Методическая статья

Органоидный эпителиальный монослой: клинически значимая модель in vitro для кишечной барьерной функции

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/62074

⸱

29 июля 2021 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Foundation Hubrecht Organoid Technology (HUB)

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем подготовку органоидных монослоев кишечного эпителия человека для изучения кишечной барьерной функции, проницаемости и транспорта. Поскольку органоиды представляют собой оригинальный ответ эпителиальной ткани на внешние раздражители, эти модели сочетают в себе преимущества расширяемости клеточных линий и актуальность и сложность первичной ткани.

Аннотация

В прошлом модельные системы эпителия кишечника были ограничены трансформированными клеточными линиями и первичной тканью. Эти модельные системы имеют присущие им ограничения, поскольку первые не точно представляют первоначальную физиологию тканей, а доступность последних ограничена. Следовательно, их применение препятствует фундаментальным исследованиям и исследованиям в области разработки лекарств. Органоиды на основе взрослых стволовых клеток (отныне называемые органоидами) представляют собой миниатюры нормальной или больной эпителиальной ткани, из которой они получены. Они могут быть установлены очень эффективно из различных областей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), имеют долгосрочную расширяемость и имитируют специфические для тканей и пациента реакции на лечение in vitro. Здесь было продемонстрировано создание эпителиальных монослоев кишечного органоидного происхождения наряду с методами измерения целостности эпителиального барьера, проницаемости и транспорта, секреции антимикробного белка, а также гистологии. Кроме того, монослои кишечного органоидного происхождения могут быть обогащены пролиферирующими стволовыми и транзит-амплифицирующими клетками, а также ключевыми дифференцированными эпителиальными клетками. Поэтому они представляют собой модельную систему, которая может быть адаптирована для изучения воздействия соединений на клетки-мишени и способ их действия. Хотя органоидные культуры технически более требовательны, чем клеточные линии, после их создания они могут уменьшить сбои на более поздних стадиях разработки лекарств, поскольку они действительно представляют сложность эпителия in vivo и межпациентную гетерогенность.

Введение

Эпителий кишечника действует как физический барьер между просветным содержимым кишечника и подлежащей тканью. Этот барьер содержит единый эпителиальный слой преимущественно абсорбирующих энтероцитов, которые соединены плотными соединениями, которые устанавливают прочные межклеточные связи между соседними клетками. Эти клетки образуют поляризованную эпителиальную оболочку, которая разделяет апикальную (просветную) и базолатеральную стороны кишечника, одновременно регулируя параклеточный транспорт переваренных питательных веществ и метаболитов. В дополнение к энтероцитам, другие важные эпителиальные клетки, такие как бокал, панет и энтероэндокринные клетки, также способствуют кишечному гомеостазу, производя слизь, антимикробные пептиды и гормоны соответственно. Кишечный эпителий постоянно пополняется путем деления богатых лейцином повторно содержащих G-белок 5-положительных рецепторных (LGR5+) стволовых клеток в нижней части кишечных крипт, продуцирующих транзитно-амплифицирующие (ТА) клетки, которые мигрируют вверх и дифференцируются в другие типы клеток1. Нарушение гомеостаза кишечного эпителия генетическими и экологическими факторами, такими как воздействие пищевых аллергенов, лекарственных соединений и микробных патогенов, приводит к нарушению барьерной функции кишечника. Эти состояния вызывают несколько кишечных заболеваний, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), целиакию и лекарственную токсичность ЖКТ2.

Исследования кишечного эпителия проводятся с использованием нескольких платформенных систем in vitro, таких как мембранные вставки, системы органов на чипе, камеры Ussing и кишечные кольца. Эти платформы подходят для создания поляризованных эпителиальных монослоев с доступом как к апикальной, так и к базолатеральной сторонам мембраны, используя в качестве моделей трансформированные клеточные линии или первичную ткань. Хотя трансформированные клеточные линии, такие как клеточные линии колоректальной (адено)карциномы Caco-2, T84 и HT-29, способны в некоторой степени дифференцироваться в поляризованные энтероциты кишечника или клетки, продуцирующие слизь, они не являются репрезентативными для эпителия in vivo, поскольку отсутствуют несколько типов клеток, а различные рецепторы и транспортеры аберрантно экспрессируются3 . Кроме того, поскольку клеточные линии получены от одного донора, они не представляют межпациентной гетерогенности и страдают от снижения сложности и физиологической значимости. Хотя первичные ткани, используемые в камерах Ussing и в качестве кишечных колец, более репрезентативны для ситуации in vivo, их ограниченная доступность, краткосрочная жизнеспособность и отсутствие расширяемости делают их непригодными в качестве среды для исследований с высокой пропускной способностью (HT).

Органоиды представляют собой эпителиальные культуры in vitro, созданные из разных органов, таких как кишечник, почки, печень, поджелудочная железа и легкие. Доказано, что они обладают долгосрочной, стабильной расширяемостью, а также генетической и фенотипической стабильностью и поэтому являются репрезентативными биологическими миниатюрами эпителия исходного органа с верными реакциями на внешние раздражители 4,5,6,7,8,9. Органоиды эффективно устанавливаются из резецированной или биопсированной нормальной, больной, воспаленной или раковой ткани, представляя собой гетерогенные специфические для пациента ответы 10,11,12,13,14,15,16. В данной работе показано, как установить монослои эпителия кишечника, полученные из органоидных культур. Монослои были успешно установлены из тонкокишечных, а также кишечных и ректальных органоидных культур. Данная модель создает возможность для изучения транспорта и проницаемости эпителиальных клеток к лекарственным средствам, а также их токсикологического воздействия на эпителий. Более того, модель позволяет совместно культивировать с иммунными клетками и бактериями изучать их взаимодействие с эпителием кишечника 17,18,19. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения реакций на терапию в зависимости от пациента и инициирования скрининговых усилий для поиска следующей волны эпителиальных барьерно-ориентированных терапевтических средств. Такой подход может быть распространен на клинику и проложить путь к персонализированному лечению.

