Методическая статья

Иммунофлуоресцентное окрашивание, конфокальная визуализация и 3D-реконструкция синоатриального и атриовентрикулярного узла у мыши

DOI:

10.3791/62058

⸱

22 декабря 2020 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставляем пошаговый протокол для иммунофлуоресцентного окрашивания синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) в сердцах мышей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электрический сигнал, физиологически генерируемый клетками кардиостимулятора в синоатриальном узле (SAN), проводится через проводящую систему, которая включает в себя атриовентрикулярный узел (AVN), чтобы обеспечить возбуждение и сокращение всего сердца. Любая дисфункция SAN или AVN приводит к аритмиям, что указывает на их фундаментальную роль в электрофизиологии и аритмогенезе. Мышиные модели широко используются в исследованиях аритмии, но конкретное исследование SAN и AVN остается сложным.

SAN расположен на стыке crista terminalis с верхней полой веной, а AVN расположен на вершине треугольника Коха, образованного отверстием коронарного синуса, трикуспидальным кольцом и сухожилием Тодаро. Однако из-за небольших размеров визуализация с помощью обычной гистологии остается сложной задачей и не позволяет изучать SAN и AVN в их 3D-среде.

Здесь мы описываем цельномонтный иммунофлуоресцентный подход, который позволяет локально визуализировать меченые мыши SAN и AVN. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание предназначено для небольших участков ткани без необходимости ручного сечения. С этой целью сердце мыши рассекают, удаляют нежелательные ткани с последующей фиксацией, пермеабилизацией и блокировкой. Затем клетки проводящей системы внутри SAN и AVN окрашивают антителом против HCN4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия и обработка изображений позволяют дифференцировать узловые клетки и работающие кардиомиоциты, а также четко локализовать SAN и AVN. Кроме того, дополнительные антитела могут быть объединены для маркировки других типов клеток, таких как нервные волокна.

По сравнению с традиционной иммуногистологией, полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание сохраняет анатомическую целостность сердечной проводящей системы, что позволяет исследовать AVN; особенно в их анатомии и взаимодействиях с окружающими рабочими клетками миокарда и немиоцитарными клетками.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аритмии являются распространенными заболеваниями, поражающими миллионы людей, и являются причиной значительной заболеваемости и смертности во всем мире. Несмотря на огромные успехи в лечении и профилактике, такие как разработка кардиостимуляторов, лечение аритмий остается сложным, в первую очередь из-за очень ограниченных знаний о механизмах основного заболевания 1,2,3. Лучшее понимание как нормальной электрофизиологии, так и патофизиологии аритмий может помочь разработать новые, инновационные и причинно-следственные стратегии лечения в будущем. Кроме того, для всестороннего изучения аритмогенеза важно локализовать и визуализировать конкретную систему сердечной проводимости на животных моделях, таких как мыши, поскольку мыши широко используются в электрофизиологических исследованиях.

Основными частями системы сердечной проводимости являются синоатриальный узел (SAN), где электрический импульс генерируется в специализированных клетках кардиостимулятора, и атриовентрикулярный узел (AVN), который является единственным электрическим соединением между предсердиями и желудочками4. Всякий раз, когда электрофизиологические свойства SAN и AVN изменяются, могут возникать аритмии, такие как синдром больного синуса или атриовентрикулярная блокада, которые могут привести к ухудшению гемодинамики, обмороку и даже смерти, и, таким образом, подчеркнуть существенную роль как SAN, так и AVN в электрофизиологии и аритмогенезе5.

