Method Article

Трех- и четырехмерные подходы визуализации и анализа для изучения осевого удлинения и сегментации позвоночных

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описаны вычислительные инструменты и методы, позволяющие визуализировать и анализировать трех- и четырехмерные данные изображения эмбрионов мышей в контексте осевого удлинения и сегментации, полученные методом оптической проекционной томографии, а также путем живой визуализации и полноразмерного иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием многофотонной микроскопии.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сомитогенез является отличительной чертой эмбрионального развития позвоночных. В течение многих лет исследователи изучали этот процесс в различных организмах, используя широкий спектр методов, охватывающих подходы ex vivo и in vitro. Тем не менее, большинство исследований по-прежнему полагаются на анализ данных двумерной (2D) визуализации, что ограничивает надлежащую оценку процесса развития, такого как осевое расширение и сомитогенез, включающий высокодинамические взаимодействия в сложном 3D-пространстве. Здесь мы описываем методы, которые позволяют мышам получать изображения в реальном времени, обрабатывать наборы данных, визуализировать и анализировать в 3D и 4D для изучения клеток (например, нейромезодермальных предшественников), участвующих в этих процессах развития. Мы также предоставляем пошаговый протокол для оптической проекционной томографии и полноразмерной иммунофлуоресцентной микроскопии у эмбрионов мышей (от подготовки образцов до получения изображений) и показываем конвейер, который мы разработали для обработки и визуализации данных 3D-изображений. Мы расширяем использование некоторых из этих методов и выделяем специфические особенности различного доступного программного обеспечения (например, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira и Imaris), которые могут быть использованы для улучшения нашего текущего понимания осевого расширения и формирования сомита (например, 3D-реконструкции). В целом, описанные здесь методы подчеркивают важность визуализации и анализа 3D-данных в биологии развития и могут помочь другим исследователям лучше рассматривать данные 3D и 4D изображений в контексте осевого расширения и сегментации позвоночных. Наконец, в работе также используются новые инструменты для облегчения обучения эмбриональному развитию позвоночных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Формирование оси тела позвоночных является очень сложным и динамичным процессом, происходящим во время эмбрионального развития. В конце гаструляции [у мыши, около эмбрионального дня (E) 8,0], группа клеток-предшественников эпибластов, известных как нейромезодермальные предшественники (NMP), становится ключевым фактором осевого расширения в последовательности голова-хвост, генерируя нервную трубку и параксиальные мезодермальные ткани во время формирования шеи, туловища и хвоста 1,2,3,4 . Интересно, что положение, которое эти НМП занимают в ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты с участием животных проводились в соответствии с португальским (Portaria 1005/92) и европейским (Директива 2010/63/EU) законодательствами, касающимися жилья, животноводства и социального обеспечения. Проект был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике "Instituto Gulbenkian de Ciência" и Португальским национальным образованием "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (ссылка на лицензию: 014308).

1. Пробоподготовка для 3D и 4D визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы приводим подробное описание того, как препарировать и готовить эмбрионы мыши от E8.25 до E10.5 для живой визуализации (1.1), эмбрионы E7.5 до....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные результаты, показанные в этой статье как для живой, так и для иммунофлуоресцентной визуализации, были получены с использованием двухфотонной системы с водным объективом 20 × 1,0 NA, лазером возбуждения, настроенным на 960 нм, и фотоприемниками GaAsP (как описано в Dias et al. (2020)43. Оптическая проекционная томография была выполнена с использованием специально построенного сканера OPenT (как описано в Gualda et al. (2013)28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Осевое удлинение и сегментация являются двумя наиболее сложными и динамичными процессами, происходящими во время эмбрионального развития позвоночных. Использование 3D- и 4D-визуализации с одноклеточным отслеживанием применялось в течение некоторого времени для изучения этих процессов как у рыбок данио, так и у куриных эмбрионов, для которых доступность и условия культивирования облегчают сложную визуализацию 19,44,45,46,47,48,49

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Оливье Пуркие и Александра Аулехлу за штамм репортера LuVeLu, лабораторию SunJin за тестовый образец RapiClear, Уго Перейру за помощь с использованием BigStitcher, Нуну Гранжейру за помощь в настройке аппарата визуализации в реальном времени, объект для животных IGC и бывших и нынешних членов лаборатории Mallo за полезные комментарии и поддержку в ходе этой работы.