Хотя эпителиальные монослои в этом протоколе получены из нормальных органоидов кишечника человека, протокол может быть применен и оптимизирован для других органоидных моделей. Эпителиальные органоидные монослои культивируют в кишечной органоидной экспансионистской среде, содержащей Wnt для поддержки пролиферации стволовых клеток и представляющей клеточный состав кишечного крипта. Кишечные органоиды могут быть обогащены, чтобы иметь различные кишечные эпителиальные судьбы, такие как энтероциты, панет, кубок и энтероэндокринные клетки, путем модуляции путей Wnt, Notch и эпидермального фактора роста (EGF). Здесь, после установления монослоев в расширительной среде, они движутся в сторону более дифференцированных эпителиальных клеток кишечника, как описано ранее 20,21,22,23,24,25. Для целей скрининга, в зависимости от способа действия интересующего соединения, его клеток-мишеней и экспериментальных условий, монослои могут быть направлены к клеточному составу выбора для измерения эффектов соединения с соответствующими функциональными показаниями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка реагентов к культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги внутри шкафа биобезопасности и следуйте стандартным рекомендациям по работе с клеточными культурами. Ультрафиолетовый свет используется в течение 10 минут перед запуском шкафа биобезопасности. До и после использования поверхность шкафа биобезопасности очищается папиросной бумагой, пропитанной 70% этанолом. Чтобы облегчить образование трехмерных капель внеклеточного матрикса (ECM), держите предварительно расплавленный запас 96-, 24- и 6-луночных пластин наготове в инкубаторе при 37 °C.

  1. Подготовка базальной среды
    1. Приготовьте базальную среду (BM) в 500 мл модифицированной орлиной среды Advanced Dulbecco со средней бутылкой Ham's Nutrient Mix F-12 (Ad-DF), добавив 5 мл 200 мМ глутамина, 5 мл 1 М 4-(2-гидроксиэтил)-1пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) и 5 мл растворов пенициллина/стрептомицина (ручка/стрептококк) (10 000 Ед/мл или 10 000 мкг/мл). Его можно хранить в холодильнике при температуре 4 °C не менее 4 недель.
  2. Источники Wnt
    1. Готовят Wnt3a-кондиционированную среду (Wnt3aCM) согласно ранее описанномуспособу 26.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Недавно был сгенерирован суррогатный Wnt следующего поколения (NGS-Wnt), который также поддерживает расширение органоидов кишечника человека,27.
  3. Препарат кишечной органоидной основы среды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте все факторы роста и реагенты в соответствии с рекомендациями производителя. Используйте небольшие аликвоты и избегайте циклов замораживания-оттаивания; функциональные факторы роста необходимы для успешной органоидной культуры.
    1. Готовят концентрированную 2x кишечную органоидную базовую среду (2x IBM), добавляя BM с 1 мкМ A83-01, 2,5 мМ N-ацетилцистеина, 2x добавкой B27, 100 нг/мл эпидермального фактора роста человека (hEGF), 10 нМ гастрина, 200 нг/мл hNoggin и 100 мкг/мл антимикробного препарата для первичных клеток (см. Таблицу материалов).
    2. Aliquot 2x IBM и заморозить при -20 °C на срок до 4 месяцев. При необходимости разморозьте аликвоту на ночь при 4 °C или в течение нескольких часов при комнатной температуре (RT).
    3. Чтобы приготовить кишечную органоидную расширительную среду (IEM), добавьте 2x IBM либо 50% Wnt3aCM, либо 50% BM и 0,5 nM NGS-Wnt, 250 нг/мл человеческого Rspondin-3 (hRspo3), 10 мМ никотинамида и 10 мкМ SB202190.
  4. Подготовка среды дифференцировки органоидов кишечника
    1. Получают энтероцитарную дифференцирующую среду (eDM), добавляя 2x IBM с 50% BM, 250 нг/мл hRspo3 и 1,5 мкМ ингибитора пути Wnt (IWP-2). Хранить eDM при температуре 4 °C до 10 дней.
    2. Приготовьте комбинированную дифференцировочную среду (cDM), добавив 2x IBM либо 40% BM и 10% Wnt3aCM, либо 50% BM и 0,1 нМ NGS-Wnt, 250 нг/мл hRspo3, 10 мкМ DAPT и 100 нМ PD0325901. Хранить cDM при 4 °C в течение 10 дней.
  5. Манипуляции с внеклеточным матриксом (ECM)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте внеклеточный матрикс (ECM) (см. Таблицу материалов) в соответствии с рекомендацией производителя.
    1. Оттаивание ECM на ночь на льду; переложите ECM из бутылки в коническую трубку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл, обе предварительно охлажденные при -20 °C. Повторно замораживать аликвоты только один раз при -20 °C. После размораживания храните ECM в холодильнике при температуре 4 °C в течение 7 дней. Инкубировать не менее 30 мин на льду перед употреблением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильно смешайте ECM и убедитесь, что он холодный, прежде чем встраивать крипты или органоиды.