Комплексные исследования SAN или AVN требуют точной локализации и визуализации обеих структур, в идеале в их физиологической среде. Однако из-за их небольших размеров и расположения в пределах рабочего миокарда, без установления четкой макроскопически видимой структуры, изучение анатомии и электрофизиологии SAN и AVN является сложной задачей. Анатомические ориентиры могут быть использованы для приблизительной идентификации области, содержащей SAN и AVN 6,7,8. Короче говоря, SAN расположен в межкавалевой области правого предсердия, прилегающей к мышечной crista terminalis (CT), AVN расположен в треугольнике Коха, установленном трикуспидальным клапаном, остиумом коронарного синуса и сухожилием Тодаро. До сих пор эти анатомические ориентиры в основном использовались для локализации, удаления, а затем изучения SAN и AVN как отдельных структур (например, с помощью обычной гистологии). Однако для лучшего понимания сложной электрофизиологии SAN и AVN (например, регуляторных эффектов соседних клеток рабочего миокарда) необходимо изучение проводящих систем в физиологической 3D-среде.

Полноуровневое иммунофлуоресцентное окрашивание представляет собой метод, который используется для изучения анатомических структур in situ при сохранении целостности окружающих тканей9. Используя преимущества конфокальной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений, SAN и AVN могут быть визуализированы с флуоресцентно мечеными антителами, нацеленными на ионные каналы, специально выраженные в этих областях.

Этот следующий протокол объясняет необходимые шаги для выполнения хорошо зарекомендовавшего себя метода окрашивания цельным креплением для локализации и визуализации микроскопов SAN и AVN. В частности, этот протокол описывает, как (1) локализовать SAN и AVN анатомическими ориентирами для подготовки этих образцов к окрашиванию и микроскопическому анализу (2) выполнить полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание эталонных маркеров HCN4 и Cx43 (3) для подготовки образцов SAN и AVN для конфокальной микроскопии (4) для выполнения конфокальной визуализации SAN и AVN. Мы также описываем, как этот протокол может быть модифицирован, чтобы включить дополнительное окрашивание окружающего рабочего миокарда или немиоцитарных клеток, таких как автономные нервные волокна, что позволяет тщательно исследовать систему сердечной проводимости в сердце.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета, а все процедуры, проводимые на мышах, были одобрены правительством Баварии, Мюнхен, Германия (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Мыши C57BL6/J были приобретены в лаборатории Джексона.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны инструменты, необходимые для эксперимента. На рисунке 2 показана иллюстрация грубой анатомии сердца. На рисунке 3 показано расположение SAN и AVN в сердце взрослой мыши. На рисунке 4 показан подготовленный образец, загруженный на конфокальную микроскопию.

1. Препараты

  1. Готовят 4% раствор формальдегида (4% PFA) путем разбавления 10 мл 16% раствора формальдегида в 30 мл PBS.
  2. Готовят 15% раствор сахарозы и 30% раствор сахарозы, растворяя 15 г и 30 г порошка сахарозы в 100 мл PBS соответственно. После того, как порошок сахарозы полностью растворен, процедите раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм перед хранением при 4 °C.
  3. Приготовьте 3%-4% агарозный гель, добавьте 3 г или 4 г порошка агарозы и 100 мл 1x TAE (разбавленного из 50x TAE стокового раствора) в стакан. Поместите стакан на магнитную мешалку и кипятите до полного растворения агарозы.
  4. Приготовить форму для рассечения, аккуратно влив 30 мл агарозного геля (3%-4%) в чашку Петри диаметром 100 мм. Оставьте чашку Петри на скамейке при комнатной температуре, чтобы она остыла и затвердела.
  5. Готовят блокирующий раствор и моющий раствор по рецептам, приведенным в таблице 1. Подготовьте все растворы, приготовленные в день использования. Длительное хранение не рекомендуется.
  6. Подготовьте растворы антител, разбавляя их в холодном (4 °C) 1x PBS, защитите разбавление от света (например, обернув алюминиевую фольгу вокруг) и держите разведения на льду до использования. Разбавляют антитела незадолго до инкубации. Избегайте оставления разбавленных антител при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующее разведение антител должно быть протестировано с сопоставимыми образцами тканей путем выполнения обычного иммунофлуоресцентного окрашивания. Здесь мы проверили антитела, окрашивая замороженные участки, разрезанные толщиной 10 мкм.

