKJ (черные наконечники стрел), почечных артериол (белые наконечники стрел) и вырезанные участки для изоляции PKJ (пунктирные белые линии). Шкала баров F-H = 100 мкм. Аббревиатура: PKJ = тазово-почечный узел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3:Ca²⁺ визуализация вибратомных секций. (A)Репрезентативное маломощное изображение (4x) вибратомного сечения, обозначающего расположение почечной артериолы (звездочка). Шкала бара = 200 мкм. (B) Увеличенное (20x) репрезентативное изображение PKJ (меченое), взвешенное между паренхизальной тканью почки, обозначающее расположение мышцы PKJ (белый наконечник стрелы), почечной артериолы (звездочка). Шкала бара = 50 мкм.(C)Мощное (40x) изображение PKJ, экспрессирующего GCaMP в PDGFRα⁺ клетках. Шкала бара = 20 мкм. (D) Мощное (20x) изображение PKJ, экспрессивающего GCaMP в гладкомышечные клетки. Шкала = 20 мкм.(E)Пространственно-временной карты переходных процессов Ca^2+, отобранных из ячейки GCaMP⁺ PDGFRα^+, указанной на панели C. Найдите таблицу, закодированную для F/F₀. (F)Пространственно-временной карты переходных процессов Ca^2+, отобранных из ячейки GCaMP⁺ PDGFRα^+, указанной на панели D. Найдите таблицу, закодированную для F/F₀. (G)Репрезентативные данные для переходной частоты Ca²⁺ (Гц) для Ячеек GCaMP⁺ PDGFRα⁺ и Ячеек GCaMP⁺ smMHC. (H)Репрезентативные данные для Ca²⁺ переходной длительности (ов) для GCaMP⁺ PDGFRα⁺ клеток и GCaMP⁺ smMHC ячеек. Сокращения: PKJ = тазово-почечное соединение; PDGFRα⁺ = рецептор фактора роста тромбоцитов-альфа-положительный; smMHC = гладкая мускулатура миозина тяжелая цепь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Спонтанные переходные вещества Ca²⁺ в GCaMP⁺ PDGFRα⁺ клетки в вибратомных секциях PKJ. Сокращения: PKJ = тазово-почечное соединение; PDGFRα⁺ = рецептор фактора роста тромбоцитов-альфа-положительный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Видео 2: Спонтанные транзиторы Ca²⁺ в GCaMP⁺ гладкомышечные клетки в вибратомных участках тазово-почечного соединения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Видео 3: Спонтанные транзиторы Ca²⁺ в GCaMP⁺ PDGFRα⁺ клетки в почечных медуллярных вибратомных участках. Аббревиатура: PDGFRα⁺ = рецептор фактора роста тромбоцитов-альфа-положительный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Видео 4: Низкоамплитуда Ca²⁺ преходящая активность в вибратомных отделах почечной артериолы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Обсуждение

RP состоит из гетерогенной популяции клеток с дифференциальной плотностью клеток, наблюдаемой в различных областях RP. PIC1 (ранее называемые ASMC) наиболее распространены в PKJ, где активность кардиостимулятора возникает^24. Протокол, описанный здесь, позволяет исследователям изолировать область кардиостимулятора от остальной части почки мыши. Разрезая участки PKJ с использованием вибратома, области кардиостимулятора RP (идентифицированные как мышечные полосы, прикрепленные к паренхиме) остаются нетронутыми, что позволяет использовать визуализацию in situ для точного изучения клеток кардиостимулятора RP в сочетании с клеточными флуоресцентными репортерами.

Хотя этот подход может дать новое представление о темповом RP, есть некоторые соображения, с которыми экспериментаторы должны быть знакомы для улучшения результатов визуализации и эффективности секционирования. Для неподготовленного пользователя этот метод изоляции и визуализации PKJ легче освоить, чем типичный резкий рассечение препаратов RP с плоским листом. Резкое рассечение РП из целых почек требует недель последовательной практики, чтобы успешно изолировать жизнеспособные ткани для физиологических экспериментов. Поскольку этот протокол сечения вибратома требует небольших острых знаний о рассечении, он доступен для пользователей, которые не имеют опыта вскрытия других гладкомышеных структур.

Тем не менее, есть некоторые критические моменты, которые следует отметить для этого протокола. Успешное прилипание почек к пластине образца вибратома требует ловкости и терпения. Если почка ориентирована неправильно и наклонена в одну сторону, будут обрезаны косые, а не прямые участки. Из-за деликатного характера PKJ косой угол часто может разрушить мышечные полосы области кардиостимулятора. Кроме того, визуализация косых участков приводит к плохому получению изображений, поскольку клеточные сети обычно не находятся в одной фокальной плоскости. Процедура также занимает много времени, при этом секционирование одной почки часто занимает до часа, в течение которого установка требует мониторинга.