2. Органоидные культуры

  1. Создание культур из замороженных органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пусть БМ достигнет RT, и держите 12 мл аликвоты, нагретой до 37 °C, готовой к началу процедуры размораживания одного криовиала, содержащего замороженные органоиды.
    1. Быстро разморозьте органоидный криовиал, перемешивая на водяной бане с температурой 37 °C, пока не останется только кусочек льда. Немедленно добавьте 500 мкл теплого BM по каплям в криовиал и несколько раз пипетируйте вверх и вниз, чтобы разбавить морозильную среду и тщательно перемешать содержимое.
    2. Используя пипетку P1000, перенесите органоиды в коническую трубку объемом 15 мл и добавьте еще 1 мл теплого BM по каплям, осторожно перемешивая дно трубки. Пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы разбавить морозильную среду и тщательно перемешать содержимое.
    3. Добавьте до 12 мл теплого БМ по каплям в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую органоиды, и пипетируйте вверх и вниз стерильной пипеткой объемом 10 мл, чтобы мягко повторно суспендировать органоиды.
    4. Центрифугируют органоидную суспензию в течение 5 мин при 85 × г и 8 °C. Осторожно откажитесь от надосадочного вещества, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте органоиды в 30% v/v IEM, дополненного 10 мкМ Y27632 или другим rho-ассоциированным спирально-образующим ингибитором серин/треонинкиназы (ингибитор ROCK). Поместите трубку на лед.
    5. Добавьте 70% v/v ECM в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую органоиды. Смешайте органоидную суспензию, держа коническую трубку объемом 15 мл на льду, и посейте 5 мкл суспензии, чтобы проверить плотность (рисунок 1А). Продолжайте нанесение покрытий, если плотность соответствующая; если плотность слишком высока, добавьте больше раствора IEM/ECM в том же соотношении 30-70% v/v, соответственно.
    6. В каждую лунку предварительно выровненной 24-луночной пластины засевают 50 мкл органоидной суспензии путем пипетирования 5 отдельных капель по 10 мкл (рисунок 1В). Переверните тарелку вверх дном и оставьте в шкафу биобезопасности на 5 минут. Переложите пластину вверх ногами в инкубатор с температурой 37 °C и оставьте еще на 30 минут.
    7. Добавьте 500 мкл IEM с ингибитором ROCK 10 мкМ в каждую лунку и перенесите пластину в инкубатор. Регулярно снимайте одну каплю, чтобы контролировать рост, и обновляйте IEM каждые 2-3 дня, аспирируя старую среду и добавляя 500 мкл свежего IEM.
    8. Прохождение органоидов после того, как они должным образом восстановились после оттаивания и достигли нужного размера для обработки (рисунок 1С), как описано в разделе 2.2.
  2. Пассаж кишечных органоидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Охладите ECM на льду не менее 30 минут и держите IEM на RT не менее 1 ч перед использованием.
    1. Используйте среду из одной культуральной скважины для разрушения органоидных куполов с помощью фильтрующего наконечника с низким удержанием 1250 мкл и перенесите содержимое скважины в меченую коническую трубку объемом 15 мл. Промойте лунку 1 мл БМ и переложите ее в ту же коническую трубку объемом 15 мл.
    2. Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 со всеми остальными скважинами (максимум половину пластины или 600 мкл капель ECM можно промыть и добавить в одну коническую трубку объемом 15 мл).
    3. Добавьте BM, чтобы заполнить трубку до 12 мл, и пипетку вверх и вниз 10 раз с помощью пипетки 10 мл. Центрифуга при 85 × г в течение 5 мин при 8 °C.
    4. Перед удалением БМ проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, все ли органоиды гранулированы на дне конической трубки объемом 15 мл (рисунок 1D). Если ECM не накладывается на органоидную гранулу или слой ECM либо чистый, либо содержит только мусор, одиночные клетки или очень мало органоидов по сравнению с гранулированными органоидами, аспирировать супернатант и пипетировать ECM, накладывая органоидную гранулу очень осторожно, используя пипетку P200.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут попасть в ловушку в ECM и не оседать в виде компактной гранулы из-за низкой силы центрифугирования. Если ECM содержит органоиды, центрифугируют трубку снова при 450 × г в течение 5 мин при 8 °C и осторожно удаляют супернатант, как описано в 2.2.4. При наличии нескольких конических трубок объемом 15 мл их можно объединить после шага 2.2.4.
    5. Добавьте 1 мл БМ к каждой грануле (объемом 50-200 мкл, в зависимости от культуры органоидов и плотности) и осторожно повторно суспендируйте. Пипетируйте органоиды вверх и вниз по крайней мере в 5 раз, чтобы срезать их, избегая образования пены. Проверьте под микроскопом, чтобы увидеть, не нарушены ли органоиды (рисунок 2A). Если органоиды нарушены, перейдите к шагу 2.2.7; если органоиды не нарушены, пипетируйте их еще в 5 раз. На этот раз коснитесь стенки пластиковой трубки наконечником пипетки, чтобы приложить больше механической силы, чтобы нарушить работу органоидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Механическая сдвиг кистозных (рисунок 1С) и почковых (рисунок 1Е) органоидов возможна с помощью пластикового наконечника пипетки объемом 200 мкл или 10 мкл, установленного на фильтрующем наконечнике с низким удержанием 1250 мкл (рисунок 1F), в зависимости от объема, необходимого для разрушения органоидов. Использование суженной стеклянной пипетки (рисунок 1F) рекомендуется при переработке более 200 мкл ECM, содержащего органоиды (одна скважина из 6-луночной пластины или 4 скважины из 24-луночной пластины).
    6. Проверьте под микроскопом еще раз, чтобы увидеть, не нарушены ли органоиды. Если это нарушено, перейдите к следующему шагу; если нет, пипетируйте органоиды до 20x, регулярно проверяя органоиды под микроскопом. Если органоиды все еще не нарушены, добавьте 25% v/v реагент диссоциации клеток 1 (см. Таблицу материалов) к суспензии, инкубируйте на водяной бане при 37 °C в течение 2 мин и пипетируйте органоиды до 20x, регулярно проверяя органоиды под микроскопом, чтобы убедиться, что они не перевариваются в отдельные клетки.
    7. Добавьте до 12 мл БМ в коническую трубку объемом 15 мл и промыте органоидную гранулу путем пипетки вверх и вниз. Центрифуга при 85 × г в течение 5 мин при 8 °C. Откажитесь от супернатанта и отрегулируйте конечную концентрацию до 70% v/v ECM, добавив IEM и ECM к органоидной грануле.
    8. Начните повторное использование органоидной гранулы с удвоенным объемом IEM/ ECM, собранным для пассирования, и посейте 5 мкл суспензии, чтобы проверить плотность. Продолжайте покрытие, если плотность соответствующая (рисунок 2B); добавить больше раствора IEM/ECM, если плотность слишком высока. Добавьте 200 мкл суспензии в каждую лунку предварительно выровненной 6-луночной пластины, сделав отдельные капли объемом 10 мкл.
    9. Переверните тарелку вверх дном и оставьте в шкафу биобезопасности на 5 минут. Переложите пластину вверх ногами в инкубатор с температурой 37 °C, оставив ее еще на 30 минут. Добавьте 2 мл IEM с ингибитором ROCK 10 мкМ в каждую лунку и перенесите пластину в инкубатор.
    10. Регулярно снимайте одну каплю, чтобы контролировать рост, и обновляйте IEM каждые 2-3 дня, аспирируя старую среду и добавляя 2 мл свежего IEM.
  3. Пассаж кишечных органоидов для получения эпителиального монослоя
    1. Проход органоидов за 3 дня до забора для однослойной подготовки путем соблюдения того же протокола прохождения, описанного в разделе 2.2, за одним исключением. На этапе 2.2.7 повторно суспендируют органоиды в 1-1,5 раза больше начального объема IEM/ECM, чтобы они имели более высокую плотность и потенциал расширения при их сборе для однослойного приготовления (рисунок 3A).