2. Извлечение органов и подготовка тканей

  1. Обезболивают мышь, помещая ее в инкубационную камеру, подключенную к испарителюру изофлурана. Установите испаритель для подачи 4-5% изофлурана (96-95% кислорода соответственно).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полная анестезия подтверждается потерей постуральной реакции и корректирующего рефлекса путем осторожного перекатывания камеры до тех пор, пока мышь не будет помещена на спину.
  2. Поставьте мышь в лежачее положение на хирургическом столе. Поместите нос мыши в анестезиологическую маску, соединенную с модифицированной цепью Bain с внутренней трубкой, соединенной с испарителем изофлурана. Для поддержания анестезии используют 1-2% изофлуран в кислороде со скоростью потока 1 л/мин. Удалите лишние пары анестетика от мыши через внешнюю трубку маски и вытяните через канистру активированного угля, который поглощает избыток анестезирующего газа.
  3. При достижении полной анестезии вводят фентанил для обезболивания (0,1 μг/25 г массы тела в/.).
  4. Когда рефлекс защемления пальца ноги не обнаруживается, сделайте четкий разрез от югула до симфиза, используя ножницы для радужной оболочки для удаления меха и кожи. Сделайте еще один разрез слева направо под ребрами, используя ножницы радужной оболочки, чтобы осторожно открыть живот.
  5. Оживить меченого немного с помощью изогнутых щипцов, позволяющих разрезать диафрагму слева направо, не травмируя никаких органов. Разрежьте грудную клетку медиальной подмышечной линией с обеих сторон, используя ножницы для радужной оболочки глаза, чтобы перевернуть ее краниально и обеспечить доступ к сердцу.
  6. Разрезать нижнюю полую вену и нисходящую грудную аорту на уровне диафрагмы с помощью ножниц радужной оболочки. Проколите сердце иглой 27 G в области вершины, а затем осторожно протолкните иглу в левый желудочек (LV). Осторожно введите 5-10 мл ледяного PBS в LV для перфузии сердца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет сердца должен превратиться из красного в серый, что указывает на успешную перфузию PBS.
  7. Осторожно поднимите верхушку сердца с помощью пинцета, позволяющего перерезать крупные сосуды и удалить сердце.
  8. Иссекайте сердце, разрезая крупные артерии и вены как можно дальше от сердца, чтобы избежать любого повреждения верхней полой вены (SVC). Сохраните SVC, так как он будет служить важным ориентиром во время последующей обработки.
  9. После удаления сердца выключите испаритель изофлурана.
  10. Поместите сердце в тарелку для рассечения, наполненную ледяным холодом PBS под рассекающим микроскопом. После определения левой/правой и передней/задней части сердца поверните сердце передней частью сердца на дне тарелки (обнажите крупные сосуды, расположенные сзади).
  11. Обездвижить сердце, вставив маленькую зажимку верхушки и придатка левого предсердия (LAA) в агарозу в нижней части тарелки для рассечения (рисунок 2A). Используя тонкий пинцет и ножницы, осторожно удалите несердечную ткань вокруг SVC и нижней полой вены (IVC) (например, легкие, жир, перикард), чтобы обнажить межкаваловую область (рисунок 3A).
  12. Удалите большинство желудочков, разрезав параллельно канавку между желудочками и предсердиями с помощью микроножек. Сохранить небольшую часть желудочковой ткани для последующей нагрузки на оргстекловое кольцо.
  13. Для фиксации и обезвоживания поместите образец (содержащий предсердия, SVC и IVC) в 4% PFA на ночь при 4 °C.
  14. На следующий день переводят сердце на 15% раствор сахарозы в течение 24 часов при 4 °C.
  15. На следующий день переводят сердце на 30% раствор сахарозы в течение 24 часов при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации и обезвоживания на этапах 2.13, 2.14 и 2.15 образцы оставляют при 4°С без дальнейшего перемешивания или раскачивания.

3. Полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. Промыть сердце в 1% Тритоне Х-100, разведенном в PBS и блокировать и пермеабилизировать в блокирующем растворе (таблица 1) на ночь при 4 °C.
  2. Поместите сердце в пробирку объемом 1,5 мл и инкубируйте с антимышевым коннексином-43 кролика (разведение 1:200) и крысиным антимышевым HCN4 (разведение 1:200) антителами, разбавленными блокирующим раствором в течение 7 дней при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация первичных антител должна быть проверена перед использованием технических описаний в качестве ориентира. Другие антигены, представляющие интерес, также могут быть окрашены на этом этапе, если вид хозяина первичного антигена отличается от других. Более высокая концентрация тритона X-100 может помочь получить более эффективное окрашивание антителами, как это было продемонстрировано до10, но концентрация может быть определена индивидуально.
  3. Через 7 дней удаляют раствор, содержащий первичные антитела, с помощью пипетки и промывают сердце 1%-ным раствором Тритона Х-100 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
  4. После промывания инкубируйте сердце = с Alexa Fluor 488 козьим анти-крысиным IgG (разведение 1:200) и Alexa Fluor 647 козьим анти-кроликом IgG (разведение 1:200) в течение 7 дней при 4 °C.
  5. Через 7 дней удалите весь раствор, содержащий вторичные антитела, с помощью пипетки. Затем промыть сердце с помощью промывочного раствора (табл. 1) 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
  6. Для окрашивания ядер инкубируют сердце в растворе DAPI (10 мкг/мл) в течение ночи при 4 °C.
  7. На следующий день промыть сердце моющим раствором 3 раза (каждый раз в течение 1 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для блокирования, пермеабилизации, инкубации антител и окрашивания DAPI на этапах 3.1, 3.2, 3.4 и 3.6 оставьте образцы в установившемся состоянии при температуре 4°C, перемешивание не требуется. Окрашенная ткань может быть сохранена полностью покрыта моющим раствором при 4 °C и защищена от света в течение нескольких дней до визуализации в конфокальном микроскопе.

