Представленный метод позволяет визуализировать флуоресцентно помеченные клеточные белки с расширением микроскопии, что приводит к разрешению 70 нм на обычном микроскопе.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изображение подоцитических белков Нефрин, Актин и Подоцин с помощью микроскопии расширения
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нарушение гломерулярного фильтра, состоящего из гломерулярного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и подоцитов, приводит к альбуминурии. Подоцитные процессы ног содержат актиновые пучки, которые связываются с белками цитоскелетного адаптера, такими как подоцин. Эти адаптерные белки, такие как подоцин, связывают основу диафрагмы гломерулярной щели, такой как нефрит, с актином цитоскелетом. Изучение локализации и функции этих и других подоцитных белков имеет важное значение для понимания роли гломерулярного фильтра в здоровье и болезнях. Представленный протокол позволяет пользователю визуализировать актин, подоцин и нефрит в клетках с визуализацией супер разрешения на обычном микроскопе. Во-первых, клетки окрашиваются с помощью обычной техники иммунофлуоресценции. Все белки в образце затем ковалентно закреплены на опухаемом гидрогеле. Через пищеварение с протеиназой K, структурные белки расщепляются позволяет изотропный отек геля в последний шаг. Диализ образца в воде приводит к 4-4,5-кратное расширение образца и образец может быть изображен с помощью обычного микроскопа флуоресценции, что делает потенциальное разрешение 70 нм.
Введение
Альбуминурия является суррогатным параметром сердечно-сосудистого риска и является результатом нарушения гломерулярного фильтра1. Гломерулярный фильтр состоит из фенестированного эндотелия, гломерулярной мембраны подвала и щелевой диафрагмы, образованной подоцитами. Первичные и вторичные процессы ног подоцитов обернуть вокруг капиллярной стенки гломерула2. Деликатная структура ног процессов поддерживается корковых актин расслоения, которые также служат в качестве якорей для нескольких белков щели диафрагмы и других белковадаптера 2. Белковый белок разреза диафрагмы называется нефритом и взаимодейс....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Разделение и посев клеток
- Разогреть стерильные Dulbecco в модифицированных Eagle's Medium (DMEM), в том числе 10% плода теленка сыворотки (FCS), стерильный фосфат буфера солевого раствора (PBS) и стерильных трипсина до 37 градусов по Цельсию. Активируйте чистую скамейку.
- Подготовка 6-хорошо пластины, добавив один стерильный стеклянный покров скольжения (10 мм) к каждому хорошо с помощью стерильных типсов.
- Положите 10 см клеточной культуры блюдо с Cos7 клетки под чистой скамейке. Под чистой скамейкой, аспирировать клетки среды с помощью вакуумного устройства.
- Держите angulated блюдо культуры клеток в одной руке и добавить 10 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Концепция и сроки этого протокола proExM изображены на рисунке 1. На 5-й день трансфектные клетки фиксируются и окрашиваются флуоресцентными антителами, нацеленными на белок интереса(рисунок 1A,B). На 6-й день лечение AcX приводит к образованию групп амина на всех белках (включая флюорофоры)(рисунок 1A,B)12. При полимеризации гидрогеля эти ами.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представленный метод позволяет исследователю визуализировать клеточные белки, например, подоцин, нефрит и цитоскелетные компоненты, например, F-актин. В рамках этого протокола, трансфицированные cos7 клетки используются в качестве модели для изучения взаимодействия щелевых белков диафрагмы с F-актином. К сожалению, увековеченные линии клеток подоцитов не выражают достаточного количества разрезанных белков диафрагмы19.
С помощью этого метода клеточные белки можно визуали.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторов нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Бланку Дувняка и Николу Кухра за отличную техническую помощь.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Акриламид >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)амино)гексановая кислота, сукцинимидиловый эфир, Акрилоил-X, SE | invitrogen | A-20770 | хранить до 4 месяцев |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckglä ser (чехлы для стекла) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | для резки покровных стекол |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Сток можно хранить в RT |
| Marten волосяная кисть | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckglä ser (чехлы для стаканов) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N'-метиленбисакриламид | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| objektträ ger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Акрилат натрия | Sigma-Aldrich | 408220 | проверить чистоту |
| Бикарбонат натрия | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Окрашивающая камера | изготовленная в университетской мастерской | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-луночные стеклянные донные пластины | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | хромтра | недоступен | 1:40 |
| Анти Подоцин произведен в кролике | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Ослик против морской свинки CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Козий против кролика 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Морской свинка против нефрина | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Программное обеспечение | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | недоступен |
Ссылки
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