3. Эпителиальный монослойный препарат

  1. Культивирование эпителиальных монослоев как на 24-луночных, так и на 96-луночных мембранных вставках с различными доступными типами пластин (табл. 1). Используйте мембранные вставки с высокопроизводительной системой (HTS) для обоих размеров, поскольку они содержат встроенный лоток с мембранными вставками и приемную пластину. Для 24-луночного формата также возможно использование пластин с отдельными съемными мембранными вставками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны различные типы мембран (полиэтилентерефталат (ПЭТ) или поликарбонат) и размеры пор (0,4-8,0 мкм), которые могут использоваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Монослои могут быть изображены brightfield только при использовании вставок с ПЭТ-мембранами. Светонепроницаемые мембраны блокируют утечку флуоресцентного света из апикального в базолатеральный отсек и могут быть рассмотрены при изучении динамического переноса или проницаемости флуоресцентно меченых подложек. Текущий протокол использует 24-луночные мембранные вставки; адаптации для мембранных вставок из 96 скважин описаны в разделе 5. В зависимости от плотности, морфологии и размера органоидов (рисунок 3А) для посева полной 24-луночной пластины мембранных вставок достаточно 6-луночной пластины (как посеяно в разделе 2.3).
  2. Покрытие мембранных вставок ECM
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть сомнения в наличии достаточного количества клеток, покройте вставки после подсчета клеток. Это делается для предотвращения ненужного покрытия и потери дорогостоящих мембранных вставок.
    1. Поместите мембранные вставки в опорную пластину в шкафу биобезопасности. Разбавьте ECM 40x в ледяном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS) с Ca2+ и Mg2+ и пипетируйте 150 мкл разбавленного ECM в апикальный отсек каждой вставки. Инкубировать пластину при 37 °C в течение не менее 1 ч.
  3. Подготовка клеток к посеву
    1. Предваренные аликвоты клеточного диссоциации реагента 2 на водяной бане (37 °C). Подготовьте 2 мл реагента для каждой лунки 6-луночной пластины.
    2. Перенесите культуральную пластину, содержащую органоиды (подготовленную в разделе 2.3), из инкубатора в шкаф биобезопасности. Обработать органоиды, как описано на этапах 2.2.1.-2.2.4. Не объединяйте несколько трубок в одну.
    3. Заполните трубку, содержащую органоиды, максимум из 3 лунок 6-луночной пластины, до 12 мл DPBS (без Ca2+ и Mg2+), и пипетку вверх и вниз 10x с помощью пипетки 10 мл. Центрифугу при 85 × г в течение 5 мин при 8 °С и аспирируют супернатант, не нарушая органоидную гранулу.
    4. Добавьте 2 мл предварительного реагента диссоциации клеток 2 на лунку 6-луночной пластины, используемой в качестве исходного материала, и повторно суспендируйте. Инкубируют трубки по диагонали или горизонтально в течение 5 мин на водяной бане при 37 °C, чтобы предотвратить погружение органоидов на дно трубки.
    5. Пипетка вверх и вниз 10x с использованием 5 мл стерильной пластиковой пипетки или пипетки P1000, в зависимости от общего объема реагента диссоциации клеток. Проверьте органоидную суспензию под микроскопом, чтобы увидеть, образовалась ли смесь одиночных клеток и некоторых клеточных сгустков, состоящих из 2-4 клеток (рисунок 3B). При необходимости продолжайте пищеварение, повторяя шаги 3.3.4-3.3.5 (не увеличивайте объем реагента диссоциации клеток) до тех пор, пока смесь не будет выглядеть аналогично рисунку 3B.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте переваривания органоидов полностью в отдельные клетки. Необходимо иметь несколько небольших групп клеток (т.е. группы по 2-4 клетки).
    6. Остановить диссоциацию клеток путем добавления до 12 мл БМ, включая ингибитор ROCK 10 мкМ , в клеточную суспензию. Центрифугу при 450 × г в течение 5 мин при 8 °C и аспирируют супернатант, не нарушая клеточную гранулу. При обработке одной и той же органоидной культуры в нескольких конических трубках по 15 мл объединяют гранулы клеток и повторно суспендируют их в 12 мл БМ.
    7. Отфильтруйте клеточную суспензию через ситечко 40 мкм, предварительно смазанное BM, и соберите проточную трубу в коническую трубку объемом 50 мл. Промыть сетчатый фильтр 10 мл БМ и собрать проточную трубу в ту же коническую трубку объемом 50 мл.
    8. Перенесите суспензию процеженной клетки в две новые конические трубки объемом 15 мл. Центрифуга при 450 × г в течение 5 мин при 8 °C и аспирация супернатанта, не нарушая клеточную гранулу. Повторное суспендирование клеток в 4 мл IEM, дополненных ингибитором ROCK 10 мкМ на полную культуральную пластину, используемую в качестве исходного материала.
    9. Смешайте небольшое количество клеточной суспензии в соотношении 1:1 с трипан-синим для подсчета. Подсчитайте живые, а не синие ячейки (рисунок 3C) и рассчитайте общее количество живых клеток. В небольших скоплениях подсчитайте каждую отдельную клетку.
    10. Готовят клеточную суспензию, содержащую 3 × 106 живых клеток на мл IEM, дополненную ингибитором ROCK 10 мкМ.
  4. Посевные ячейки на полиэфирных мембранных вставках
    1. Тщательно аспирируйте DPBS из вкладышей с покрытием ECM (этап 3.2.1), сохраняя пластину горизонтально. Пипет 800 мкл IEM, дополненный ингибитором ROCK, в каждый базолатеральный компартмент. Пипетка 150 мкл клеточной суспензии, приготовленной на стадии 3.3.10, на мембрану с покрытием ECM в апикальном отсеке по каплям. На каждую пластину обязательно приходится хотя бы один «пустой» колодец только с БМ.
    2. После того, как клетки оседают на мембране, измерьте трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER), как описано в разделе 4.1, и визуализируйте мембранные вставки с помощью микроскопа. Поместите пластину в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Измеряйте TEER каждый день и регулярно получайте изображения для мониторинга образования монослоя (рисунок 4A-D).
  5. Освежающие монослои
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обновляйте среду каждые 2-3 дня, придерживаясь следующего порядка, чтобы поддерживать положительное гидростатическое давление над клетками и предотвращать выталкивание клеток из мембраны. Освежая среду, убедитесь, что монослой, который виден при аспирации среды, не поврежден кончиком пипетки.
    1. Удалите среду из базолатеральных отсеков пластины, содержащей мембранные вставки. Затем осторожно аспирировать среду из апикальных отсеков мембранных вставок.
    2. Добавьте 150 мкл свежего IEM по каплям в каждый апикальный отсек, а затем добавьте 800 мкл свежего IEM в каждый базолатеральный отсек.
  6. Обогащение монослоя для желаемых типов эпителиальных клеток кишечника
    1. Позвольте монослою влиться в IEM, что соответствует значению TEER около 100 Ω·см² (как рассчитано на этапе 4.1.1.4). Проверьте под микроскопом, чтобы определить, полностью ли образовались монослои (рисунок 4D) и на отсутствие отверстий (как показано на рисунке 4B, C).
    2. Осторожно удалите IEM из базолатерального и апикального отсеков мембранных вставок и замените их либо eDM, либо cDM, как подготовлено в разделе 1.4. Культивируйте монослой еще 3-4 дня в специфической среде дифференцировки, чтобы органоидные клетки обогащались желаемым конкретным типом клеток. Обновляйте среду каждые 2-3 дня, как описано в разделе 3.4.
    3. Ежедневно измеряйте TEER и при желании регулярно получайте изображения (рисунок 5A-C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение TEER, указывающее на полностью организованный обогащенный монослой, варьируется в зависимости от культуры органоидов; Обычно значения TEER увеличиваются до 600 и могут увеличиваться до 1000 Ω·см2 (как рассчитано на шаге 4.1.1.4) через 3 дня в дифференцировочных средах и стабильны в течение 3-5 дней.