В то время как движение вибратома может быть ускорено, если скорость увеличивается слишком сильно (>20%, чем рекомендуется в протоколе), лезвие будет измельчать, а не чисто резать почку, что приводит к потере деликатных структур PKJ. Аналогичным образом, слишком низкая скорость резания может привести к тому, что секция станет неровной. Оптимизация скорости резания и амплитуды лезвия имеет важное значение. Необходимо также соблюдать осторожность при обращении с вибратомными секциями. Из-за своей деликатной природы мышцы PKJ легко нарушаются во время обработки и могут порваться. Хорошо обученный пользователь сможет собрать примерно 1-2 области PKJ на 4 среза почки, которые подходят для экспериментов с визуализацией Ca^{2 +.} Как правило, участки PKJ, которые не соответствуют критериям визуализации Ca^2+, имеют: 1) плохую экспрессию GCaMP, 2) искаженную стенку PKJ или 3) сломанную стенку PKJ. Для анализа данных можно было бы взять пробу примерно по 3-4 ячейки на поле зрения (FOV).

В то время как в FOV PDGFRα-GCaMP6f и SMC-GCaMP3 PKJ есть много клеток, небольшие движения тканей часто исключают клетки из анализа. Обычно эту проблему можно решить, применив протокол стабилизации к изображениям. В условиях, когда препараты не перемещаются, по меньшей мере 3-5 клеток могут быть отобраны из секций PDGFRα-GCaMP6f и 5-6 клеток из секций SMC-GCaMP3. Как правило, время, занимаемое от жертвоприношения животных (оптимальный возраст для мышей составляет 8-16 недель) до выполнения экспериментов с визуализацией Ca^2+, составляет 2-3 ч, что достаточно для обеспечения целостности тканей, если ткани инкубируются в ледяных растворах на протяжении всей процедуры, когда это необходимо. Таким образом, здесь был описан протокол резки вибратома для генерации неповрежденных препаратов областей RP PKJ из почки мыши. Этот метод позволяет сохранить области кардиостимулятора RP для исследований визуализации in situ Ca^{2 +} для изучения механизмов кардиостимулятора RP.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
24-луночный планшет для культивирования	ThermoFisher Scientific	142485	Для хранения срезов почек в
чашках Петри размером 35 мм x 10 мм	Sigma Aldrich	CLS430165	Чашка для визуализации кальция для срезов почек
48-луночная культуральная тарелка	ThermoFisher Scientific	152640	Для хранения срезов почек в
чашке Петри размером 60 мм x 15 мм	Sigma Aldrich	P5481	Чашка для острого препарирования почек
Абсорбирующая бумага	Fisher Scientific	06-666A	Для сушки почек перед нанесением клея
В6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Лаборатория Джексона	13148	GCaMP3 мыши
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Лаборатория Джексона	24105	GCaMP6f мыши
B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	Лаборатория Джексона	19079	smMHC-CRE Мыши
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	Лаборатория Джексона	13148	PDGFRa-CRE
Мыши Цианоакрилатный клей	Amazon	B001PILFVY	Для приклеивания почки к пластине образца
Этанол	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	Для вскрытия
Сверхтонкие боннские ножницы	Инструменты Fine Science	14083-08	Используются для внутреннего препарирования
ножницы Тонкие ножницы	Fine Science Tools	14060-09	Используются для наружных ножниц для препарирования
Щипцы с тонким наконечником	Fine Science Tools	11254-20	Используются для тонкого препарирования почек
Gillette Silver Blue Двухлезвийные лезвия	Amazon	B009XHQGYO	Для вставки в держатель лезвия вибратома
ImageJ	NIH		Для анализа визуализации кальция
Изофлуран	Baxter	NDC 1001936060	Для
анестезии Микробулавки Minutien	Fisher Scientific	NC9677548	Штифты разрезали пополам для уменьшения их длины
Силиконовый эластомер	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
Студенческие щипцы Адсона	Fine Science Tools	91106-12	Для бережного удержания и перемещения почки
Студенческие щипцы Dumont Fine	Science Tools	91150-20	Используются для внутреннего препарирования щипцами
Vannas пружинные ножницы	Fine Science Tools	15000-03	Для острого препарирования и очистки изолированной почки
Vibrocheck	Leica	14048142075	Дополнительный компонент для калибровки движения лезвия во время резки
Вибрационное лезвие VT1200 S Microtome	Leica	14912000001	конфигурации 1 используется в нашем протоколе