Мы благодарим за техническую поддержку Центра расширенной визуализации МКГР, который поддерживается португальским финансированием ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 и ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, совместно финансируемым Региональной оперативной програ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Агароза с низкой температурой гелеобразованияSigmaA9414Используется для монтирования эмбрионов (например, для ОПТ)
Программное обеспечение AmiraThermofisher-Commerialпрограммное средство
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)R and D SystemsAF2085 RRID:AB_2200235Для иммунофлуоресценции
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)Abcamab92494 RRID:AB_10585428Для иммунофлуоресценция
Anti-Tbx6 (Козья поликлональная)R и D SystemsAF4744 RRID:AB_2200834Для иммунофлуоресценции
Anti-Laminin111 (Кролик поликлональный)SigmaL9393 RRID:AB_477163Для иммунофлуоресценции
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)Молекулярные зондыA11055 RRID:AB_2534102Для иммунофлуоресценции
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)ТермоФишер   ScientificA10042 RRID:AB_2534017Для иммунофлюоресценции
Бензиловый спирт (99+%)(любой) -Используется для очистки эмбрионов (компонент BABB)
Бензилбензоат (99+%)(любой)-Используется для очистки эмбрионов (компонент BABB)
Бычий сывороточный альбуминBiowestP6154Для иммунофлюоресценции
Покровное стекло 20x20 мм #0 (любой)-
Покровное стекло толщиной 100 мкм 20x20 мм #1(любое)-толщиной 170 мкм
20x60 мм #1,5(любое)-Для использования в качестве " слайды»
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride)Life TechnologiesD3571Для иммунофлуоресценции
Программное обеспечение Drishti(открытый исходный код)-Бесплатное программное обеспечение
EDTASigmaED2SSДля деминерализации
Fiji/ImageJ программное обеспечение(открытый исходный код)-Бесплатное программное обеспечение
GlycineNZYtechMB01401Для иммунофлюоресценции
программное обеспечение HuygensScientific Volume Imaging-Commerialпрограммное средство
HyClone определено фетальная бычья сывороткаGE Healthcare#HYCLSH30070.03Для визуализации в реальном времени
раствор перекиси водорода 30 %Milipore1085971000Для очистки
программного обеспечения ImarisBitplane / Oxford instruments-Коммерческое программное обеспечение
iSpacersSunJin Lab(варьируется)Использовать в качестве спейсеров для препаратов
L-глутаминаGibco#25030– 024Для носителя с
низким содержанием глюкозы DMEMGibco11054020Для носителя с живым изображением
M2 SigmaM7167Для препарирования эмбрионов
МетанолVWRVWRC20847.307Для этапов обезвоживания и регидратации
МетилсалицилатSigmaM6752Используется для очистки эмбрионов
ПараформальдегидSigmaP6148Используется в растворе для фиксации эмбрионов
Пенициллин-стрептомицинSigma#P0781Для живой среды
визуализации PBS (Фосфатно-солевой буферный раствор)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52Используется для очистки эмбрионов
Secure-Sea гибридизационные камерыSigmaC5474Используется в качестве спейсеров для
препараты simLab программное обеспечениеSimLabsoft-Коммерческое программное обеспечение инструмент
Слайд, углубление вогнутого стекла - 75х25 мм(любое)-Для крепления толстых эмбрионов.
Triton X-100SigmaT8787Для иммунофлюоресценции
Покровное стекло

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

Related Articles