4. Показания эпителиального монослоя

  1. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения TEER широко приняты в качестве метода анализа динамики плотных соединений и целостности барьерной функции в биологических моделях физиологических барьеров, таких как эпителиальные монослои28,29. Увеличение TEER после дифференциации из-за повышенного клеточного взаимодействия в плотных соединениях может быть измерено с помощью ручного измерителя TEER или автоматизированного измерительного робота TEER.
    1. Измерение TEER с помощью ручного измерителя TEER
      1. Очистите электрод 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности. Поместите электрод в трубку, содержащую BM. Подключите электрод к ручному измерителю TEER. Поверните переключатель Function для измерения в Омах (Ω). Включите выключатель питания .
      2. Поместите короткий электрод в апикальный отсек вставки, а длинный электрод расположен в базолатеральном отсеке (рисунок 6А). Избегайте прикосновения к монослою.
      3. Измерьте сопротивление в пустой скважине (Rblank), а затем измерьте оставшиеся образцы (R sample) таким же образом. Промывайте электрод с БМ между образцами с различными условиями. Очистите электрод сначала полуводой, а затем 70% этанолом и дайте ему высохнуть на воздухе.
      4. Расчет TEER (Ω·см2): [образец R (Ω) -R бланк (Ω)] × площадь мембраны (см2) (таблица 1 и рисунок 6B).
    2. Измерение TEER с помощью автоматизированного измерительного робота TEER (Таблица материалов)
      1. Выполнение автоматизированных измерений TEER при использовании систем HTS для плит HTS с 96 и 24 скважинами, содержащими мембранные вставки. Используйте различные электроды для измерения TEER для обоих типов (мембранные вставки 24- и 96-HTS). Чтобы измерить TEER с помощью автоматизированного измерительного робота TEER, следуйте инструкциям производителя.
  2. Измерение целостности и проницаемости эпителиального барьера
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол вводит люциферово-желтую проницаемость от апикального к базолатеральному компартменту в качестве показателя целостности монослоя. В этом разделе описывается измерение флуоресценции в базолатеральном компартменте после стадии инкубации 1 ч для оценки монослойной проницаемости и, следовательно, барьерной целостности. Это измерение является анализом конечной точки и особенно полезно при тестировании соединений на предмет их влияния на целостность барьера.
    1. Разморозьте Люцифера Желтого на льду, и пусть БМ уравновесится до RT. Для одной 24-луночной пластины мембранных вставок готовят 5 мл рабочего раствора 60 мкМ Люцифера Желтого в БМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Люцифер Желтый светочувствительный. Подготовьте разведения в темных стерильных пробирках объемом 1,5 мл и выполните все этапы с выключенным светом шкафа биобезопасности.
    2. Осторожно удалите среду из базолатерального и апикального отсеков мембранных вставок, как описано на этапе 3.5.1. При желании поцарапайте один необработанный монослой, используя наконечник пипетки в качестве положительного контроля утечки Люцифера Желтого через поврежденный барьер.
    3. Добавьте 150 мкл БМ с 60 мкМ Люцифера Желтого в каждый апикальный отсек и добавьте 800 мкл БМ без Люцифера Желтого в каждый базолатеральный отсек. Поместите пластину на шейкер при температуре 37 °C, 50 об/мин в течение 60 мин.
    4. Тем временем подготовьте стандартную кривую люциферного желтого цвета в БМ, начиная с рабочего раствора, приготовленного на этапе 4.2.1. Разбавляйте 1:3 на каждой стадии до тех пор, пока не будет достигнута концентрация 3 нМ. Включите отрицательный контроль (только БМ).
    5. Переложите 100 мкл каждого стандарта в трех экземплярах на 96-луночную прозрачную пластину. После 60 мин инкубации извлекают мембранные вставки и переносят 100 мкл из каждого базолатерального колодца (этап 4.2.3) в три раза в 96-луночную прозрачную пластину. Измерьте флуоресценцию пластины с помощью считывателя пластин при длине волны возбуждения 430 нм и длине волны излучения 530 нм.
    6. После корректировки отрицательного контрольного значения (только BM) используйте стандартные значения кривой для расчета концентрации Люцифера Желтого в базолатеральном отсеке (концентрация конечного приемника (мкМ)).
    7. Рассчитайте коэффициент кажущейся проницаемости (приложение P) по следующей формуле (рисунок 6C):
      figure-protocol-1
    8. Для 24-луночной пластины, содержащей мембранные вставки, используйте следующую формулу:
      figure-protocol-2
  3. Фиксация монослоев и подготовка парафиновых блоков к гистологии
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эпителиальные монослои могут быть использованы для гистологического окрашивания для оценки их клеточного состава, полярности и экспрессии различных белков, представляющих интерес, таких как соединительные белки, маркеры пролиферации или дифференцировки. В этом разделе описывается подготовка парафинового блока к гистологическому окрашиванию.
    1. Осторожно удалите среду из базолатерального и апикального отсеков мембранных вставок, как описано в шагах 3.5.1.
    2. Промывайте монослои, добавляя 150 мкл DPBS (без Ca2+ и Mg2+) в каждый апикальный отсек и 800 мкл в каждый базолатеральный отсек. Осторожно аспирируйте DPBS снова, сначала из базолатерального отсека, а затем из апикального отсека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Базолатеральный отсек будет оставаться пустым с этого шага.
    3. В вытяжной капюшон добавляют 150 мкл 4% параформальдегида в каждый апикальный отсек и инкубируют в течение 30 мин при РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, выполните все действия в этом разделе внутри вытяжного шкафа, так как параформальдегид токсичен.
    4. Осторожно аспирируйте фиксатор из апикальных отсеков мембранных вставок и утилизируйте его как жидкие галогенные отходы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого шага, утилизируйте все жидкие отходы как жидкие галогенные отходы.
    5. Вымойте монослои, добавив 200 мкл DPBS (без Ca2+ и Mg2+) в каждый апикальный отсек, и снова осторожно аспирируйте DPBS. Повторите этот шаг еще раз.
    6. Добавьте 200 мкл 25% этилового спирта (EtOH) в каждый апикальный отсек и инкубируйте в течение 15 мин при RT. Через 15 мин осторожно аспирировать 25% EtOH из апикальных отсеков мембранных вставок. Повторить с 50% раствором EtOH и впоследствии с 70% раствором EtOH.
    7. Добавьте 200 мкл 70% EtOH в каждый апикальный отсек и оберните пластину парапленкой. Храните при температуре 4 °C до дальнейшего использования.
    8. Осторожно аспирируйте 70% EtOH и используйте скальпель, чтобы аккуратно вырезать однослойные мембраны из вставок. Вырезать с базолатеральной стороны, по краю вставки.
    9. Подготовьте парафиновые блоки, следуя стандартной процедуре.
      1. Когда парафин еще теплый, возьмите монослой из парафина пинцетом и поместите его на предварительно охлажденную поверхность.
      2. Будьте осторожны, чтобы не повредить монослой. Разрежьте монослой пополам с помощью лезвия с одним краем.
      3. Когда парафин в нижней части кассеты начнет затвердевать, используйте нагретый пинцет, чтобы поместить две монослойные части в парафин, рядом друг с другом прямой стороной вниз и в вертикальном направлении, чтобы гарантировать, что монослой будет вертикальным в купе.
    10. Когда парафиновые блоки будут готовы, вырежьте блоки с помощью микротома и сделайте слайды из секций толщиной 4 мкм в соответствии со стандартной процедурой. Убедитесь, что монослои оказываются вертикальными в купе.
    11. Выполняют гистологические окрашивания, как описано ранее 7,9. Используйте гематоксилин и эозин (H & E), Ki67, муцин-2 (MUC2) и Alcian Blue, чтобы показать общую морфологию, пролиферативные клетки, производство слизи и бокаловидные клетки соответственно (рисунок 6E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут использоваться дополнительные маркеры дифференцировки, такие как лизоцим для клеток Paneth. Этот маркер не представлен на рисунке 6E , поскольку клетки Панета присутствуют в эпителии тонкого кишечника, а не в эпителии толстой кишки.
  4. Измерение секретируемого белка в среде супернатанта
    1. Измерьте уровни лизоцима в апикальном супернатанте подвздошных монослоев (см. Рисунок 6D) с помощью набора, указанного в Таблице материалов. При желании измерьте уровни различных цитокинов и других интересующих белков.
  5. Анализ экспрессии генов
    1. Количественная оценка влияния дифференцировочных сред на экспрессию генов эпителиальных клеточных маркеров с помощью количественной обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (qRT-PCR).
      1. Лизируйте монослои в 350 мкл буфера лизиса РНК с последующей изоляцией РНК в соответствии с инструкциями производителя. Выполняют синтез кДНК и qPCR, как описано ранее 7,9, используя наборы синтеза кДНК, мастер-микс и олигонуклеотиды, перечисленные в Таблице материалов.