4. Конфокальная микроскопия

  1. Подготовьте кольца из оргстекла и заполните пластилином (рисунок 1). В центре пластилина образуется небольшая канавка для нагрузки на сердце. Сделайте неглубокую канавку, так как для этого было бы легче получить плоскую плоскость визуализации, а также отрегулировать пространство и избежать пузырьков воздуха между образцом и крышками на этапе 4.4.
  2. Используйте один и тот же образец сердца для визуализации как SAN, так и AVN последовательно. Для визуализации SAN непосредственно нагружайте сердце, тогда как для визуализации AVN выполняйте микродиссекцию раньше.
    1. Создание образов SAN
      1. Идентифицируют SAN по анатомическим ориентирам: он расположен на спинной стороне сердца в пределах межкавалесной области (область между верхней и нижней полой веной). Crista terminalis (CT) - это мышечная полоса между SAN и RAA.
      2. Поместите сердце в пластилиновую бороздку спинкой сердца вверх. Добавьте PBS на сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости, пока сердце не будет полностью покрыто PBS (обычно достаточно нескольких капель PBS).
      3. Под рассеченным микроскопом осторожно вдавите RAA, LAA и оставшиеся части левого желудочка в пластилин, чтобы зафиксировать сердце. Убедитесь, что вся межкваковая область и crista terminalis хорошо видны (не покрыты пластилином). Область, которая будет изображена, показана на рисунке 3A.
    2. AvN-визуализация
      1. После завершения визуализации SAN вспомните тот же образец и впоследствии используйте для визуализации AVN. Для микродиссекции AVN поместите сердце = на диссекционную чашку под рассеченным микроскопом.
      2. Ориентируйте сердце правой стороной вверх (включая оставшиеся части правого желудочка). Пропустите штифты через оставшуюся часть свободной стенки LV (которая теперь находится внизу), чтобы обездвижить ткань (рисунок 2B).
      3. Отрежьте оставшуюся свободную стенку RV вверх через трикуспидальный клапан и верхнюю полую вену. Затем отбросьте RV и RA, чтобы обнажить межжелудочковую и межатриальную перегородку. (Рисунок 3B)
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на то, чтобы не повредить коронарный синус (CS), так как это важный анатомический ориентир, чтобы найти треугольник Коха, который затем позволяет локализовать AVN. CS проходит поперечно в левой атриовентрикулярной бороздке на задней стороне сердца, а отверстие отверстия CS расположено между IVC и трехстворчатым клапаном в нижней части межпредсердной перегородки (рисунок 3A и B).
      4. Определите треугольник Коха, который можно найти на эндокардиальной поверхности правого предсердия, окаймленный спереди шарнирной линией перегородчатого листка трикуспидального клапана (ТВ), а сзади сухожилием Тодаро. Основание образовано отверстием коронарного синуса (рисунок 3В). Поскольку это целевая область для визуализации AVN, она должна быть четко видна.
      5. Переместите сердце в пластилиновую канавку внутри плексигласового кольца с треугольником Коха, четко обнаженным (т.е. не покрытым пластилином). Осторожно вдавите ткань вокруг треугольника Коха в пластилин, чтобы зафиксировать образец. Добавьте PBS на сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости, пока сердце не будет полностью покрыто PBS (обычно достаточно нескольких капель PBS).
  3. Нанесите силикон на края колец из оргстекла, чтобы можно было покрыть сердца, загруженные в заполненные пластилином кольца из плексигласа, крышками.
  4. Осторожно надавите на заднюю сторону пластилина, чтобы выдавить части PBS и прикрепить сердце к крышке, избегая при этом пузырьков воздуха в области визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интересующие области не сложены и закрыты во время нажатия на заднюю сторону пластилина. Плоская плоскость визуализации без избыточного сжатия образца необходима для сохранения анатомии и для правильной конфокальной визуализации образцов. Для SAN важно убедиться, что межкавалическая область четко открыта. Для AVN треугольник Коха должен быть полностью открыт.
  5. Поместите образцы окрашивания всего крепления вверх ногами на платформу конфокального микроскопа. Открытый SAN/AVN, прикрепленный к крышке, теперь находится на нижней части платформы микроскопа (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения снимков мы используем Carl Zeiss LSM800 с airyscan Unit и программным обеспечением ZEN 2.3 SP1 черного цвета.
  6. Выбирайте пластину "BP420-480 + LP605" для возбуждения Alexa Fluor 647 конъюгированного анти-HCN4. Варьируйте коэффициент усиления мастера от 650-750.
  7. Сделайте обзорное изображение всей области SAN и AVN с помощью функции сканирования плитки . Затем выберите HCN4-положительную область, щелкнув и добавив квадрат на обзорное изображение вокруг интересующей области, которая будет сканироваться.
  8. Проверьте параметры, включая пластины и коэффициент усиления для остальных каналов (Alexa Fluor 488 и DAPI) конфокального микроскопа и установите, как описано в шаге 4.6.
  9. Медленно настройте фокус сверху вниз образца, чтобы просмотреть весь образец и установить Первый и Последний для диапазона Z-стека. Установите оптимальный интервал для Z-стека на основе толщины оптического образца. Мы используем объектив 20x и 0,8-1 мкм в качестве интервала для Z-стека.
  10. После того, как все параметры правильно установлены, просканируйте всю область SAN и AVN.
  11. Выполняйте 3D-реконструкцию изображений с помощью программного обеспечения (например, Imaris версии 8.4.2).
    1. Выберите обработку изображений | Базовое вычитание для удаления фонового окрашивания.
    2. Выберите создание поверхности в настройках для выбранного канала и области, представляющей интерес для обработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя протокол, описанный выше, можно надежно выполнить конфокальную микроскопическую визуализацию как SAN, так и AVN. Специфическое окрашивание проводящей системы с использованием флуоресцентных антител, нацеленных на HCN4, и окрашивание рабочего миокарда с использованием флуоресцентных антител, нацеленных на Cx43, позволяет четко идентифицировать SAN (Рисунок 5, Видео 1) и AVN (Рисунок 6, Видео 2

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анатомия сердца традиционно изучается с использованием тонких гистологических срезов11. Однако эти методы не сохраняют трехмерную структуру проводящей системы и, таким образом, предоставляют только 2D-информацию. Описанный здесь протокол иммунофлуоресцентного окрашивания позволяет преодолеть эти ограничения и может регулярно использоваться для визуализации SAN и AVN.