5. Масштабирование до 96-луночных пластин, содержащих мембранные вставки

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте эпителиальные монослои для скрининга лекарств с более высокой пропускной способностью или множественных средовых условий с использованием пластин HTS 96-луночных отверстий, содержащих мембранные вставки.

  1. Адаптации при подготовке монослоев в 96-луночном формате
    1. Выполните все шаги, описанные в этом протоколе для 24-луночных пластин, содержащих мембранные вставки, изменив объемы и номера ячеек на те, которые описаны в таблице 1. Для приготовления монослоев на 96-луночных пластинах с мембранными вставками действуйте так, как описано в разделе 3 со следующими отличиями.
      1. Приблизительно 9 лунок 6-луночной культуральной пластины с плотностью органоидов, представленной на рисунке 3А , необходимы для засева полной 96-луночной пластины мембранными вставками. На этапе 3.2.1 предварительно покрывали мембраны 67 мкл 40x разбавленного ECM в DPBS (с Ca2+ и Mg2+).
      2. В разделе 3.5 сначала перенесите интегральную пластину мембранных вставок на другую 96-луночную пластину, чтобы обеспечить среднее освежение как апикального, так и базолатерального отсеков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1А показано репрезентативное яркое изображение органоидов кишечника после их размораживания от криовиала. Важно размораживать органоиды при высокой плотности, чтобы обеспечить оптимальное восстановление. Органоиды покрыты 24- или 6-луночными пластинами в куполах ECM приблизительно 10 мкл (рисунок 1B). Большинство нормальных кишечных органоидов имеют кистозную морфологию. После восстановления после процесса оттаивания органоиды вырастают до большего ра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает общие манипуляции и поддержание кишечных органоидов, а также приготовление и возможное применение эпителиальных монослоев, полученных из этих органоидов. На сегодняшний день монослои успешно получены из двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки и различных областей органоидов толстой кишки, полученных из нормальной, а также ранее и активно воспаленной кишечной ткани (неопубликованные данные). Применение органоидных монослоев, полученных от пациента, облегчает изучение барьерной функции в зависим...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа поддерживается topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) государственно-частное партнерство (PPP) голландского сектора LSH с номером проекта LSHM16021 Органоиды в качестве нового инструмента для токсикологического моделирования для Hubrecht Organoid Technology (HUB) и внутреннего финансирования HUB для отдела моделирования и токсикологии заболеваний. Мы благодарим лаборатории Сабины Миддендорп (отделение детской гастроэнтерологии, детская больница Вильгельмина, UMC, Утрехт) и Хуго Р. де Йонге и Марселя Й.К. Бийвельдса (отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Erasmus MC, Роттердам) за оказание первоначальной технической поддержки в установке монослоев на мембранных вставках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100% этанолFisher Emergo10644795
1250, 300 и 20; L низкоудерживающие фильтрующие наконечникиGreiner bio-one732-1432 / 732-1434 / 732-2383
15 мл конические пробиркиGreiner bio-one188271
24-луночные планшеты для клеточных культурGreiner bio-one662160
24-луночные HTS Fluoroblok Transwell планшеты (светонепроницаемые)Corning351156
24-луночные HTS Transwell планшеты (Таблица 1)Corning3378
24-луночный планшет со вставками TranswellCorning3470
40 &; m клеточный фильтрPluriSelect43-50040-01
50 мл конические пробиркиGreiner bio-one227261
6-луночные планшеты для клеточных культурGreiner bio-one657160
96-луночная черная пластина прозрачное дноGreiner bio-one655090
96-луночные быстрые термоциклические пластиныLife Technologies Europe BV4346907
96-луночная пластина HTS Fluoroblok Transwell Corning351162
96-луночная пластина HTS Transwell (Таблица 1)Corning7369
96-луночная прозрачная культуральная пластинаGreiner bio-one655180
A83-01Bio-Techne Ltd2939
Реагент для диссоциации клеток аккутазыLife Technologies Europe BVA11105-01Cell реагент диссоциации 2
Advanced DMEM/F-12Life Technologies Europe BV12634028
B27 дополнениеLife Technologies Europe BV17504001
Микроскоп для клеточных культур (световой/оптический микроскоп)Leica
CellTiter-GloPromegaG9683
ЦентрифугаEppendorf
CO2 инкубаторPHCBI
DAPT Sigma-AldrichD5942
DEPC обработанный H2OLife Technologies Europe BV750024
фосфатно-солевой буфер (DPBS) Dulbecco с Ca2+ и Mg2+LifeTechnologies Europe BV14040091
DPBS, порошок, без кальция, без магнияLife Technologies Europe BV21600069
EnzChek Lysozyme Assay KitLife Technologies Europe BVE22013
Измеритель EVOM2 с электродом STXWTI
GastrinBio-Techne Ltd3006
Стеклянные пипеткиVolac
GlutaMAXLife Technologies Европа BV35050038
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESLife Technologies Europe BV15630056
Human NogginPeprotech120-10C
Human Rspo3Bio-Techne Ltd3500-RS/CF
IWP-2Miltenyi Biotec130-105-335
Ki67 первичное антителоSanbioBSH-7302-100
Ki67 вторичное антителоAgilentK400111-2
Kova International Glasstic Slide with Counting GridFisher Emergo10298483
Ламинарный проточный колпакThermo scientific
Lucifer Yellow CH дилитиевая сольSigma-AldrichL0259
Matrigel, фактор роста снижен ( GFR)Corning356231внеклеточный матрикс (ECM)
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0,1 млLife Technologies Europe BV4358293
MicroAmp Оптические 8-контактные полоскиLife Technologies Europe BV4323032
Микроцентрифужные пробиркиEppendorf0030 120 086
Микропипетки (1000, 200 и 20 µ L)Gilson
MicrotomeLeica
MUC2 первичное антителоSanta Cruz Biotechnologysc-15334
MUC2 вторичное антителоVWRVWRKS/DPVR-HRP
Многоканальная пипетка (200 µ L)Gilson
N-ацетилцистеинSigma-AldrichA9165
NGS WntU-protein ExpressN001-0,5 мг
никотинамидSigma-AldrichN0636
олигонуклеотид ALPI1/ForwardCustom-madeGGAGTTATCCTGCTCCCCAC
Oligonucleotide ALPI1/ReverseCustom-madeCTAGGAGGTGAAGGTCCAACG
Олигонуклеотид LGR5/ForwardCustom-madeACACGTACCCACAGAAGCTC
LGR5/ReverseCustom-madeGGAATGCAGGCCCCACTGAAAC
Oligonucleotide MUC2/ForwardCustom-madeAGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG
MUC2/ReverseCustom-madeTAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT
Олигонуклеотид TBP/ForwardИзготовленный на заказACGCCGAATATAATCCCAAGCG
Олигонуклеотид TBP/ОбратныйИзготовленный на заказAAATCAGTGCCGTGGTGTTCGTG
Оптические адгезивные покрытияLife Technologies Europe BV4311971
PD0325901Stemcell Technologies72184
Пенициллин/стрептомицинLife Technologies Europe BV15140122
Шейкер для тарелокPanasonic
PowerUp SYBR Green MasterMix Fisher EmergoA25776
PrimocinInvivoGenANT-PM-2антимикробная формула для первичных клеток
Qubit RNA HS Assay KitLife Technologies Europe BVQ32852
Реагентный резервуар для многоканальной пипеткиSigma-AldrichCLS4870
REMS AutoSampler с 24-зондом или 96C-зондомWTI
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain KitThermo Scientific87023
RNase-Free DNase SetQiagen79254
RNeasy Mini KitQiagen74106
SB202190Sigma-AldrichS7076
Серологические пипеткиGreiner bio-one606180 / 607180 / 760180
Серологическая пипетка (Pipet-Aid)Drummond
Однолезвийное бритвенное лезвиеGEM Scientific
Superscript 1-я нить система для ОТ-ПЦРLife Technologies Europe BV11904018
Tecan Spark 10M планшетный ридерTecan
Раствор Трипан Блю, 0,4%Life Technologies Europe BV15250-061
Экспресс-фермент TrypLE (1x)Life Technologies Europe BV12605-010Реагент для диссоциации клеток 1
Водяная баняGrant
Y27632 (ингибитор ROCK)AbMoleM1817
Oligonucleotide Oligonucleotide

Ссылки

  1. Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
  2. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(2020).
  3. Martínez-Maqueda, D., Miralles, B., Recio, I., et al. HT29 Cell Line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 113-124 (2015).
  4. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  5. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5(+) liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 11 (2), 179-194 (2013).
  7. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 1-20 (2019).
  8. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  9. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  10. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  11. Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
  12. Van De Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  13. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  14. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  15. d'Aldebert, E., et al. Characterization of human colon organoids from inflammatory bowel disease patients. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 363(2020).
  16. Dotti, I., et al. Alterations in the epithelial stem cell compartment could contribute to permanent changes in the mucosa of patients with ulcerative colitis. Gut. 66 (12), 2069-2079 (2017).
  17. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  18. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  20. van Es, J. H., et al. Wnt signalling induces maturation of Paneth cells in intestinal crypts. Nature Cell Biology. 7 (4), 381-386 (2005).
  21. van Es, J. H., et al. Dll1 marks early secretory progenitors in gut crypts that can revert to stem cells upon tissue damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
  22. de Lau, W. B. M., Snel, B., Clevers, H. C. The R-spondin protein family. Genome Biology. 13 (3), 1-10 (2012).
  23. Basak, O., Beumer, J., Wiebrands, K., Seno, H., van Oudenaarden, A., Clevers, H. Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells. Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).
  24. Beumer, J., et al. Enteroendocrine cells switch hormone expression along the crypt-to-villus BMP signalling gradient. Nature Cell Biology. 20 (8), 909-916 (2018).
  25. Yin, X., Farin, H. F., van Es, J. H., Clevers, H., Langer, R., Karp, J. M. Niche-independent high-purity cultures of Lgr5+ intestinal stem cells and their progeny. Nature Methods. 11 (1), 106-112 (2014).
  26. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).
  27. Miao, Y., et al. Next-generation surrogate Wnts support organoid growth and deconvolute Frizzled pleiotropy in vivo. Cell Stem Cell. 27 (5), 840-851 (2020).
  28. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  29. Blume, L. -F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Die Pharmazie. 65 (1), 19-24 (2010).
  30. Lea, T. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., et al. , Springer. Cham (CH). 103-111 (2015).
  31. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  32. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Transwell

Похожие статьи