По сравнению со стандартными методами, такими как традиционная иммуногистохимия, которые требуют встраив...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Китайским стипендиальным советом (CSC, R. Xia), Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X2600255 для S. Clauss, 81Z0600206 для S. Kääb), Фондом Короны (S199/10079/2019 для S. Clauss), SFB 914 (проект Z01 для H. Ishikawa-Ankerhold и S. Massberg и проект A10 для C. Schulz), ERA-NET по сердечно-сосудистым заболеваниям (ERA-CVD; 01KL1910 для S. Clauss) и Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (для S. Clauss). Спонсоры не играли никакой роли в подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильная>Анестезия
Изофлурановая система испарителя Hugo Sachs Elektronik34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910Включает в себя индукционную камеру, блок вакуумирования газа и угольные фильтры
Модифицированная схема BainHugo Sachs Elektronik73-4860Включает маску для анестезии для мышей
Хирургическая платформаKent ScientificSURGI-M
In vivo инструменты
Тонкие щипцыFine Science Tools11295-51
Ножницы для радужной оболочкиглаза Fine Science Tools14084-08
Пружинные ножницыFine Science Tools91500-09
Тканевые щипцыFine Science Tools11051-10
Тканевые булавки FineScience Tools26007-01Можно использовать иглы 27G в качестве замены
General lab instruments
Orbital ShakerSunlabD-8040
Магнитная мешалкаIKA Правая базовая
пипетка, объем 10 и микро; L, 100 & микро; L, 1000 & микро; LМикроскопы
VWR10836-004
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопZeissLSM 800
Software
Imaris 8.4.2Oxford instruments
ZEN 2.3 SP1 черныйZeiss
General Lab Материал
0,2 & микро; м шприц фильтрSartorius17597
100 мм чашкаПетри Falcon351029
27G иглаBD Microlance 3300635
50 мл полипропиленовая коническая трубка Falcon352070
5мл шприцBraun4606108V
Крышка скользитThermo Scientific7632160
Пробирки EppendorfEppendorf30121872
Chemicals
0,5 м ЭДТАSigma20-158Компоненты ТЭА
16% раствор формальдегидаThermo Scientific 28908использовать в качестве 4% раствора 
Уксусная кислотаMerck100063компоненты TEA
AgaroseBiozym850070
Бычья сыворотка АльбуминSigmaA2153-100G
DPBS (1X) Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический растворGibco14190-094
Нормальная козья сывороткаSigmaNS02L
СахарозаSigmaS1888-1kg
Трис-базаРошТРИС-РОКомпоненты TEA
Triton X-100SigmaT8787-250млразведенные до 1% в PBS
Tween 20SigmaP2287-500мл
<сильно>Наркотики
Фентанил 0,5  мг/10  mLBraun Melsungen
Isoflurane 1 мл/млCp-pharma31303
Oxygen 5 лLinde2020175Включает регулятор давления
Антитела
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor  488 Технология клеточной сигнализации#4412разбавленная до 1:200
козья антикрысиная IgG Alexa Fluor 647Invitrogen#A-21247разбавленная до 1:200
Hoechst 33342, тригидрохлорид, тригидрат (DAPI)InvitrogenH3570разбавленная до 1:1000
Rabbit Anti-Connexin-43SigmaC6219разбавленная до 1:200
Крысиная анти-HCN4 (SHG 1E5)InvitrogenMA3-903разбавленное до 1:200
<>ПрочноеДругое
плексигласаСамостоятельно разработанное и напечатанное на 3D-принтере
пластилиномCernit49655005
Silikonpasten, BaysiloneVWR291-1220<
strong>Animals
Mouse, C57BL/6Лаборатория Джексона
Eppendorf Z683884-1EA Диссекционный стереозум-микроскоп Кольцо из

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664(2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

Теги

3DHCN443

Похожие статьи